Summary
Infection de la prostate peut être un facteur contribuant à la médiation douleur pelvienne chez la prostatite chronique. Nous décrivons la procédure de préparation de l'inoculum bactérien standardisé, l'instillation de bactéries dans l'urètre chez les souris mâles et une méthodologie pour mesurer l'allodynie tactile chez la souris au fil du temps.
Abstract
Uropathogènes Escherichia coli (UPEC) sont des pathogènes qui jouent un rôle important dans les infections des voies urinaires et de la prostatite bactérienne 1. Nous avons récemment montré que UPEC ont un rôle important dans le déclenchement de la douleur pelvienne chronique 2, une caractéristique de la prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) 3,4. Infection de la prostate cliniquement pertinente par UPEC peut initier et mettre en place la douleur chronique par des mécanismes pouvant entraîner des lésions tissulaires et l'initiation des mécanismes d'auto-immunité 5.
Un défi à la compréhension de la pathogenèse de l'UPEC dans la prostate est l'inaccessibilité relative de la glande de la prostate à la manipulation. Nous avons utilisé une méthode précédemment décrite infection intra-urétrale 6 pour fournir une souche clinique de UPEC dans des souris mâles établissant ainsi une infection ascendante de la prostate. Ici, nous décrivons nos protocoles pour normaliser la bacterial inoculum 7, ainsi que la procédure de cathétérisme sous anesthésie les souris mâles à une instillation de bactéries.
CP / CPPS est essentiellement caractérisé par la présence d'allodynie tactile 4. Test comportement était basé sur le concept de l'hyperalgésie cutanée résultant de visées 8-10 douleurs viscérales. Un accent irritable dans les tissus viscéraux réduit les seuils de douleur cutanée permettant une réponse exagérée à normalement non douloureuses stimuli (allodynie). Application de la force normale à la peau en raison des réactions anormales qui ont tendance à augmenter avec l'intensité de la douleur viscérale sous-jacente. Nous décrivons la méthodologie de NOD / ShiLtJ souris qui utilisent von Frey fibres de quantifier l'allodynie tactile au fil du temps en réponse à une seule infection par des bactéries UPEC.
Protocol
1. Préparation des bactéries pour inoculation à la souris
Ce qui suit doit être fait dans des conditions aseptiques.
- Prendre un 17 x 100 mm tubes en polypropylène avec bouchons et ajouter 3 ml de bouillon Luria frais (LB) médias. En utilisant des pointes autoclave, prenez le stock de glycerol congelé bactéries de la souche CP1 2 et transférer une petite quantité de la culture dans le tube contenant le milieu LB. Remplacer le bouchon du tube de sorte que l'oxygène est encore capable de pénétrer dans le tube - la culture a besoin de grandir dans des conditions aérobies. Placer le tube à 37 ° C dans un incubateur agité à 220 tours par minute pendant la nuit.
- Le lendemain, transférer 5 pl de culture d'une nuit dans un nouveau tube avec 3 ml du milieu LB et de grandir dans des conditions statiques dans un incubateur pendant la nuit à 37 ° C.
- Au jour 3 de transfert de 40 ul de la culture dans le tube de 50 ml aa contenant 40 ml du milieu LB chacun. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit statique.
- Activer et configurer centrifugeuse à 4 ° C.Une fois centrifugeuse a atteint la température finale, transférer 40 ml de chaque culture dans un tube de centrifugeuse de 40 ml Nalgene.
- Peser les tubes d'équilibrer centrifugeuse - régler le volume avec du milieu LB, au besoin. Faites tourner les tubes à 6000 rpm pendant 20 min.
- Retirez délicatement le surnageant et suspendre doucement culot bactérien dans 40 ml de PBS stérile.
- Répétez l'étape 1.5 avec du PBS.
- Aspirer le surnageant et suspendre les bactéries dans 500 ul de PBS stérile. Transférer la solution dans un tube de 1,5 ml. Prenez 10 pl de suspension et diluer dans 990 ul de PBS glacé. Utiliser un spectrophotomètre pour lire les DO 420 nm pour déterminer le volume nécessaire pour l'inoculation. Pour déterminer le volume approprié de PBS glacé de suspendre le culot dans: Prenez le nombre OD nm 420 (en ml) et on soustrait le volume estimé du culot bactérien [ex. OD 420 nm = 0,545, granulés d'environ 0,075 ml. 0,545 à 0,075 = 0,470].
