Summary
דלקת של הערמונית עלולה להיות גורם תורם בתיווך כאב באגן בערמונית כרונית. אנו מתארים את הליך ההכנה של בידוד חיידקים טופל, החדרה של חיידקים לתוך השופכה של עכברי זכרים ומתודולוגיה למדידת allodynia מישוש בעכברים לאורך זמן.
Abstract
coli Escherichia Uropathogenic (UPEC) הם פתוגנים שמשחקים תפקיד חשוב בדלקות בדרכי שתן וערמונית חיידקי 1. אנחנו הראינו לאחרונה שUPEC יש תפקיד חשוב בייזום של כאבי אגן כרוניים 2, תכונה של ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS) 3,4. הדלקת של הערמונית על ידי UPEC הרלוונטי קליני יכולה ליזום ולהקים כאב כרוני דרך מנגנונים שעשויים לכלול ניזק לרקמות וחניכה של מנגנוני אוטואימוניות 5.
אתגר להבנת הפתוגנזה של UPEC בערמונית הוא נגישותו היחסית של בלוטת הערמונית למניפולציה. אנו מנוצלים שיטה שתוארה לעיל intraurethral זיהום 6 כדי לספק מתח קליני של UPEC לעכברים ממין זכר ובכך הקמת זיהום עולה של הערמונית. כאן, אנו מתארים הפרוטוקולים שלנו לתקנון bacterial 7 בידוד, כמו גם את ההליך לcatheterizing עכברי זכרים מורדמים להחדרה של חיידקים.
CP / CPPS מאופיין בעיקר על ידי הנוכחות של המישוש allodynia 4. בדיקת התנהגות הייתה מבוססת על הרעיון של hyperalgesia עורית כתוצאה 8-10 כאבים קרביים הופנו. התמקדות ברקמות מעי רגיז מפחיתה את סף כאב עוריות המאפשרים לתגובה מוגזמת לגירויים בדרך כלל אינם כואבים (allodynia). יישום של כוח נורמלי לתוצאות בעור תגובות חריגות שנוטות להגדיל עם עוצמת כאב הבטן הבסיסית. אנו מתארים מתודולוגיה בעכברי NOD / ShiLtJ לנצל סיבי פון פריי לכמת allodynia מישוש לאורך זמן בתגובה לזיהום חיידקים בודד עם UPEC.
Protocol
1. הכנת חיידקים להרכבת חיסון מאוס
הבא חייב להיעשות בתנאים אספטיים.
- קח 1 17 100 צינורות פוליפרופילן מ"מ x עם כובעים ולהוסיף 3 מ"ל של תקשורת הטריה וריא מרק (LB). באמצעות טיפי autoclaved, לקחת כמה מניות גליצרול חיידקים קפוא של זן CP1 2 ולהעביר כמות קטנה של התרבות לתוך המבחנה המכילה את המדיה LB. החזר את מכסה צינור החמצן כך שעדיין תוכל להיכנס לצינור - התרבות צריכה לגדול בתנאים אירוביים. צינור מקום ב 37 ° C בחממה רועדת ב220 סל"ד לילה.
- למחרת, להעביר 5 μl של תרבות הלילה לצינור טרי עם 3 מדיה LB מ"ל ולגדול בתנאים סטטיים בחממת לילה בשעת 37 ° C.
- ביום 3 העברה 40 μl של התרבות לתוך צינור מיליליטר aa 50 המכילה 40 מ"ל LB תקשורת כל אחת. מקום במעלות צלזיוס למשך לילה חממת סטטי 37.
- הפעל ולהגדיר צנטריפוגה עד 4 ° C.לאחר צנטריפוגה הגיעה טמפרטורה סופית, להעביר כל תרבות מ"ל 40 לתוך צינור צנטריפוגה 40 מ"ל Nalgene.
