Summary
Un medio no invasivo para evaluar el éxito de trasplante de mioblastos se describe. El método se aprovecha de un gen de fusión informador unificada compuesta de genes cuya expresión se pueden obtener imágenes con diferentes modalidades de imágenes. Aquí, se hace uso de un
Abstract
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una grave enfermedad genética neuromuscular que afecta a 1 de cada 3.500 varones, y se caracteriza por la degeneración progresiva de los músculos 1, 2. En los pacientes, la capacidad de los residentes células musculares satélite (SCS) para regenerar las miofibras dañadas vuelve cada vez más ineficaz 4. Por lo tanto, el trasplante de células progenitoras musculares (PSM) / mioblastos de sujetos sanos es un enfoque terapéutico prometedor para DMD. Una limitación importante para el uso de la terapia con células madre, sin embargo, es la falta de tecnologías de imágenes fiables de seguimiento a largo plazo de las células implantadas, y para evaluar su eficacia. Aquí, describimos una manera no invasiva, en tiempo real enfoque para evaluar el éxito del transplante de mioblastos. Este método tiene la ventaja de un gen de fusión informador unificada compuesta de genes (luciferasa de luciérnaga [fluc], monomérico proteína fluorescente roja [mRFP] SR39 y la timidina quinasa [sr39tk]) cuya Expression se pueden obtener imágenes con diferentes modalidades de imágenes 9, 10. Una variedad de técnicas de imagen, como la tomografía por emisión de positrones (PET), emisión de fotón único tomografía computarizada (SPECT), resonancia magnética (MRI), formación de imágenes ópticas y de alta frecuencia de ultrasonido en 3D están disponibles, cada uno con sus ventajas y limitaciones 11. Bioluminiscencia de imágenes (BLI) estudios, por ejemplo, tienen la ventaja de ser un coste relativamente bajo y de alto rendimiento. Es por esta razón que, en este estudio, se hace uso de la luciferasa de luciérnaga (fluctuaciones) secuencia de gen reportero contenido dentro del gen de fusión y formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para la localización a corto plazo de mioblastos C2C12 viables después de la implantación en un ratón modelo de DMD (distrofia muscular en el cromosoma X [mdx] ratón) 12-14. Es importante destacar que, BLI nos proporciona un medio para examinar la cinética de los PSM etiqueta post-implantación, y será útil para rastrear las células repetidamente en time y la migración siguiente. Nuestro enfoque de genes reportero además nos permite fusionar múltiples modalidades de imagen en un sujeto vivo solo, dada la naturaleza tomográfico, buena resolución espacial y la capacidad de escalar a grandes animales y seres humanos 10,11, PET será la base del trabajo futuro que sugieren que puede facilitar la traducción rápida de los métodos desarrollados en las células a modelos preclínicos y para aplicaciones clínicas.
Protocol
1. Mantenimiento y Propagación de mioblastos C2C12
- Placa de mioblastos C2C12 en un matraz de 75 cm 2 y mantener las células en el suero de alta glucosa Dulbecco Modificado de Eagle (HG-DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) a una concentración final de 10%. No permitir que las células se hacen confluentes en cualquier momento ya que esto agotar la población myoblastic. Medio debe ser cambiado cada otro día Nota:. Medio siempre caliente a 37 ° C en un baño de agua antes de su uso.
- Cuando mioblastos ser aproximadamente 80% confluentes, las células de paso a un nuevo matraz. Aspirar el medio de cultivo. Lavar las células con 4-5 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) para eliminar todos los restos de medio de cultivo que contiene tripsina inhibidor de suero. Brevemente enjuague la capa de células con 2-3 ml de 0,25% (w / v) de tripsina-EDTA solución para disociar los mioblastos adherentes del matraz. Aspirar tripsina y el matraz lugar en incubadora a 37 ° C durante 5 min.
- Durante esta incubaciónción, preparar un nuevo matraz con 9 ml de medio de HG-DMEM/10% de FBS. Después de tripsinización, añadir 10 ml de medio completo a las células y los tiempos de pipeta 4-5 para garantizar la recogida de todas las células en el medio. Añadir 1 ml de suspensión de células en el matraz de nuevo y se incuban en 5% de CO 2 a 37 ° C.
2. La transfección celular C2C12
- Una vez que las células han alcanzado el 50% de confluencia, transfectar de acuerdo con las instrucciones del fabricante de Invitrogen. En pocas palabras, se combinan 90 l Lipofectamine 2000 reactivo con 4,5 ml de OPTI-MEM medio. En otro tubo, se combinan 36 g CMV-trifusion ADN del gen reportero con 4,5 ml de OPTI-MEM. Flick cada tubo para combinar y esperar 5 min. Combinar el contenido de ambos tubos, mezclar suavemente y se incuba a temperatura ambiente durante exactamente treinta minutos Nota:. Un matraz de segunda también se debe configurar para que sólo las células no transfectadas recibir Lipofectamine y OPTI-MEM para servir como un control negativo.