- Retirer 10 ul de suspension bactérienne et diluth dans 990 ul PBS glacé. Lire les nm OD 420. L'objectif est d'atteindre une valeur de DO nm 420 pour la suspension diluée de 1,000 ± 0,010. Si le numéro de votre dilution est supérieure à cette cible, ajouter plus de volume à la suspension et prendre une autre lecture. Si le nombre est inférieur au 0,990 ensuite tourner vers le bas la suspension et répéter la lecture OD 420 nm jusqu'à l'obtention de lecture souhaitée.
2. L'infection des animaux
Souris (5 à 7 semaines, dix par groupe) ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Les souris sont anesthésiées par inhalation de 1-4% d'isoflurane dans une chambre en plexiglas et sont surveillés jusqu'à couché.
- Une souris à la fois est pris pour l'instillation de bactéries par cathétérisme avec un polyéthylène (PE10) de cathéter fixé à une aiguille G 30 modification d'une seringue Hamilton de verre (longueur de 1,5 à 2,0 cm). Le cathéter est inséré dans le moyeu de l'aiguille. La souris est placed sur sa surface dorsale sous anesthésie maintenue à l'aide d'un cône de nez.
- Le pénis de la souris est extrudée par une pression douce et des quantités généreuses de lubrifiant sur les tampons de coton est utilisé pour la lubrification de l'entrée de l'urètre du pénis.
- 10 ul de tampon phosphate salin contenant 1 x 10 8 bactéries est introduit dans l'urètre de souris anesthésiées après cathétérisme.
- Les souris sont maintenues dans un état anesthésié pendant 15 min dans la chambre après l'introduction de plexiglas bactérienne pour permettre la fixation des bactéries et d'empêcher la miction immédiate.
- Les souris sont replacés dans leurs cages et surveillé pour les prochaines 24 heures.
3. Test comportement
Les souris ont été testés avant l'infection (de base) et aux jours 3, 7, 14, 21 et 28 après l'infection. Appelé l'hyperalgésie et l'allodynie tactile a été testée à l'aide filaments von Frey appliquées à l'abdomen et le r 11,12 plantaireégion de la patte arrière 13. Les tests ont été perfomed à un temps fixe de la journée, la méthodologie standard et tests expérimentateur seul de tous les animaux ont été utilisés. Tests en aveugle des groupes a été utilisé pour lutter contre les limitations de comportement basée sur les tests douleur dans des modèles animaux. Cinq différents filaments von Frey avec les forces de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 et 4,0 g (Stoelting, Etats-Unis) ont été appliquées à l'abdomen et la fréquence des réactions de sevrage a été calculé.
- Après une période de 30 minutes d'acclimatation, les souris sont placées dans des chambres individuelles en plexiglas (6 x 10 x 12 cm) réalisés en interne avec un plancher grillagé en fil d'acier inoxydable.
- Appelé l'hyperalgésie et l'allodynie tactile ont été testés en utilisant les cinq filaments von Frey. Chaque filament a été appliqué pendant 1-2 secondes avec un intervalle inter-stimulus de 5 sec pour un total de 10 heures, et les poils ont été testés dans l'ordre croissant de la force.
- Chaque filament est appliqué à la région abdominale inférieure dans le voisinage général de la prostate eton a pris soin de stimuler les différentes zones de cette région pour éviter la désensibilisation ou "liquider" les effets. Filaments ont été appliqués dans l'ordre croissant de la force pour 1-2 secondes avec des intervalles d'au moins 5 sec entre stimulations pour un total de 10 fois.
- Trois types de comportement sont considérés comme une réponse positive à la stimulation du filament: 1) la rétraction brutale de l'abdomen; 2) lécher ou gratter immédiate de la zone de stimulation filament; 3) saut.
- Réponse en fréquence a été calculée comme le pourcentage de réponses positives (sur 10, par exemple, 5 réponses 10 = 50%) et des données a été signalé que le pourcentage moyen de réponse en fréquence ± SE
- Animaux de plus de 25 réponses positives de référence totales sont exclus de l'étude.