- שוקל צינורות לאזן צנטריפוגה - להתאים את עוצמת קול עם תקשורת LB לפי צורך. ספין צינורות ב6000 סל"ד במשך 20 דקות.
- מוציא בזהירות את supernatant ועדינות להשעות גלולת חיידקים ב40 המ"ל סטרילי PBS.
- חזור על שלב 1.5 עם PBS.
- לשאוב את supernatant ולהשעות את החיידקים ב500 PBS סטרילי μl. להעביר את הפתרון לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. קח 10 μl של השעיה ולדלל ב990 μl של PBS קר כקרח. השתמש ספקטרופוטומטר לקרוא את ננומטר OD 420 כדי לקבוע את הנפח הדרוש לחיסון. כדי לקבוע את הנפח המתאים לקר כקרח PBS להשעות גלולה ב: קח את מספר 420 ננומטר OD (במ"ל) ולחסר את הנפח המשוער של גלולת החיידקים [לשעבר. OD 420 ננומטר = 0.545, גלולה כ 0.075 מ"ל. 0.545-0.075 = 0.470].
- להסיר 10 μl של השעית חיידקים ודיהלאוטה 990 PBS μl קר כקרח. קראו את ננומטר OD 420. המטרה היא להשיג שווי 420 ננומטר OD להשעיה המדוללת של 1.000 ± .010. אם המספר שלך הוא הדילול מעל היעד זה, להוסיף יותר נפח להשעיה ולקחת עוד קריאה. אם המספר הוא מתחת .990 אז ספין למטה ההשעיה וקריאת ננומטר 420 OD חוזר עד לקבלת קריאה רצויה.
2. זיהום בעלי חיים
עכברים (5 עד 7 שבועות ישנים, 10 לכל קבוצה) נרכשו מג'קסון המעבדה (הבר הרבור, ME).
- עכברים מורדמים על ידי שאיפה של 1-4% isoflurane בתא פרספקס ומנוטרים עד שכיבה.
- עכבר אחד בכל פעם הוא נלקח להחדרה של חיידקים באמצעות צנתור עם פוליאתילן (PE10) צנתר המחובר למחט 30 G שונה של זכוכית המילטון מזרק (אורך של 1.5-2.0 סנטימטר). הצנתר המוחדר לרכזת של המחט. העכבר הוא Placאד על פני השטח הגבי שלה תחת הרדמה נשמר באמצעות חרטום.
- הפין של העכבר הוא שמפריש לחץ עדינים וכמויות נדיבות של חומר סיכה על ספוגיות כותנה משמש לשימון של הכניסה לשופכה בפין.
- 10 μl של פוספט נאגר מלוח המכיל 1 x 10 8 חיידקים מוחדר לשופכה של עכברים מורדמים לאחר צנתור.
- עכברים נשמרים במדינה הרדימה במשך 15 דקות בתא פרספקס לאחר הקדמת חיידקים כדי לאפשר מצורף חיידקים וכדי למנוע הטלת שתן מיידית.
- עכברים מוצבים בחזרה בכלוביהם ומעקב במשך 24 השעות הבאות.
3. בדיקת התנהגות
עכברים נבדקו לפני הזיהום (בסיסי) ובימים 3, 7, 14, 21 ו 28 לאחר הדבקה. hyperalgesia התייחס והמישוש allodynia נבדק באמצעות חוטי פון פריי הוחלו על הבטן 11,12 וr הפלנטריegion של רגלו האחורית 13. בדיקה הייתה מעודה בזמן של יום קבוע, מתודולוגיה סטנדרטית ובדיקת הנסיינית אחת של כל בעלי החיים היו מועסקות. בדיקות מסונוור מקבוצות נוצלו כדי להילחם על המגבלות של בדיקות כאב מבוססות התנהגות במודלים של בעלי חיים. חמישה חוטי פריי פון בודדים עם כוחות של 0.04, 0.16, 0.4, 1.0 ו 4.0 גרם (Stoelting, ארה"ב) היו מוחלים על הבטן והתדירות של תגובות גמילה היה מחושב.
