Summary
実験デザインは、ここでアポトーシスと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドのアプリケーションでのアルコール曝露の影響を勉強に集中を提案した。育種から胎児の脳のコレクションへの詳細な説明が記載されている。アポトーシスを測定するための技術も詳細に説明する。
Abstract
胎児の脳の成長の初期胚の段階で出生前のアルコール暴露の影響を調査するための実験的なデザインが挑戦しています。これは主に胎児の脳の顕微解剖の難しさとアルコールへの出生前暴露により引き起こされるアポトーシス細胞の決定のためにそれらの切片によるものです。実験では、胎児の脳組織における細胞死の同定に繁殖マウスから可視化技術を提供ここで説明する。この研究は、C57BL /胎児のアルコール暴露とアルコール誘発性アポトーシスに対する栄養ペプチドの役割を研究するための動物モデルとして6マウスを使用していました。繁殖は、胚の年齢の正確な段階を決定するために、2時間マットウィンドウで構成されています。確立された胎児のアルコール暴露モデルは、胎児の脳における出生前のアルコール暴露の影響を決定するために、この研究で使用されている。これは、妊娠マウスのために栄養素の唯一の供給源としてアルコールやペアフィード流動食への無料アクセスが含まれます。
アポトーシスを調べるために、胎児の脳を第ビブラトーム切片装置との剥離を容易にするために、離れて金型を用いて、ゼラチンに埋め込まれている。パラホルムアルデヒドに埋め込まれ、固定された胎児の脳を容易に区画され、遊離浮遊切片は、アポトーシスまたは細胞死の決定のためsuperfrostプラススライドに装着することができる。
TUNEL（TdTを媒介性dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）アッセイは、細胞死またはアポトーシス細胞を同定するために使用されている。これは、APのことは注目に値するoptosisおよび細胞媒介性細胞傷害性は、DNAの断片化によって特徴付けられる。したがって、可視TUNEL陽性細胞は、細胞死またはアポトーシス細胞を示す。
ここで実験的なデザインは、アルコールと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドの役割の効果を研究するための確立された流動食の使用に関する情報を提供します。これは、繁殖と妊娠マウスを供給する、胎児の脳をmicrodissecting、およびアポトーシスを決定することを含む。一緒に、これらのビジュアルとテキスト技術は胎児の脳中の有害物質の胎児期曝露を調査するための源であるかもしれません。
Introduction
ここに記載の実験方法の目的は、摂食microdissecting、及び細胞死を検出し、繁殖を含むいくつかの技法を用いて胎児のアルコール暴露モデルにおいて栄養ペプチドの神経保護効果を評価することである。我々の研究室からの仕事は1-5消費アルコールの量の長期的に人間の飲用パラダイムのようになります適度な飲酒のモデルとしてアルコールと混合された流動食を必要としてきた。我々と他の人が胎児のアルコール暴露の有害な影響に対して神経保護の3つのペプチド誘導体を同定した。動物モデルを用いた胚の段階でアルコール暴露を調査研究は、神経保護潜在的なメカニズムの同定につながり、介入手順の開発を可能にすることができる。これは、妊娠中のアルコール暴露の有害な影響の神経保護効果及び減衰に関する十分な情報を提供することができる。
出生前のアルコール暴露の影響の可能性の予防は、in vitro 6,7 で神経保護およびin vivo 1,2,4,8,9 に関与することが示されているペプチドで妊娠マウスの治療を含むことができる。これらのペプチドのうち、ADNF-9またはSALとして知らSALLRSIPAは、活動依存神経栄養因子（ADNF）7,10から派生しています。活動依存神経保護タンパク質（ADNP）6,11、由来の配列NAPVSIPQペプチドと呼ばれるNAPのもう一つのペプチドは、アルコール暴露12,13に関連付けられている酸化ストレスに対する強力な保護効果を示した。また、最近、胎児のアルコール暴露モデル2における重要な神経保護の役割を果たすと思われる新規合成したペプチド、colivelinを同定した。 ColivelinはADNF-9とAGA-（C8R）HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）で構成されています。これらのペプチドの使用の重要性は、それらの能力を有することであるアルコール誘発性アポトーシスおよび脳の成長欠損の影響を防ぐために、血液脳関門を通過する。