- Allodynie tactile a été testé sur la région plantaire de la patte arrière à l'aide filaments von Frey avec les forces de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 et 4,0 g. Le seuil de retrait médiane de 50% (5) a été évaluée en utilisant le haut-basméthode où le test a été lancé avec 0,04 g de filament appliqué perpendiculairement à la surface plantaire de la patte arrière jusqu'à ce que le filament légèrement fléchis. Filaments ont été testés dans l'ordre croissant jusqu'à ce qu'une réponse positive a été observée. Une réponse positive à filament a été définie comme étant soit un retrait brusque de la patte ou le léchage de la patte d'essai. Si une réponse positive a été enregistrée le filament côté plus faible a été appliquée, et si une réponse négative a été observée, puis le filament fort suivant a été appliqué.
- Les expériences et les méthodes décrites ont été examinés et approuvés par les soins des animaux du Nord-Ouest et l'Université utiliser comité.
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Representative Results
Nous avons examiné des souris NOD / ShiLtj et C57BL/6J mâles de la présence de la douleur chronique lors d'une infection bactérienne. Des souris mâles (5 à 7 semaines) ont été instillées avec une solution saline ou de bactéries dans l'urètre (Figure 1). La stimulation mécanique de la région pelvienne avec des filaments de von Frey de souris C57BL/6J solution saline et inculqué UPEC-infectés souris C57BL/6J donné lieu à une réponse en fréquence qui n'a pas changé au cours de 28 jours de l'expérience (figure 1). En revanche, les souris NOD UPEC-infectés présentaient des réponses à la stimulation pelvienne qui étaient significativement plus élevés et sont restés significativement élevée jusqu'au jour 28 (P <0,05; figure 3). L'infection bactérienne n'a pas entraîné de changements dans la sensibilité tactile de la région plantaire de la patte arrière (données non présentées).
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Figure 1. Diagramme expérimental. 1 x 10 8 bactéries préparé par une culture de trois jours a été suspendu dans du PBS et instillé dans l'urètre de souris anesthésiées par cathétérisme. Résultant allodynie tactile a été quantifiée en utilisant filaments von Frey avec les forces de .04, .16, 0,4, 1 et 4 g.
Figure 2. Méthodologie pour tester l'allodynie tactile à l'aide de von Frey fibres. Souris ont été testés avant l'infection bactérienne et à la post-infection jours (PID) 7, 14, 21, et 28. Trois différents types de comportement ont été considérées comme des réponses positives à la stimulation du filament: 1) la rétraction brutale de l'abdomen; 2) lécher ou gratter immédiate de la zone de stimulation filament; ou 3) saut. Réponse fréquemment été calculée comme le pourcentage de réponses positives (sur 10) et data ont été signalés comme le pourcentage moyen de réponse en fréquence ± SE.
Figure 3. Allodynie tactile induite par des bactéries UPEC. Référé hyperalgésie viscérale a été mesurée comme réponses à une stimulation mécanique de la région pelvienne à l'aide de filaments von Frey calibrés cinq forces. Les données sont présentées comme les pourcentages moyens de réponses positives ± SE avant l'instillation de bactéries (de base) et au PID 7, 14, 21, et 28. ANOVA ont montré une augmentation significative de la fréquence de réponse au PID de 7 à 28 par rapport à celle de la ligne de base pour tous les filaments testés chez la souris NOD UPEC-infectés (P <0,05). La réponse à chaque PID pour cent a été calculé comme le total des réponses à toutes les fibres par rapport aux réponses de base.
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Discussion
Infection de la prostate de souris avec UPEC permet d'en modélisation in vivo des événements qui peuvent être impliqués dans la pathogenèse de la prostatite bactérienne, CP / CPPS ou comme un événement prédisposant à une inflammation chronique. Les méthodes décrites pour la préparation bactérienne et l'instillation tirage sur un vaste corpus de littérature sur les modèles UPEC dans l'infection des voies urinaires femelle 7,14. Le modèle a une large applicabilité pour l'étude de la pathogenèse, tester des vaccins candidats potentiels et les mécanismes de modulation du système immunitaire. La capacité de suivre le comportement douloureux d'une manière quantifiable permet l'étude de la pathogenèse de l'infection induite par la douleur et peut-être aussi un modèle préclinique pour tester la thérapeutique douleur.
