Summary
Transgene Mäuse, oder virale Vektoren verwendet, um Protein-Expression in der Lunge verbessern. Allerdings sind diese Techniken zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und haben Off-Target-Effekte, die Ergebnisse verwechseln kann. Unser Protein Transfektionsprotokoll verwendet eine Lipidbasis Transfektionsreagenz und einer ultrafeinen Feinzerstäuber gleichmäßig liefern aktives Protein zu Lungenzellen.
Abstract
Zunehmende Proteinexpression ermöglicht es Forschern, besser zu verstehen, die funktionelle Rolle dieses Proteins bei der Regulation biologischer Prozesse Taste 1. In der Lunge wurde dies typischerweise durch genetische Ansätze transgenen Mäusen 2,3 oder virale oder nicht-virale Vektoren, die Protein-Ebene über eine erhöhte Genexpression 4 erhöhen nutzen erreicht. Transgene Mäuse sind teuer und zeitaufwendig zu erzeugen und die zufällige Insertion eines Transgens oder chronischen Genexpression normale Entwicklung der Lunge zu ändern und so die Nutzbarkeit des Modells 5. Während bedingten transgenics abzuwenden Probleme mit chronischer Genexpression 6 der reversen Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator (rtTA)-Mäuse, die zur bedingten Ausdruck erzeugen zugeordnet sind, zu entwickeln spontanes Zwischenraumvergrößerung 7. Wie bei transgenen, ist die Verwendung von viralen und nicht-viralen Vektoren teuer 8 und Dosis-d provozierenependent Entzündungsreaktionen dass verwirren Ergebnisse 9 und 10 behindern Ausdruck. Darüber hinaus sind die Wirksamkeit von wiederholten Dosen durch verstärkte Immunantwort auf den Vektor 11,12 begrenzt. Forscher entwickeln Adeno-assoziierter viraler (AAV) Vektoren, die weniger Entzündung zu provozieren und mehr Ausdruck in der Lunge 13.
Mit β-Galactosidase, präsentieren wir eine Methode zur schnellen und effektiv erhöht Proteinexpression in der Lunge über eine direkte Protein Transfektionstechnik. Dieses Protokoll mischt eine feste Menge an gereinigtem Protein mit 20 ul einer Lipid-basierte Transfektionsreagenz (Pro-Ject, Pierce Bio), um das Eindringen in das Lungengewebe selbst zu ermöglichen. Die liposomale Proteinmischung wird anschließend in den Lungen der Mäuse über die Luftröhre mit einem Microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA) injiziert. Die Feinzerstäuber erzeugt eine feine Wolke aus flüssigen Aerosol in den Lungen. Mit Hilfe der Technikwir haben eine gleichmäßige Abscheidung des injizierten Proteins während der Atemwege und die Alveolen von Mäusen 14 demonstriert. Das Lipid Transfektion Technik ermöglicht die Verwendung einer kleinen Menge an Protein zu erzielen. Dies begrenzt die entzündliche Reaktion, die ansonsten durch hohe Protein Verabreichung hervorgerufen würde. In der Tat, mit dieser Technik, die wir veröffentlicht, dass wir in der Lage, deutlich zu erhöhen PP2A Aktivität in der Lunge, ohne die Lungenspülung Zellularität 15 waren. Lungenspülung Zellularität genommen 24 Stunden nach der Belastung war vergleichbar mit Kontrollen (27 ± 4 Kontrolle vs 31 ± 5 Albumin transfizierten; N = 6 pro Gruppe). Außerdem erhöht es Protein-Ebene ohne eine Lunge entwicklungsbedingten Veränderungen oder Änderungen an der Architektur, die in transgenen Modellen auftreten können. Jedoch kann die Notwendigkeit einer wiederholten Verabreichungen machen diese Technik weniger günstig für Studien, die die Auswirkungen einer langfristigen Erhöhung der Proteinexpression. Dies würde besonders tru seine für Proteine mit kurzen Halbwertszeiten.
Protocol
1. Herstellung von Protein-Transfektionsreagenz
- Lösen Sie die Pro-Ject Reagenz durch Zugabe von 250 ul Methanol oder Chloroform zu dem Röhrchen mit dem trockenen Film.
- Vortex für 10-20 sec bei Höchstgeschwindigkeit.
- Je 20 ul Pro-Ject Reagenz in separaten Reaktionsgefäßen.
- Verdampft das Lösungsmittel, indem die Reaktionsgefäße mit dem Pro-Ject Reagenz unter einer Laminar-Flow-Haube für mindestens 6 h bei Raumtemperatur. Es muss vollständig trocken sein. Alternativ trocknen die Pro-Ject Reagens unter Verwendung einer Vakuum getrocknet.
