Summary
Een kneuzing model van ernstige dwarslaesie wordt beschreven. Gedetailleerde preoperatieve, operatieve en post-operatieve stappen worden beschreven om een consistent model te verkrijgen.
Abstract
De translationele potentieel van nieuwe behandelingen moeten worden onderzocht in ernstige dwarslaesie (SCI) contusie modellen. Een gedetailleerde methodologie wordt beschreven om een consistent model van ernstige SCI verkrijgen. Gebruik van een stereotactische frame en computergestuurde impactor zorgt voor creatie van reproduceerbare letsel. Onderkoeling en urineweginfectie vormen belangrijke uitdagingen in de post-operatieve periode. Zorgvuldige controle van de dieren met dagelijkse gewicht opnemen en blaas expressie zorgt voor vroege opsporing van postoperatieve complicaties. De functionele resultaten van deze contusie model zijn gelijk aan transection modellen. De contusie model kan worden gebruikt om de effectiviteit van zowel neuroprotectief neuroregeneratieve mogelijkheden te evalueren.
Introduction
Keuze van de juiste blessure model is cruciaal voor preklinische evaluatie van nieuwe behandelingen voor ruggenmergletsel (SCI). 1,2,13 In een recent onderzoek van artsen en wetenschappers op het gebied van neurotrauma kneuzing model, in tegenstelling tot hemisectie of volledige doorsnijding modellen werd algemeen aanvaard klinisch relevant. 8 Dit advies is gebaseerd op de waarneming dat de meerderheid van ruggenmergletsel in mensen contusive karakter. 10 The biology of kneuzingen blijkt ook verschillend van hemisectie of doorsnijding modellen zijn. Iseda 11, et al. vergeleek het effect van chondroïtinase ABC intraspinale injectie op neuroregeneratie afzonderlijk hemisectie en kneuzing modellen. 4 axonale regeneratie werd waargenomen in de neuronale brug hemisectie maar niet contusie SCI groep. De hemisectie of volledige doorsnijding modellen ook voorwaarden bekend dat er slechts een zeer klein deel van cl creëreninical omstandigheden. Zo hebben verscheidene onderzoekers scaffold-interventies gebruikt voor implantatie in de laesie holte na hemisectie of volledige doorsnijding om regeneratie te bevorderen. 6 Deze benadering wordt klinisch relevant, aangezien vorming van een holte binnen ruggemerg onpraktisch en waarschijnlijk onethisch.
Variabiliteit in functioneel herstel blijft een grote uitdaging voor de kneuzing modellen. 5,12 Deze variabiliteit kan worden geminimaliseerd door het gebruik van computer-gestuurde impactor en stabilisatie van de wervelkolom voor de botsing voor uniforme kracht levering in heel het ruggenmerg volume vooral het ventraal gelegen motor trajecten . Opgemerkt moet worden dat de plasticiteit en zekerheden bijdrage van overleven axonen is het overheersende mechanisme van herstel na een dwarslaesie. 1 Daarom, zelfs kleine variaties in kneuzing techniek kan significant verschillende resultaten opleveren. Daartoe hebben we ontwikkeldeen model van ernstige dwarslaesie die in overeenstemming kneuzing volume en functioneel herstel vergelijkbaar met doorsnijding modellen levert. Dit model kan worden gebruikt voor het onderzoeken van zowel de neuroprotection en neuroregeneratie strategieën als een proof of concept voor de werkzaamheid van de behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding Voordat Spinal Cord Injury
De chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze procedure zijn scalpel, pickups met en zonder tanden, hemostats, zelf behoud retractors, fijne punt rongeurs, naald bestuurder, absorbeerbare hechtingen, en de huid clip applicators. Andere chirurgische benodigdheden zijn operatiedoeken, steriele lakens voor chirurgische veld, gaas sponzen, katoen-tip applicators, en metaalfolie. Autoclaaf de chirurgische instrumenten en benodigdheden voor chirurgie. Gebruik de individuele set van instrumenten en benodigdheden voor een dier. Reinig het chirurgische gebied en toestellen (impactor, lichtbron, stereotactische frame, glas kraal sterilisatoren, en verwarming pads) met alcohol doekjes.
Open de chirurgische doeken en gebruik steriele handschoenen aan het chirurgische veld zorgvuldig vermijden van contaminatie draperen. Open de individuele instrumenten steriel en zorgvuldig plaats die in het chirurgische gebied. Bedek de knoppen en handgrepen van the inrichting waarschijnlijk nodig tijdens de procedure met steriel metaalfolie. Schakelaar-op het glas kraal sterilisator tot klaar voor gebruik tijdens de procedure.
