Summary
Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.
Abstract
La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l'elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.
Introduction
La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per 1,2 visione e la regolazione dell'espressione genica e della traduzione di proteine durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti 3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificità e per evitare la tossicità associata con diffusione casuale 7-10. Un recettore ad alta affinità che si lega alla RBP e riprende vitamina A è stato ipotizzato nel 1970 11-13. Nonostante le prove accumulate in tre decenni l'esistenza del recettore RBP 14-31, l'ipotesi del recettore è stata discussa per molti anni a causa della existence di una definizione errata di olo-RBP. La corretta definizione di holo-RBP è che è l'alta affinità complesso 1:1 fra retinolo e RBP. Estrazione ripetuta di olo-RBP di solvente organico è necessario per la produzione di apo-RBP. Questa definizione è utilizzata da quasi tutti i laboratori che studiano RBP 7,9,32-35 o il recettore RBP 14-31,36-42. La definizione errata di olo-RBP, che è stato utilizzato per confutare l'esistenza del recettore RBP è la miscela acuta di retinolo libero con apo-RBP. Poiché la funzione del recettore RBP di vitamina A assorbimento da olo-RBP è quello di rilasciare retinolo da olo-RBP, il recettore RBP avrebbe giocato alcun ruolo nella captazione retinolo se retinolo è libero di cominciare (come proposto dalla definizione errata di holo -RBP).
La recente identificazione del recettore RBP come una proteina di dominio multitransmembrane chiamato STRA636 e la sua funzione di assorbimento di vitamina A da olo-RBP 36-43 sostiene con forza contro l'ipotesi che RBP nonbisogno di un recettore per fornire vitamina A. dettagliate analisi ha rivelato che STRA6 ha 9 domini transmembrana con l'N-terminale extracellulare e situati C-terminale situati intracellularmente 40. Situato tra transmembrana 6 e 7 è un dominio di legame essenziale RBP 39. STRA6 è accoppiato sia LRAT e CRBP-I di vitamina A assorbimento da olo-RBP, ma né LRAT né CRBP-I è assolutamente necessaria per una maggiore attività STRA6 41. STRA6 capacità di catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP è la chiave per la sua attività di assorbimento di vitamina A 41. Facendo affidamento su STRA6 per rilasciare il suo retinolo, vitamina A consegna entro il RBP in grado di trasportare la vitamina A per colpire le cellule nei tessuti periferici, con elevata specificità ed efficienza.
L'importanza cruciale di olo-RBP definizione e la preparazione è dimostrata non solo dal dibattito storico sulla esistenza del recettore RBP, ma anche da tre documenti relativi recenti basate su olo-RBP definizioni difdifferenti dalla definizione originale e corretta 44-46. Il primo documento utilizzato l'olo-RBP definizione che è stato utilizzato per disapprovare l'esistenza del recettore RBP per studiare il recettore RBP 44. I documenti secondo e terzo avvicinò con una terza definizione di holo-RBP che ha reso ancora meno probabile per retinolo essere studiati per formare un complesso con adeguata RBP 45,46. Questi studi preparato tre H-retinol/RBP mescolando olo-RBP (nemmeno apo-RBP) con 3 H-retinolo. Poiché questo dosaggio non ha avuto 3 H-retinol/RBP formata e non rimuovere eventuale eccessivo 3 H-retinolo 45,46, non è un saggio per 3 H-retinolo assorbimento da 3 H-retinol/RBP, ma è un libero 3 H-retinolo diffusione dosaggio. E 'stato dimostrato in precedenza che STRA6 non aumenta l'assorbimento cellulare di retinolo libero da LRAT 38 o CRBP-I 41. Praticamente tutti retinolo è associato RBP nel sangue e non vi è rilevabile free retinolo. Una delle principali funzioni del recettore RBP è catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP durante l'assorbimento retinolo da olo-RBP 41. Se il retinolo è artificialmente rilasciato o è in forma libera per cominciare 45,46, il recettore RBP non è necessaria. I risultati notevolmente diversi ottenuti dal test gratuito diffusione retinolo rispetto alle analisi basate su preparato correttamente olo-RBP dimostrano che una corretta preparazione di RBP è di fondamentale importanza per i suoi saggi funzionali.