- Bewahren Sie die Röhrchen bei -20 ° C. Sie sind gut für ein Jahr bei dieser Temperatur.
2. Hinzufügen Protein zu Pro-Ject Reagenz
- Je 50 ul PBS, enthaltend 2,0 ug des Proteins von Interesse, in ein Röhrchen mit 20 ul getrockneten Pro-Ject Transfektionsreagenz.
- Nach Zugabe des Proteins, mischen Sie die Lösung durch Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit foder 3-5 sec, gefolgt von Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
3. Intratracheale Verwaltung von Protein
- Anesthetize Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg und 10 mg / kg).
- Nach Sedierung erreicht ist, werden die Mäuse aus ihren oberen Schneidezähne mit einem speziell entwickelten Plattform (Abbildung 1) suspendiert.
- Mit einer Pinzette und einer Büroklammer nach einem Laryngoskop wird die Oropharynx geöffnet, so daß der Katheter eingeführt werden kann (Abb. 2). Die Stimmbänder sind visualisiert, indem eine Lichtquelle gegen die Luftröhre der Maus.
- Das Protein / Projekt Reagenzmischung (50 ul) wird durch die Luftröhre mit einer Penn Century Microsprayer injiziert.
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Representative Results
Um die Wirksamkeit unserer Technik demonstrieren verwendeten wir eine Feinzerstäuber (Penn Jahrhundert), um die Luftröhre von Mäusen mit 2 ug Maus Albumin (Sigma) in 50 ul PBS, das 20 ul Pro-Ject Transfektionsreagenz enthielt, gelöst zu injizieren. Die Albumin behandelten Mäusen mit Mäusen, die in gleicher Weise mit 2 ug beta-Galaktosidase-Proteins (Pierce Bio) behandelt wurden, verglichen. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse getötet und die Lungen wurden für die histologische Analyse verarbeitet. Immunhistochemie für beta-Galactosidase wurde mit Formalin fixierten Lungengewebe Abschnitte von dem Albumin und beta-Galactosidase-behandelten Mäusen durchgeführt. Selbst 24 Stunden nach der Transfektion von Proteinen, wiesen wir eine intensive Färbung innerhalb der Atemwege (große Pfeile) der beta-Galactosidase-behandelten Mäusen nicht aber die Albumin behandelten Mäusen (3A und 3B).
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Abbildung 1. Um die Mäuse für die intratracheale Injektion Position war ein Holz-Plattform aufgebaut, dass eine Rampe in einem 45 ° Winkel von der Basis 16. Die Mäuse aus ihren Schneidezähne durch einen Metalldraht, der zwei Metallhaken an der Spitze befestigt ist suspendiert die Rampe. Die Zunge wird vorsichtig mit einer Pinzette und Büroklammer Laryngoskop verwendet wird, um die Atemwege offen positioniert.
Abbildung 2. Nach der Platzierung einer Lichtquelle auf den Hals, kann der Kehlkopf visualisiert werden für intratrachealen Injektion 16.
Abbildung 3. β-Galactosidase Immunofärbungen wurden auf 4 um Lunge von Mäusen intratracheal mit 2 ug injiziert durchgeführtAlbumin (A) oder β-Galactosidase (B). Pfeile zeigen β-Galactosidase-Färbung innerhalb Atemwege. Bilder sind bei 40-facher Vergrößerung. Maßstab bar = 100 um.
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Discussion
Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden ist, dass sie in Protein-Spiegel erhöht und die Aktivität im Lungengewebe selbst erzeugt. Darüber hinaus dringt zu den distalen Bereichen der Lunge zu bleiben nur innerhalb der Atemwege gegenüber. Wir haben erhöhte Protein-Aktivität unserer Injektat auch nach lavaging der Atemwege mit einer Salzlösung 15 gemessen. Tissue Aktivität Analysen zeigen, dass das Protein in Zellen gelangen und nicht nur in den Lufträumen der Maus bleiben. Dies wurde durch Immunhistochemie zeigt diffuse Färbung der injizierten Proteins in den Alveolen und Atemwege der Maus (3) bestätigt. Wichtig ist, dass dieses Protokoll nicht provozieren Lungenentzündung oder Protease Ausdruck. So können alle Änderungen, die auftreten, zu tun, um die Auswirkungen der verabreichten Protein zugeschrieben werden. Das Fehlen von entzündlichen Reaktion ermöglicht die Verwendung von wiederholten Injektionen Wirkungen über einen Longe prüfenr Zeitraum.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (7R01HL098528-03) und FAMRI Clinical Innovator Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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