- Eliminar el medio de las células C2C12 y añadir 15,5ml de medio fresco HG-DMEM/10% de SFB. Añadir medio de transfección para llevar el volumen total a 20 ml.
- Permitir que las células a transfectar durante la noche durante al menos 20 horas a 37 ° C.
- Al día siguiente, se aspira el medio de transfección y se añaden 10 ml HG-DMEM/10% de FBS.
- Ver las células bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Permite capturar tanto de campo claro y rojo imágenes de fluorescencia (utilizando un cubo de filtro TRITC; mRFP ex / em: 584/607 nm). Contar el número de células que expresan RFP observe bajo fluorescencia dividido por el número total de células observar bajo campo claro para múltiples campos de visión para mayor eficacia de transfección.
3. Evaluación de la supervivencia celular / MTT ensayo
- Un día antes de la transfección, la placa de 1x10 5 células C2C12 en cada pocillo en una placa de 24 pocillos. Las células deben ser plateado en volúmenes de 500 l en FBS HG-DMEM/10%.
- Al día siguiente, los mioblastos transfectar durante la noche como se ha descrito previamente. Siga las sugerencias del fabricante para la transfección reagenvolúmenes t para una placa de 24 pocillos. Incubar un conjunto de pocillos con Lipofectamine sólo (sin ADN) como control. Ver células bajo fluorescencia para asegurar que la transfección adecuada se ha producido.
- Retirar el medio de transfección y se incuban con mioblastos 5 mg / ml de azul de tiazolilo tetrazolio (MTT) en FBS HG-DMEM/10%. Añadir D-luciferina a ocho de los pozos transfectadas, y se incuba a 37 ° C durante cuatro horas.
- Retire medio de pozos. Solubilizar azul cristales de formazán mediante la adición de 180 l de isopropanol a cada pocillo. Agitar a 37 ° C durante 15 min.
- Evitando cualquier precipitado, la solución de la pipeta en una placa de 96 pocillos y se leyó la absorbancia a 575 nm.
4. Preparación de mioblastos para Trasplante
- Retire medio, lavar con HBSS mioblastos y células Tripsinizar como se indica en el punto 1.1.
- Volver a suspender las células en 4 ml de medio completo.
- El uso de un hemocitómetro, contar las células para generar volúmenes que contienen 10 6 mioblastos. Pipetear volmen en microtubos estériles 1,5 ml. Con una eficacia de transfección de ~ 10%, estos valores indican que 100.000 células que expresan luciferasa son detectables en el escáner GE ExploreOptix después del trasplante.
- Alcanzar un volumen de inyección final de 15 l, que contiene 10 6 células C2C12. Si es necesario, microtubos de centrífuga a 2.000 rpm durante un minuto. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender las células en 15 l de DMEM carente HG-FBS.
5. Implantación Celular
- Anestesie ratón con un 2% de isoflurano / 2% O 2. Pluck pelo de la zona extremidad posterior dorsal. Mantenga la anestesia con isoflurano al 1,5% / 2% O 2.
- Asegurar C2C12 mioblastos son bien suspendido. Con el ratón en una posición de decúbito prono, extender la extremidad posterior y el uso de una jeringa de insulina a inyectar células directamente en el lateral de la cabeza del músculo gastrocnemio en un ángulo de 30 °. Inyectar mioblastos transfectados en la extremidad posterior derecha y int mioblastos sin transfectaro el contralateral (izquierda) miembro posterior.
- Realizar un análisis de bioluminiscencia línea de base: Transfiera rápidamente ratón a la etapa en el escáner óptico, por el que se el ratón en una posición boca abajo. Conecte la línea de anestésico. Para asegurar el ratón permanece anestesiado, una segunda persona debe estar presente para conectar la línea de anestésico mientras que los otros lugares que el animal en el escáner.
- Suavemente extender la extremidad posterior de modo que el área de inyección es visible. Cinta traseras piernas en posición con un adhesivo suave, como la cinta médica.
- Cerrar la cámara y asegurarse de que la luz no puede tener acceso al interior del escáner, ya que esto aumentará la señal de fondo detectada. El escáner debe ajustarse a los parámetros incluidos en las instrucciones de su fabricante para obtener imágenes de bioluminiscencia. En concreto, asegúrese de "no láser" está seleccionado.
- Dibuje una región de interés (ROI) en la zona de desplumado y exploración inicial.
6. La inyección de sustrato Fluc, D-luciferina, en ratón mdx
<ol>7. BLI a Target Luc-expresando PSM después del implante en modelos de ratón de DMD
- Después de que el período de absorción, anestesiar ratón de nuevo, como se describe en 5,1.
- Transferir el ratón de nuevo al dispositivo de lectura óptica y realice otro escaneo de bioluminiscencia de la misma manera como la exploración de fondo.
- Aunque un período de 20 min la absorción debe proporcionar una intensidad de señal máxima, un posterior análisis puede ser realizado.