- לאחר תקופה של 30 דקות של התאקלמות, עכברים ממוקמים בתאי פרספקס בודדים (6 x 10 סנטימטר X12) שנעשו בבית עם רצפת רשת תיל פלדה אל חלד.
- hyperalgesia התייחס והמישוש allodynia נבדקו באמצעות החמישה חוטי פון פריי. כל חוט היה מוחל על 1-2 שניות עם מרווח בין גירוי של 5 שניות למשך 10 פעמים כלל, ואת השערות נבדקו בסדר עולה של כוח.
- כל נימה מוחלת על אזור הבטן התחתונה באזור הכללי של הערמונית וטיפול נלקח כדי לגרות אזורים שונים בתוך אזור זה, כדי למנוע הפחתת רגישות או "לסכם" אפקטים. חוטים היו מיושמים בהגדלת סדר כוחות ל1-2 שניות עם לפחות 5 שניות מרווחים בין גירויים לסך הכל 10 פעמים.
- שלושה סוגים של התנהגות נחשבים תגובה חיובית לגירוי חוט: 1) נסיגה חדה של הבטן, 2) מלקקים מיידי או גירוד באזור של גירוי חוט; 3) קפיצות.
- תדירות תגובה הייתה מחושבת כאחוז מתגובה חיובית (מתוך 10, למשל 5 תגובות של 10 = 50%) ונתונים שדווחו כאחוז הממוצע של תדר התגובה ± SE
- חיות עם יותר מ 25 תגובות בסיסיות כלל חיוביות הוצאו מהמחקר.
- המישוש allodynia נבדק על האזור הפלנטרי של רגלו האחורית באמצעות חוטי פון פריי עם כוחות של 0.04, 0.16, 0.4, 1.0 ו 4.0 גר '. 50% סף הנסיגה החציוני (5) הוערך באמצעות למעלה למטהשיטה שבה בדיקות התחילו עם חוט 0.04 גרם מיושמת בניצב לפני השטח הפלנטרי של רגלו האחורית עד הנימים הכפופים מעט. חוטים נבדקו בסדר עולים עד תגובה חיובית נצפתה. תגובה חיובית לנימה הוגדרה כאחד נסיגה חדה של כפה או ללקק מכפת המבחן. כאשר תגובה חיובית נרשמה הנימה החלשה הבאה יושמה, ואם תשובה שלילית נצפתה, אז החוט החזק הבא יושם.
- הניסויים ומתודולוגיה שתוארו כבר נבדקו ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן ולהשתמש ועדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחנו הנהון / ShiLtj וC57BL/6J עכברי זכרים לנוכחות של כאב כרוני על זיהום חיידקים. עכברי זכרים (5 עד 7 שבועות ישנים) החדירו עם מי מלח או חיידקים לתוך השופכה (איור 1). גירוי מכאני של אזור האגן עם חוטי פון פריי של עכברים מלוחים החדירו C57BL/6J ועכברי C57BL/6J UPEC נגועים הביא לתדירות תגובה, כי לא השתנה במהלך 28-היום של הניסוי (איור 1). לעומת זאת, בעכברי NOD UPEC נגועים הציגו תגובות לגירוי אגן שהיו גדולים באופן משמעותי ונשארו גבוה באופן משמעותי עד שהיום 28 (P <0.05; איור 3). זיהום חיידקים הביא שום שינוי ברגישות מישוש של האזור הפלנטרי של רגלו האחורית (מידע לא מוצג).
tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
איור 1. תרשים זרימה ניסויי. 1 x 10 8 חיידקים שהוכנו על ידי תרבות בן שלושת ימים הופסק ב PBS והחדיר לתוך השופכה של עכברים מורדמים באמצעות צנתור. תוצאת המישוש allodynia כומתה באמצעות חוטי פון פריי עם כוחות של .04, .16, .4, 1, ו 4 גרם.