2. Voorbereiding van de dieren
Breng de ratten naar het laboratorium gebied paar uur vóór de eigenlijke procedure. Dien pijnstillers ten minste een uur vóór de verwachte procedure (meestal buprinorphine 1,5 ml 0,006 mg / ml subcutaan). Dien preoperatieve antibiotica (gewoonlijk Baytril 4 mg / kg subcutaan). Verdoven van de ratten met 90 mg / kg ketamine en wacht totdat er geen teen-snuifje respons. Palperen de meest prominente doornuitsteeksel in de thoracale wervelkolom. Dit niveau komt in principe overeen met T10 doornuitsteeksels proces. Markeer de locatie van de beoogde niveau met betrekking tot T10. In ons lab voeren we een T10 blessure. Het volgende verhaal beschrijft de techniek van T10 SCI. Shave a 3 cm x 6 cm rechthoek lengterichting en gecentreerd op T10 niveau. Reinig de huid drie keer with Betadine oplossing. Solliciteer oogheelkundige smeermiddel op elk oog. Breng de rat in een comfortabele positie om het chirurgische veld daarbij vermijdt verontreiniging. Plaats een rectale temperatuursensor de kerntemperatuur controleren en verwarming instelt aan de dieren temperatuur te houden zo normaal (~ 37,5 ° C) mogelijk. Bedek de rat met een chirurgische doek met een raam boven de operatieplaats.
3. Chirurgische Procedure
Beginnen met een geschatte 4 cm incisie met behulp van een # 10 blade gecentreerd op de T10 merk. Overgaan tot geduldig ontleden fascia en spieren lagen weg van de T9-T11 doornuitsteeksels en laminaten. Plaats retractors om spier-en fascia trekken weg van het bot. Te stabiliseren de doornuitsteeksels proces van T9 fors verdelen de interspinale ligament tussen T9 en T10 met behulp van fijne schaar. Zo ook het stabiliseren van de T10 doornuitsteeksels proces en verdeel de interspinale ligament tussen T10-T11. Gebruik lus vergroting om een aanvullingte de verdeling van ligamenten helemaal door het ligamentum flavum (figuur 1). De thecal sac is direct duidelijk zodra het ligamentum flavum is losgekoppeld. Gebruik fijne punt rongeurs om zorgvuldig uit te voeren stuk-maaltijd laminectomie bilateraal op T10. Uiterste zorg is genomen om een neerwaartse druk op de thecal sac en onopzettelijk letsel door de rongeur tips te vermijden. De lamina en de doornuitsteeksels proces van de T10 wordt volledig verwijderd.
Verplaats het dier in positie op stabilisatieplatform. Gebruik stabiliseren klemmen om de wervelkolom te immobiliseren door klemmen de laterale aspecten van het T11 wervellichaam gevolgd door de laterale aspecten van het T9 wervellichaam. Wees voorzichtig dat u de rat comprimeren in het platform met de stabiliserende klemmen als dit zou ruimte voor ademhalings-bewegingen te beperken en voeg ongewenste belasting van het dier. Na het veiligstellen van de wervelkolom instellingen op de computer-gestuurde impactor worden gecontroleerd. Wij gebruiken meestal de impactor topje van 3,0 mm bij een spBehoefte van 4 cm / s met een diepte van 2 mm en een verblijftijd van 0,3 sec. Verleng de impactor tip en laat het tot het net raakt het snoer oppervlak. Trek de tip en laat het apparaat 2 mm naar het ruggenmerg oppervlak. Loslaten zuiger bij 4 cm / sec tot ernstige kneuzing dwarslaesie veroorzaken. Bereiken hemostase met net genoeg druk om de katoen-tip applicator op zijn plaats te houden, zorg dat u geen onnodige druk op het snoer te creëren. Hechtdraad spieren en fascia lagen met een figuur-8 steek en let niet te trekken het te strak met absorbeerbare hechtingen. Sluit de huid met een minimum van 2 kleine nietjes tot 4 of 5 nietjes kunnen worden gebruikt als delen van de incisie open blijven na de eerste 2 of 3 nietjes.