RBP può essere purificata da siero umano 41, ma il procedimento è complesso e la resa è bassa. Un approccio alternativo è quello di produrre RBP in E. coli. Perché E. coli non ha la capacità di piegamento corretto mammiferi proteine secrete con più di una coppia di legami disolfuro come RBP, è essenziale RBP ripiegare e purificare la proteina correttamente ripiegata. Proteine mal ripiegate non solo si comportano diversamente da correggere RBP piegato in vari metodi,ma anche causare aggregazione di proteine durante la conservazione. Per la stessa ragione, apo-RBP viene prodotta solo da alta qualità olo-RBP. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per la produzione di RBP di alta qualità 100% loaded con retinolo attraverso l'espressione batterica, ripiegamento, e la purificazione HPLC. Purificazione HPLC non solo rimuove RBP piegato in modo non corretto, ma anche significativa la contaminazione batterica che può causare artefatti gravi se RBP è utilizzato in saggi di trasduzione del segnale. Abbiamo anche descrivere due sensibili in tempo reale tecniche di monitoraggio per lo studio dei trasporti retinolo STRA6. Entrambe le tecniche dipendono RBP alta qualità. Per motivi di spazio, le tecniche classiche di vitamina radioattivo a base di retinoidi e HPLC-based A dosaggi di assorbimento non sono descritte qui.
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Protocol
1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP
- Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l'espressione della proteina RBP con l'aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore.
- RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di inclusione insolubili. Per arricchire corpi inclusi, cellule pellet a 10.000 xg per 20 min. Seguito da sonicazione le cellule su ghiaccio in 5 ml di PBS con inibitori della proteasi, seguiti da 2 cicli di gelo e disgelo. Pellet giù i corpi di inclusione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio.
- Solubilizzare l'inclusione corpo pellet per sonicazione in 10 ml 7,5 M guanidina cloridrato. Aggiungere un volume di mezzo (5 ml) di tampone Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT ad una finale concentration di 10 mM. Agitare vigorosamente soluzione in un vortex per una notte a temperatura ambiente per ridurre completamente e denaturare le proteine.
- Centrifugare la soluzione proteica per rimuovere il materiale insolubile a 18.000 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo la rotazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta e posizionare il tubo in ghiaccio.
- Preparare quattro volumi (60 ml) di tampone di ripiegatura (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cistina, cisteina 3,0 mM, EDTA 1 mM). Degassare il buffer ripiegatura. Preparare anche 600 microlitri 10 mM in etanolo retinolo sotto fioca luce rossa. Conservare al buio in ghiaccio. Sia la soluzione tampone di ripiegamento e retinolo devono essere preparati al momento.
- Raffreddare sia la soluzione proteica e il buffer ripiegamento su ghiaccio per almeno 30 min. Temperature più alte riduce probabilmente la qualità della ripiegato RBP. Aggiungere 1 ml di tampone di ripiegamento goccia a goccia e 10 ul di soluzione retinolo, mentre a sua volta soluzione proteica è vigorosamente miscelato in un becher su ghiaccio. Ripetere questa operazione fino a quando tutti buffer di ripiegamento e retinolovengono aggiunti. Tenere agitazione la reazione in ghiaccio, al buio per 5 ore.
- Centrifugare la reazione di ripiegatura a 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. È essenziale eliminare gli aggregati subito dopo la reazione di ripiegatura.
- Concentrare la soluzione supernatante utilizzando Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO 10 K) a circa 10 ml. Non concentrare la soluzione ripiegato più di questo livello. Concentrarsi troppo porterà alla aggregazione proteica e riduce la resa finale e la qualità della RBP correttamente piegato. Diluire il campione concentrato con PBS freddo a 100 ml. Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere i componenti della reazione di ripiegatura che interferiscono con la purificazione nickel.
- Centrifugare la soluzione ancora una volta a 24.000 xg per 20 min a 4 ° C. È importante rimuovere qualsiasi precipitato. Trasferire il supernatante in due provette da 50 ml, ciascuna contenente 1 ml di Ni-NTA slurry che è stato lavato con PBS. Ruotare le provette a 4 ° C per un'ora. Incubazione f una soluzione diluita dio 1 hr può causare la precipitazione di proteine mal ripiegate che devono essere rimossi.