- Una vez completada la adquisición de imágenes, sacrifica el ratón de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité de Ética Institucional Animal y el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA). Aislar el músculo extremidades posteriores y el lugar inmediatamente in 10% de formalina para arreglar para empotramiento parafina. Realizar tinción inmunohistoquímica para la luciferasa para confirmar inyección intramuscular de mioblastos.
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Representative Results
Tras la confluencia 50-60%, mioblastos C2C12 fueron transfectadas transitoriamente con el gen de fusión antes mencionada construcción reportera compuesto de la luciferasa de luciérnaga [fluc], proteína monomérica fluorescente de color rojo [mRFP] y SR39 timidina quinasa [sr39tk] (Figura 1A). La eficiencia de transfección se calculó a través de microscopía de fluorescencia (Figuras 1B, C), haciendo uso de la secuencia de mRFP en nuestro constructo reportero. Supervivencia celular no se vio afectada por el etiquetado con el sustrato BLI, D-luciferina (Figura 1D). Después de la transfección, aproximadamente 100.000 expresan mRFP-mioblastos se implantaron por vía intramuscular en el músculo gastrocnemio de ratones mdx (determinado previamente, manuscrito presentado); 100.000 células no transfectadas fueron implantados de manera similar en el miembro contralateral posterior como control. Implantación de células Inmediatamente después, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) con 150 mg / kg de D-luciferin. Después de un período de absorción de ~ 20 minutos, los ratones fueron imágenes en un escáner óptico de pequeños animales (GE caja ExplorOptix negro que está equipado para la bioluminiscencia de animales vivos y de fluorescencia). Como ya se ha demostrado, tanto in vitro como después de la implantación (manuscrito enviado) la captación de D-luciferina era específico para fluc-mioblastos que expresan, con bioluminiscencia no detectable en las células no transfectadas (Figura 2). La inmunohistoquímica confirmó el trasplante de mioblastos intramuscular (Figura 3)
Figura 1 Esquema del constructo reportero CMV-trifusion (A);. Claro / imágenes de fluorescencia de mioblastos C2C12 transfectadas con el plásmido reportero trifusion (B, C); ensayo de MTT para evaluar la supervivencia celular después de C2C12 etiquetado con sustrato BLI, D-lucifer en (D).
Figura 2. Imágenes de bioluminiscencia (BLI). Una región de interés (ROI) se dibuja para encerrar el área arrancó la extremidad posterior donde mioblastos se inyectan (A). La bioluminiscencia no se detecta durante una exploración de fondo (B). A los 23 min después de la inyección de D-luciferina, una señal clara se detecta a partir de la extremidad posterior derecha donde luciferasa que expresan mioblastos se inyectan. No bioluminiscencia se detecta en la extremidad contralateral posterior inyectado mioblastos no transfectadas (C). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Figura 3. IHC utilizando un anticuerpo luciferasa de luciérnaga confirma la implantación intramuscular de transfectadas las células C2C12.
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Discussion
En este estudio, hemos descrito un rápido y fiable de imagen molecular enfoque, gen indicador de mioblastos diana de manera no invasiva / PSM tras el trasplante. Aunque este estudio demuestra la localización a corto plazo de los PSM trasplantadas a través de bioluminescense formación de imágenes (BLI), la manera en que las células están dirigidos puede, de hecho, ser fácilmente aplicada a una evaluación longitudinal de un injerto de células, a través de la implantación de células que expresan de manera estable el gen reportero. Para ello, nuestro grupo ha generado líneas de ratones transgénicos que albergan el gen reportero unificado. Sólo las células que expresan el gen reportero de oxidar D-luciferina para producir fotones para la visualización usando BLI. Dado que la oxidación de D-luciferina es dependiente de la expresión génica, esta es una poderosa tecnología con la que de manera no invasiva la imagen trasplantadas las células viables. El tejido muscular recolectadas de estos ratones transgénicos y células satélite (SC) aisladas mediante FACS de hecho puede ser targeted después de la implantación en ratones mdx. Adicionalmente, se pueden seguir su estado de diferenciación a través del uso de un promotor específico de músculo, aumentando aún más la utilidad y la importancia de las tecnologías de formación de imágenes moleculares, tal como se presenta en este documento, para el campo de la investigación DMD (manuscrito enviado). Además de su rapidez y bajo costo, BLI no es tóxico, por lo que es una opción atractiva para la imagen frecuente de pequeños animales. Esta característica, así como su alta especificidad, será de gran valor en el refinamiento de las terapias de reemplazo de mioblastos en modelos de enfermedad pre-clínicos de la distrofia muscular de Duchenne antes de avanzar a estudios clínicamente aplicables se incluyen las tecnologías tales como PET.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Sanjiv Gambhir por el don del gen reportero fluc/mrfp/sr39tk. Este trabajo fue financiado por la Red de Células Madre (SCN) de Canadá, y la Fundación de Jesse Journey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
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