3. Post-procedure Care
Plaats ratten in een warme omgeving van ongeveer 33-35 ° C gedurende 24 uur na de operatie. Dit houdt in een incubator (terwijl ze onbewust) en een verwarmde kooi ruimte zodra ze beginnen te bewegen. Zodra ratten volledig awake, toedienen 5 ml zoutoplossing, 1,5 ml (0,006 mg / ml) van buprinorphine, en 0,1 ml van Baytril alle subcutaan. Ga verder met buprinorphine subcutaan tweemaal per dag gedurende de eerste 24-48 uur en Baytril eenmaal per dag gedurende 7 dagen. Bladders handmatig moet drie keer per dag worden uitgedrukt tot terugkeer van blaasfunctie (<2 ml urine in de vroege ochtend expressie gedurende 3 opeenvolgende dagen). Dieren moeten ook in deze tijd voor infectie (bloed in de urine, witachtige kleur, of vieze geur) worden gecontroleerd, verminderde lichamelijke activiteit of problemen met wondgenezing. De besmetting moet worden tegengegaan met een verhoogde dosis (of opnieuw starten) van antibiotica in overleg met de lokale dierenartsen. Weeg ratten dagelijks beginnend op de dag na de operatie aan hun herstel te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laesie Volume
We hebben grote en consistente laesie volumes verkregen door de hierboven beschreven techniek. Met behulp van een Luxol snel blauwe kleuring een gemiddelde laesie volume van 2,04 mm 3 (95% BI 1,9-2,18) (n = 5 dieren) werd verkregen. Figuur 2 laat de gemiddelde laesie volume met een vertegenwoordiger kleuring met behulp Luxol snel blauw door de laesie epicentrum.
Functionele Scores
De gedrags scores gemeten door de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) schaal zijn weergegeven in figuur 3. Bij 12 weken van de ratten in de controle groep realiseerde een gemiddelde BBB score van 2,2 ± 1,1 (n = 10 dieren).
Andere parameters
Gebaseerd op onze meest recente ervaring met 32 dieren operaties de overlevingskans van deze techniek is 93,4%. Alle sterfte waren gerelateerd aan persisterende infectie van de urinewegen (UTI), gevolgd door het offeren van dieren te voorkomen overmatige pijn en lijden. Na het afronden van de cursus van antibiotica voor 7 dagen 16,7% dieren ontwikkelden UTI. Het gemiddelde aantal dagen voor de detectie van UTI postoperatieve 14,6 ± 7,6 dagen. Interessant is dat de dieren bereikte controle over de blaas op een gemiddelde 13 dagen na het letsel (gemiddeld 13,33 ± 3,6 dagen). Ratten die UTI ontwikkeld duurde langer blaas controle te bereiken vergeleken met de ratten zonder UTI (blaas controle bij ratten met UTI - 16 ± 1 dagen versus 12,8 ± 3,7 dagen voor de controle over de blaas in ratten zonder UTI, p = 0.03). In het cohort dat bereikte controle over de blaas binnen 14 dagen geen volgende UTI werd gedetecteerd. Zoals getoond in figuur 4, is er een aanvankelijke gewichtstoename na SCI waarschijnlijk van vochtretentie. Het gewicht daalde later en gestabiliseerd op een lager niveau (circa 10-12% lager dan de uitgangswaarde) in ongeveer 10 dagen.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Vertebrale anatomie van rat van de posterieure weg (links) aantonen van de doornuitsteeksels en laminae. Functie van ligamentum flavum (LF) wordt afgebeeld in de ruimte tussen de laminae. Mid-sagittale sectie (rechts) toont de relatieve positie van het ligamentum flavum en interspinale ligament ten opzichte van het ruggenmerg.
Figuur 2. Staafdiagram laesie volume (in mm 3, Y-as) bij dieren die ernstige ruggenmergletsel (links). Een representatieve langsdoorsnede door verwonding epicentrum na Luxol fast blue kleuring (rechts).
g3highres.jpg "/>
Figuur 3. Bedoel BBB (Y-as) score van de ratten in de loop van 3 maanden follow-up (X-as) aan te tonen minimale herstel typerend voor ernstige SCI.
Figuur 4. Lijn diagram dat variatie in de dagelijkse gewicht (in g, Y-as) van ratten gedurende 2 weken duur (X-as) na inductie van ruggenmergletsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verscheidene nieuwe behandelingen hebben onlangs aangetoond vroege belofte op het gebied van onderzoek SCI. 3 zorgvuldige evaluatie van deze behandelingen is essentieel klinisch relevant model van SCI strategieën selecteren met maximum translationele potentieel. Een schema van sortering werd onlangs ontwikkeld om de kracht van de preklinische studies te evalueren. 9 Deze regeling benadrukte het belang van het gebruik contusie model van ernstige SCI. Hier beschrijven we een dergelijk model contusie van ernstige SCI met consistente volumes laesie en functionele scores lijken op die van doorsnijding modellen. Dit model kan worden gebruikt als een 'proof of concept' voor werkzaamheid van de behandeling vast te stellen zowel voor neuroprotection en neuroregeneratie strategieën.