איור 2. מתודולוגיה לבדיקת allodynia מישוש באמצעות סיבי פון פריי. עכברים נבחנו לפני זיהום חיידקים ובימים שלאחר זיהום (אורך PID) 7, 14, 21, ו 28. שלושה סוגים שונים של התנהגות נחשבו כתגובות חיוביות לגירוי חוט: 1) נסיגה חדה של הבטן, 2) מלקקים מיידי או גירוד באזור של גירוי חוט להט, או 3) קפיצות. תגובה נפוצה הייתה מחושבת כאחוז מתגובה חיובית (מתוך 10) ודאתא דווחו כאחוז הממוצע של תדר התגובה ± SE.
איור 3. allodynia מישוש הנגרם על ידי חיידקי UPEC. הופנה הקרבי hyperalgesia נמדד כתגובה לגירוי מכאני של אזור האגן באמצעות חוטי פון פריי של חמישה כוחות מכוילים. נתונים מתפרסמים כאחוזים הממוצעים של תגובות חיוביות ± SE לפני ההחדרה של חיידקים (בסיסי) ושעת 7 באורך PID, 14, 21, ו 28. ANOVA הצביע על עלייה משמעותית בתדירות תגובה באורך PID 7 עד 28 בהשוואה לזה בתחילת המחקר לכל החוטים שנבדקו בעכברי NOD UPEC נגועים (P <0.05). תגובת אחוזים בכל מח"ש חושבת כתגובות הכוללות לכל הסיבים יחסית לתגובות בנקודת התחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דלקת של ערמונית העכבר עם UPEC מאפשרת בדוגמנות vivo של אירועים שעשויים להיות מעורב בפתוגנזה של ערמונית חיידקים, CP / CPPS או כאירוע predisposing בדלקת כרונית. השיטות מתוארות להכנת חיידקים ותיקו החדרה על גוף גדול של ספרות על מודלי UPEC בדלקת בדרכי שתן נשית 7,14. המודל יש תחולה רחבה ללימוד פתוגנזה, בודק מועמדים פוטנציאליים ומנגנוני חיסון של אפנון חיסוני. היכולת לעקוב אחר התנהגות כאב באופן מדיד מאפשרת לחקר היווצרות כאב זיהום הנגרם על ידי ובאופן פוטנציאלי כמודל קליני לבדיקת תרופות כאב.
ישנם מספר שלבים קריטיים שיקבעו את ההצלחה של מודל זיהום העכבר. שיטת התרבות של שלושה הימים עם רועד ותרבויות סטטיים מבוצעת לביטוי אופטימלי של פילים שידועים שהם חשובים לUPECקובץ מצורף לתאי האפיתל. הוא מייצג שלב קריטי להתישבות איבר מוצלחת על ידי UPEC. הטכניקות להתפתחות חיידקים שתוכננו במיוחד לצמיחת UPEC עם צעד 420 OD מותאם לקבלת 10 μl של פוספט נאגר מלוח המכילים 1 x 10 8 7 חיידקים. מינים או זנים של חיידקים אחרים שעלולים לצמוח בשיעורים שונים וסטנדרטיזציה תהיה חשובה לגזור OD המתאים שנותן 1 x 10 8 חיידקים. זנים שונים של חיידק להיצמד לתאים בשלפוחית השתן והערמונית בדרכים ייחודיות, אשר הנן בלתי תלויים בגורמים הארסיים שהביעו 14 מתח. זיהום מוצלח של הערמונית העכברית לכן יהיה תלוי בניצול של מתח UPEC עם ההשלמה המתאימה של גורמים ארסיים. מייד לאחר הזיהום, שמירה על בעלי חיים במדינה באורח קל הרדימה למינימום של 15 דקות חשוב לוודא שכל פרטיםחיידקי מעובדות לי זמן לצרף וליזום פתוגנזה לפני המנגנונים הרגילים של מתן שתן לנקות את הנפח החדיר מהשופכה.