実験方法は、アルコール誘発性アポトーシスに対する神経保護効果をテストするためにC57BL / 6マウスを使用していました。我々はそれが精子プラグと膣スメア1-5の検出により明らかにすることができるように正確に、胚の日を0（E0）を推定するために、代わりに一晩の繁殖の2時間窓を採用しています。これはフリーアクセスの代わりに妊娠したマウスにストレスを誘導することが強制経口経路を通じてアルコールの配信と考えられているように我々は、栄養チューブで流動食を使用している。一方、マイクロダイセクションは、初期胚の段階で胎児の脳を解剖したときに発生することがあり胎児の脳組織の柔らかさに起因して挑戦することができます。ここでは、マイクロダイセクションを含むすべての課題に対処するための可視化手法を示す。さらに、胎児の脳切片にも挑戦することができますので、我々は採用しているゼラチン埋め込むピールアウェイ用いた金型で胎児の脳を埋め込む伴う手法。私たちは、50ミクロンの厚さで自由に浮遊セクションで胎児の脳の切断に成功している。これは、私たちは、細胞死の識別を含む、胎児の脳切片におけるコンテンツタンパク質の任意の変化を調べることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。動物繁殖と食物連鎖ペプチドトリートメント
- 2時間男性のホームケージに雌マウス（〜6週齢、平均体重20グラム）を配置することにより品種C57BL/mice。
- 直後に精子プラグおよび/または膣スメアをチェック。
- 正の場合は、胎生0（E0）、この時点を指定する。
- 3）、1）アルコール（エタノール）液体食群（ALC）、2）ペアフィード対照群（PF）：E7に最近4説明したように、制御、治療群（3群）に重量マッチ妊娠雌が割り当てられているアルコール暴露流動食（ALC/ADNF-9）と一緒ADNF-9ペプチドの腹腔内（IP）注射を受けるべきであるペプチド治療群、。 ALCとPF食事の準備の詳細と腹腔内注射の手順は、我々の最近の仕事の4で見つけることができます。
- 栄養素の唯一の供給源としての自由なアクセスとして提供することができる毎日のアルコール液体食を測定します。 T個別に結ばPF流動食OはALCダムも同様に毎日測定することができます。
- 前の24時間の間に消費流動食の量を30 mlのがスクリューキャップチューブを卒業し、作りたての食事はE7からE13まで毎日提供されるべきであるから、記録することができます。
2。胎児と胎児の脳の顕微解剖の解剖
- 深く頸椎脱臼に続いてCO 2の手順でマウスを安楽死でE13に妊娠マウスを生け贄に捧げる。
- 70％エタノールで切開の腹部サイトを清掃します。
- 滅菌はさみやピンセットを使って腹部切開を行います。
- 腹部が開いたら、1鉗子でそれを保持していると離れて子宮から子宮間膜を引き裂くために他の鉗子を使用して子宮を解剖する。胚を穿刺避けるために徐々に、この手順を行うことを確認してください。
- 子宮から胚を取り出し、ハンクス平衡塩溶液を含む細胞培養ディッシュ（60ミリメートル×15ミリメートル）にそれらを移す （HBSS）氷冷水た。
- 顕微解剖のために実体顕微鏡下に全体の胚から胎児の脳を解剖。
- マイクロダイセクション用超微細鉗子を使用して、頭蓋骨を露出するために頭の上部分に胚の皮膚をやってのける。
- 一度頭蓋骨が露出していると明らかにその後脊髄と脳幹領域における脳の後部から始まる頭蓋骨はがし、顕微解剖の実体顕微鏡下で可視化。
- 後方から頭の前方部分に作品によって頭蓋骨片を剥離することを確認してください。