De generatie van uniforme contusive SCI blijft uitdagend. Voor reproduceerbaarheid, is het essentieel dat de schade zo gelijkmatig mogelijk worden uitgevoerd. De beoogde niveau van het ruggenmerg moeten consequent fr worden geïdentificeerdOM dier tot dier. Verwijdering van het bot tijdens laminectomie moeten zorgvuldig worden gedaan om ervoor te zorgen geen botfragmenten worden achtergelaten in het wervelkanaal, die zelfs compressie letsel veroorzaken en de invoering van ongewenste variaties in blessure mechanismen en recovery mogelijkheden. We hebben verschillende stappen om ervoor te zorgen uniformiteit waaronder de omvang van stijf botslichaam stabilisering van de wervelkolom op een frame met gemonteerde stabilisatoren aangenomen, met behulp van een uniforme botssnelheid en de diepte van impactie. Het is belangrijk dat de rat prettig passen bij de stabiliserende pincet geklemd de wervellichamen. Eventuele variaties in de ruggengraat of teveel stress tijdens de klemming kan de biomechanica van het effect veranderen. We gebruikten een 2,5 mm botslichaam aangezien de gemiddelde grootte van ratten ruggenmerg in onze regio plaats is 2.5-3 mm. De contacttijd of verblijftijd werd uniform vastgesteld op 0,3 sec in onze experimenten. Maar in onze waarneming en verslagen van andere laboratoria, voor een ernstige model van SCI de diepte van invloed is het meest crucialeparameter. In de in dit artikel beschreven experimenten is het effect toegevoegd bij een constante diepte van 2 mm. Andere factoren die van invloed uniformiteit onder de opleiding van personeel, duidelijke visualisatie van het weefsel, en impactor tip om direct effect te sorteren in het snoer weefsel (en niet de benige structuren).
De ratten moeten voortdurend worden geobserveerd tijdens de procedure voor de noodzakelijke vitale functies het belangrijkst kerntemperatuur en ademhaling. Onderkoeling is de belangrijkste oorzaak van sterfte tijdens en onmiddellijk na de anesthesie toediening. Bewaking van kerntemperatuur met rectale sonde en passende verwarming pads zal deze complicatie te voorkomen. Als de ademhaling onregelmatig is of het dier ophoudt te ademen, moet de procedure onmiddellijk te worden stopgezet totdat de ademhaling terugkeert naar de uitgangswaarde. Overmatige pijn en of onbedoelde overdosering van pijn en verdoving medicijnen kunnen ook leiden tot ademhalingsproblemen. De ratten na de procedure moet zorgvuldig worden gecontroleerd. Hun wachten moeten nauwkeurig worden gemeten en een verlies van> 20% van de uitgangswaarde gewicht moet een onderzoek naar voedsel-en wateropname, urineweginfectie, huidbeschadiging, post-SCI ileus, etc. Vroege overleg met het diergeneeskundig personeel voor de evaluatie en behandeling prompt is cruciaal in dergelijke situaties. Zoals eerder besproken, moet ratten die niet incontinentie herwonnen op dag 14 opnieuw worden gestart antibiotica een potentieel fatale urineweginfectie voorkomen.
Dwarslaesie kan worden geïnduceerd door ofwel een verplaatsing methode of constante kracht-methode. 5,12 De techniek beschreven in dit document is verplaatsing methode waarbij kracht om vaste diepte wordt geleverd binnen het ruggenmerg weefsel. Het gebruik van een computer-gestuurde impactor maakt een mate van controle die niet haalbaar door de andere gebruikelijke methodes experimentele SCI. De clip compressie techniek staat niet voor een botte, contusive kracht met onmiddellijke afgifte, terwijl de NYU invloedof afhankelijk van de zwaartekracht om de kracht van de kneuzing te bepalen. Dergelijke technieken, maar reproduceerbaar, niet toestaan dat de simulatie van omstandigheden die bij een auto-ongeluk motor, de meest voorkomende oorzaak van acute SCI bij de mens. Eerdere studies hebben aangetoond dat verwondingsstrengheid direct gecorreleerd met scherptediepte effect dan de snelheid van de botsing. 7 Daarom dit model maakt een ernstige SCI routinematig uitgevoerd met de potentie om de ernst wijzigen door meer combinatiemogelijkheden kracht en verplaatsing .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Financiële openbaarmaking none
Financiering openbaarmaking none.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar dat dr. N. Banik en dr. D. Mitchell voor hun begeleiding in de ontwikkeling van dit model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