Il ya plusieurs étapes critiques qui déterminent le succès du modèle d'infection de la souris. Le procédé de culture de trois jours avec agitation et des cultures statiques est effectuée pour une expression optimale des pili qui sont connus pour être importants pour l'UPECattachement aux cellules épithéliales. Il représente une étape cruciale pour la colonisation d'organe réussie par UPEC. Les techniques pour la croissance bactérienne ont été spécialement conçus pour la croissance UPEC à l'étape 420 OD optimisé pour obtenir 10 ul de tampon phosphate salin contenant 1 x 10 8 bactéries 7. Autres espèces ou souches de bactéries potentiellement croître à des rythmes différents et la normalisation serait important de tirer le cas échéant OD qui donne 1 x 10 8 bactéries. Différentes souches de bactéries adhèrent aux cellules de la vessie et de la prostate de façon unique qui sont largement dépendants des facteurs de virulence exprimés par les 14 souche. Infection réussie de la prostate murin serait donc fonction de l'utilisation d'une souche UPEC avec le complément approprié des facteurs de virulence. Immédiatement après l'infection, le maintien des animaux dans un état légèrement anesthésiés pendant un minimum de 15 minutes est important de s'assurer que les insbactéries cultivées eu le temps d'attacher et de lancer la pathogenèse avant que les mécanismes normaux de la miction effacer le volume insufflé de l'urètre.
Allodynie tactile chez la souris est une conséquence de la pathologie sous-jacente viscérale et en tant que telle se caractérise par la spécificité d'hôte souche exquis. Nous avons précédemment décrit qu'une souche pathogène de l'UPEC en NOD mâle / souris ShiLtJ induit une allodynie que les pics en 3 jours et est soutenue chronique alors que la même souche est incapable d'induire une allodynie dans C57BL/67 souris 2. Nos études suggèrent UPEC induite par l'accélération des processus auto-immuns chez NOD / ShiLtJ souris comme la cause sous-jacente. Ainsi, le fond génétique de l'hôte est important dans le développement de l'allodynie tactile. D'autres étapes importantes qui sont essentielles à une mesure objective et réussie d'une allodynie veillons à ce que le testeur est toujours aveuglé à l'identité du traitement, le testeur est également responsable pour la mesure de tous les temps points de l'expérience, l'utilisation de tests similaires fois au cours de la journée, les conditions de logement des souris et à assurer des conditions normalisées à la fois à l'intérieur de points de temps lors d'une expérience, ainsi qu'entre les expériences.
Le modèle d'infection murin a un certain nombre de limites qui doivent être soigneusement pris en compte lors interprétation des résultats. Bactéries instillé intraurethrally ont la capacité d'infecter la vessie ainsi que la prostate. Cela complique l'interprétation de tous les paramètres systémiques ou générales comme la pathologie sous-jacente pourrait être de plusieurs organes. Toutefois, l'utilisation de dérivés de la prostate cliniques et souches bactériennes ainsi que l'examen simultané de la vessie et de la prostate permet des interprétations appropriées. En outre, la méthodologie de l'infection simule la modalité infection probable ascendante dans les mâles humains.
Le modèle d'infection décrite ici diffère de ceux précédemment rapportés pritiellement dans la souche de UPEC utilisé, la souche de souris hôte et les différences dans les techniques de culture et le volume 6 de bactéries instillés dans l'urètre 15. La présente étude utilise un bien caractérisé de la prostate souche dérivée chronique prostatite UPEC à la médiation maladie 2. Des études antérieures ont utilisé des bactéries provenant infections de la vessie ou de la prostatite aiguë qui a été principalement utilisés pour des événements liés inflammation examen mais pas caractérisées en termes de allodynie tactile 6,15. De nombreux autres modèles animaux ont été rapportés qui utilisent des mécanismes auto-immuns 5,16, 17 manipulation hormonale et thymectomies néonatale de 18 à induire la prostatite. Bien que chacun de ces modèles ont des caractéristiques positives, y compris les maladies spécifiques d'organes pathologie et l'utilisation de techniques préexistantes de la pertinence de ces méthodes à la pathogenèse réel de CP / CPPS est inconnue. En revanche, la méthodologie décrite dans cet hommeuscript se réfère à un mécanisme potentiel qui a été postulé pour être un initiateur de la pathogenèse de la maladie de la prostate. En outre, au-delà de son utilité pour comprendre CP / CPPS pathogenèse, les techniques peuvent ainsi être utilisés dans l'établissement et l'examen de l'inflammation chronique de la prostate et de son rôle dans l'HBP (hyperplasie bénigne de la prostate) et cancer de la prostate.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la subvention 1K01DK079019A2 (PT) du NIH / NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
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