- 胎児の脳を視覚的にさらされると、それらの抽出を続行します。
- 原基嗅球のベースから後脳のベースに胎児の脳を解剖。
- Postfixはすべて2〜3日のために4％パラホルムアルデヒド中で胎児の脳を解剖した。あなたがウェスタンブロット法または酵素アッセイのためにそれらをテストしている場合にも、それぞれのダムからの他の胎児の脳を凍結することができます。
3。セクショニング用ゼラチンで胎児の頭脳を埋め込む
- ゼラチングレードAの10％を準備
- 途中ピールアウェイ埋め込み金型を記入し、ゼラチン固化するまで待ちます。
- 固化したゼラチンの上に置きコントロールおよび出生前治療胎児の脳のサイド·バイ·サイド。これは、対照群と実験群の両方との間に細胞死の免疫検出の一貫した状態を保つことである。
- （ゼラチンが高すぎないことを確認してください）完全な金型を作るために胎児の脳の上にゼラチン液を追加します。
- 15分間の胎児の脳を保持している準備ゼラチン金型を冷蔵。
- はがす2日間の4％パラホルムアルデヒドに既製ゼラチン含む胎児の脳を転送し、プラスチックと埋め込み型。
- 冠状切片用に厚さ50μmでビブラトーム切片マシン（ライカVT 1000S）を使用して、ゼラチンでプレイスとセクション固定胎児の脳。それは良いの解剖学的特徴を提供しますので、この厚さは我々の研究でテストされる。また、25μmの厚さと高も10％のゼラチンで胎児の脳の埋め込み含むこのテクニックを使用してテストすることができます。冠状セクションは前脳の大脳基底核隆起レベルでビブラトームを使用してカットされたことに注意してください
- リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中の胎児の脳切片を収集する。
- Superfrostプラス水中でスライドで胎児の脳切片をマウントします。
- 15分間取り付けられたセクションを乾かします。
- TUNEL反応の翌日のテストのためにPBSでスライドを（胎児の脳切片搭載）に置きます。
4。デためのTUNEL反応細胞死またはアポトーシスの護
（TUNEL：TdTを媒介dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）。このアッセイは、細胞死を決定することを目的とする。
- 37°C（20ミリリットルPBSで混合プロテイナーゼKを300μl）で5分間プロテイナーゼK（20μgの/ ml）でSuperfrostプラススライドに搭載された胎児の脳切片を扱う。スライドは）5 Plendオープンマイレで組み立てられる。
- オービタルシェーカーで5分間PBS三回と胎児の脳切片を（スライドにマウント）すすいでください。
- 3％、室温で10分（3ミリリットル30％27中のH 2 O 2ミリリットル、100％メタノール）（スライドはシェーカーすべきではありません）のためにメタノール中のH 2 O 2とセクションをインキュベートする。
- オービタルシェーカーで5分間PBS三回でセクションをすすぐ。
- 氷上で2分間（4℃）（100μlのトリトンX + 0.1グラムのクエン酸ナトリウム+ 99.9ミリリットルdistilleための透過性付与溶液のセクション（0.1％、0.1％クエン酸ナトリウムでトリトンX-100）をインキュベートdは水）。
- オービタルシェーカーで5分間PBS中のセクションを2回すすいでください。
- スライド内のセクションの周りの乾燥した場所。
- PAPのペンを使用してSuperfrostプラススライド上の障壁を描画。これは、任意のTUNEL陽性細胞の検出のためのセクションを治療するために使用される溶液の漏れを防止することを目的としている。
- 37℃で1時間、TUNEL反応混合物（ボトル1から50μlを、ボトル2〜450μl）を°Cを持つセクションをインキュベートし、制御がボトル2からの溶液中でのインキュベーションによって使用される。
- PBS三回軌道シェーカーで5分で洗い流してください。
- 組織の周りの乾燥した場所。
- 37℃で30分のためにコンバータ-PODでセクションをインキュベート
- トリス塩酸（pHは7.5、0.05 M）との5分間のセクションを三回すすいでください。