allodynia מישוש בעכברים היא תוצאה של פתולוגיה הקרבית הבסיסית וככזה מאופיינת סגולי מתח מארח למופת. כבר תארנו בעבר כי זן הפתוגני של UPEC בעכברי NOD ShiLtJ / הגברי גורם allodynia שפסגות ב 3 ימים והיא מתמשכת כרונית ואילו באותה המתח אינו מסוגל גרימת allodynia בC57BL/67 עכברים 2. המחקרים שלנו מראים האצת UPEC מושרה של תהליכי אוטואימוניות בעכברי NOD / ShiLtJ כגורם בסיסי. כך הרקע הגנטי המארח הוא חשוב בהתפתחות של allodynia מישוש. צעדים חשובים נוספים כי הם מפתח למדידה אובייקטיבית ומוצלחת של allodynia להבטיח כי הבוחן תמיד עיוור לזהותו של הטיפול, אותו הבוחן הוא אחראי למדידה של כל זמנים-points בניסוי, הניצול של פעמי בדיקות דומות במהלך היום, בתנאי דיור של העכברים והבטחת תנאים סטנדרטיים הוא בתוך זמן נקודות בניסוי, כמו גם בין ניסויים.
המודל העכברי הזיהום יש מספר המגבלות שיש לשקול בזהירות בפרשנות תוצאה. חיידקים החדירו intraurethrally יש את יכולת ההדבקה של שלפוחית השתן, כמו גם את הערמונית. זה מסבך את הפירוש של כל פרמטרים מערכתיים או כלליים כהפתולוגיה בסיסית יכול להיות מאיברים מרובים. עם זאת, ניצול קליני וערמונית זני חיידקים שמקורם, כמו גם בדיקה מקבילה של שלפוחית השתן והערמונית מאפשר פרשנות מתאימה. בנוסף, במתודולוגיה של זיהום מדמה אפנות הזיהום עולות סבירות בזכרים אנושיים.
מודל הזיהום המתואר כאן שונה מאלה שדווחו בעבר פרימרילי בזן של UPEC מנוצל, במתח ובהבדלים בטכניקות התרבות 6 ונפח של חיידקים החדירו לתוך השופכה 15 העכבר המארח. המחקר הנוכחי משתמש גם מאופיין מתח UPEC ערמונית המופק כרוני ערמונית לתווך מחלה 2. מחקרים קודמים השתמשו בחיידקים הנגזרים מדלקות בשלפוחית שתן או ערמונית חריפה שמנוצלות בעיקר לאירועים שבחנו דלקת הקשורים אך אינו מתאפיינות במונחים של allodynia מישוש 6,15. מודלים של בעלי חיים רבים אחרים שדיווחו כי לנצל מנגנוני אוטואימוניות 5,16, 17 מניפולציה הורמונלית וthymectomies ילוד 18 לעורר בערמונית. בעוד כל אחד מהדגמים האלה יש כמה תכונות חיוביות, כולל מחלות הפתולוגיה איבר ספציפית ולניצול של טכניקות קיימות מראש את הרלוונטיות של שיטות אלה לפתוגנזה בפועל של CP / CPPS אינן ידועות. לעומת זאת, המתודולוגיה שתוארה באיש הזהuscript מתייחס למנגנון אפשרי שכבר הניח להיות יוזם פתוגנזה מחלה בערמונית. בנוסף, מעבר לתועלת שלו להבנת הפתוגנזה CP / CPPS, הטכניקות יכולות גם להיות מנוצלות בהקמה ובחינת דלקת כרונית של הערמונית ותפקידו של בBPH (היפרפלזיה שפירה של ערמונית) וסרטן הערמונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המענק 1K01DK079019A2 (PT) מ-NIH / NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
References
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
- Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
- Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
- Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
- Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).
- Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).
- Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
- Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
- Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
- Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).