- 0.05％の3'-3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB）及び0.003％H 2 O 2（25ミリリットルトリス塩酸、pH7.5中、0.05 M +25μlを3％H 2 O 2 + 500で7分間のセクションをインキュベートμlのDAB）4℃（氷）と暗闇の中で（新しい5 Plendオープンメーラーにこのプロシージャを行うことを確認してください）でOribtalシェーカー下。
- PBS三回オービタルシェーカーで5分でセクションをすすぐ。
- PBS中では24以上の時間PBSでスライド·セクションを維持し、次節プロトコルで詳細としてニッスル染色のためにそれらを処理します。
注意：DABは発がん性物質である。手袋を使用して、一度にすべての実験が終了し漂白剤で使用するすべての料理をきれいに。
5。顕微鏡観察のための胎児の脳切片の調製のためのニッスル染色
- ニッスル染色法は、生物学的安全フード内で行われるべきである。
- 2分間脱イオン水でスライドセクションをすすぐ。
- 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。
- 6分間95％エタノールのセクションをインキュベートする。
- 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。
- 脱ワットのセクションをすすぐ2分間えー。
- 3分間ステインクレシルバイオレットのセクションをインキュベートする。
- 2分間脱イオン水のセクションをすすぐ。
- 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。
- 95％エタノールで切片+ 3分間3ミリリットルの氷酢酸をインキュベートする。
- 2分間95％エタノールで切片をインキュベートする。
- 2分3回、100％エタノールのセクションをインキュベートする。
- 10分3回キシレンのセクションをインキュベートする。
- 胎児の脳切片を保持するスライドをパーマウントとカバースリップガラススライドを用いて実装することができる。
- マウントは、顕微鏡観察や分析の前に一晩スライドしたままにしておきます。
- 顕微鏡観察と顕微鏡写真はライカ正立顕微鏡下で行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
実験方法は、2時間の繁殖ウィンドウは正確な妊娠段階を推定することが不可欠であることを示しているここで説明する。我々はE13歳で胚の解剖を示した。また、E13で胎児の脳の顕微解剖を示した。 図1に記載の手順は、いくつかの段階を（交流）を含む。胎児の脳原基嗅球のベースから後脳のベース（ 図1）に解剖されています。胎児の脳を、次に免疫化学的検出のための4％パラホルムアルデヒドで固定されている。固定後、胎児の脳を、10％ゼラチン中に埋め込 まれ、 図2で説明したようにビブラトーム切片を用意しました。胎児の脳のステップ·バイ·ステップの埋め込みを低倍率で行ったことに留意されたい。埋め込 まれた胎児の脳を、図1の高倍率で可視化することができる。また、前脳で神経節隆起のレベルで冠状胎児の脳切片ができますビブラトームを用いて得られた免疫組織化学的検出のためのスライドにマウントされる。これは、TUNEL-陽性細胞（ 図3）の数を含む。私たちは、出生前のアルコール暴露は、PF、対照群（ 図3a）と比較して、神経節隆起（図3b）におけるTUNEL陽性細胞の増加を誘導することをここに示している。 ADNF-9投与により著しくALC群に比べTUNEL陽性細胞（ 図3c及び3d）のアルコール誘発性の増加を減少させた。
図1。 E13での胎児の脳の顕微解剖。ステージ交流ショーステップバイステップの手順の胚から解剖胎児の脳に。）解剖コントロール（PF）とアルコール（ALC）胚出生前に暴露した。B） 。c）は PFとALCグループの胎児の脳を解剖。
図2。切片のために胎児の脳を埋め込 む方法。ステージビブラトーム切断のためのオブジェクトでゼラチンブロックの設定に胎児の脳の埋め込 み準備から（AE）ショーのステップバイステップの手順について説明します。）いっぱいピールアウェイ埋め込 み型半ゼラチンと、b）PF制御及びALCグループから胎児の脳を金型内に並べて配置し、ゼラチンで被覆されていると、c）ピールアウェイ四辺で切断金型を埋め込 むステップと、d）胎児の脳をゼラチンおよび準備に埋め込 まパラホルムアルデヒドで固定する; e）の GEが胎児の脳を含むラテン型はビブラトーム切片のオブジェクトに配置されます。
図3。 PF基（）と比較してALC基（b）の中の矢印で示すように、E13段階で神経節隆起のTUNELアッセイを用いてアルコール誘導性アポトーシスに対する神経ペプチド、ADNF-9の効果は、出生前のアルコール暴露は、細胞死の増加を誘発した。出生前のアルコール暴露と一緒ADNF-9政権はTUNEL陽性細胞（C）の減少を示した。統計分析はADNF-9政権はTUNEL陽性細胞（d）の中でアルコール誘発増加を妨げていることを実証した。値は平均±SEMとして示されています。 * P <0.05、** P <0.01（ニューマン - Keulの事後検定）。各グループのN = 4。スケールバー=100μmである。エルからの許可を得て、出版物（4）から転載サビー（ライセンス＃2904310752995）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究で提示方法論と技術は出生前の胎児の脳のアルコールへの暴露とこれらの効果の予防に栄養ペプチドの役割の効果を実証する。これらは別の妊娠段階で胎児の脳で虐待や他の有毒化学物質の他の薬剤を研究する方法についての情報を提供することができる。
繁殖パラダイムに関しては、いくつかのケースでは精子プラグの検出が観察されないことがあります。この時点で、可能な精子正の検出を提供することができる顕微鏡観察下のスライドで膣スミアをテストすることが重要である。
これは、給餌がPF制御とアルコールを含む流動食の無料アクセスを含むことを本研究で述べられている。少なくとも30％の湿度と22〜24℃を超えない温度食餌C 1,2に対して24時間のフリーアクセス時の食の品質を監視する必要がある。また、必要とされる食事は毎日新しく調製する。栄養チューブは、各使用後に洗浄されるべきである。
胎児の脳の顕微解剖の難しさがあります。これらは、テストした胚の段階に依存します。例えば、E13歳で解剖胎児の脳はE18で解剖胎児の脳と比較して対処することは困難である。これはE18で、胎児の脳がよく発達しており、頭蓋骨は頭蓋骨をやってのけることはまだ柔らかく、困難でありE13に比べやってのけることが容易になるという事実に起因している。この時点では、E13での胎児の脳を解剖したときに、この原稿に付属のビデオで示したように頭蓋骨ピース·バイ·ピースをやってのけることが重要です。
ゼラチンで胎児の脳を埋め込むに関しては、これは免疫組織化学的分析のために使用される準備ができているセクションを取得するための最良の技術であることがわかった。胎児脳の良好な切断を得るためには、重要であるの4％パラホルムアルデヒドで固定胎児の脳を含むゼラチンブロックは完了です。したがって、これは、少なくとも2日かかる場合があります、そしてゼラチンブロックは三日目で切断するための準備ができているかもしれません。切片の厚さも因子であり、50μmの厚さは、通常、TUNELアッセイ1,2,4などの免疫化学的検出のために試験される。しかし、25μmの厚さと高もテストすることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
いいえ開示は行われませんように。
Acknowledgments
この研究プロジェクトは、アルコール乱用やアルコール依存症、国立研究所から受賞番号R21AA017735（YS）によってサポートされていました。内容は、執筆者の個人的責任であり、必ずしもアルコール乱用やアルコール依存症や国立衛生研究所、国立研究所の公式見解を表すものではありません。筆者もこの原稿を編集するためのチャリシーモンゴメリに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