- Centrifugare le provette a 500 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con attenzione. Galleggiante Tutto deve essere rimosso. Aggiungere PBS freddo a 30 ml per ciascun tubo. Filare di nuovo e rimuovere il surnatante. Ripetere questo processo fino a quando non vedi nulla, ma perle nel tubo.
- Trasferire la resina Ni-NTA ad una colonna vuota. Lavare resina con 20 volumi di colonna di imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM in PBS. Eluire His-RBP in 5 volumi di colonna di 100 mM imidazolo in PBS. Non conservare questa soluzione per un periodo prolungato di tempo, e congelamento riduce la resa e la qualità finale. Per ottenere risultati ottimali, RBP purificare mediante HPLC immediatamente.
- Dializza His-RBP purificato dalla resina Ni-NTA contro 25 mM Tris, pH 8,4, e 120 mM NaCl. Un concentratore può essere utilizzato anche per lo scambio di buffer. Campioni chiari per HPLC mediante centrifugazione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C a destra prima di ogni corsa.
- Purificare holo-RBP su HPLC utilizzando uno ioneColonna di scambio AX-300 da un gradiente di NaCl passo (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, e 1.000 mm 15 min) con 25 mM Tris, pH 8,4 come fase mobile ad 1 ml / min. Con l'aumento della concentrazione di NaCl, holo-His-RBP viene rilasciato mentre apo-RBP e misfolded RBP rimanere legato alla colonna (Figura 1). Se refolding RBP non avviene in modo ottimale, misfolded RBP (es misfolded RBP-I in Figura 1) può predominare l'intera preparazione.
- Ripristinare il corretto piegato olo-RBP dalle frazioni di picco a 360 mM di NaCl. Monitorare attentamente il profilo di eluizione correttamente piegato e misfolded His-RBP. A partire da 1000 mM di NaCl, la maggior parte di misfolded His-RBP dovrebbero essere liberati.
- Le frazioni contenenti holo-RBP sono riunite, concentrate, e dializzata contro PBS a 4 ° C. Verificare la resa finale e la qualità (330 nm/280 nm) da spettrofotometro. Prodotto correttamente piegati dovrebbe avere un rapporto nm/280 330 nm di poco superiore a 1 (Figura 1).
- Per produzionee apo-RBP, aggiungere un volume uguale di eptano al purificato olo-RBP e mescolare delicatamente ruotando la notte a 4 ° C. Centrifugare a 16.000 g per 10 min a 4 ° C e trasferire accuratamente la fase acquosa inferiore in una nuova provetta (evitando il precipitato all'interfaccia). Ripetere il processo per tre volte con una incubazione per 3 ore ciascuno. Controllare l'assorbimento di uno spettrofotometro Nanodrop per assicurarsi che il picco di 330 nm è scesa al livello di fondo.
2. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata Retinolo rilascio e Retinolo Caricamento in corso
- Bloccare un nero 96 pozzetti Microfluor-2 piastra (Thermo Scientific) con 200 pl di Blocker Casein (Pierce) notte a 4 ° C per prevenire il bloccaggio aspecifica di holo-RBP alla plastica. Blocker caseina dà l'effetto migliore blocco dei tutte le soluzioni di blocco che abbiamo testato.
- Membrane preparate da cellule esprimenti STRA6 o cellule di controllo sono lavate con PBS e attraverso una siringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 volte per produrre una sospensione uniforme in PBS. Usiamo tipicamente membrane derivati da 1/100 a 1/20 di cellule cresciute su un piatto di 100 mm per reazione.
- Lavare i pozzetti della Microfluor-2 piastra una volta con 200 microlitri di PBS. Raffreddare la piastra sul ghiaccio prima aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto).
- Monitoraggio in tempo reale di retinolo fluorescenza viene misurata con l'ottica di fluorescenza della Omega Polarstar (BMG Labtech) con il 320EX filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni 460-10. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1.800. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione.
- Per iniziare l'analisi retinolo rilascio, i pozzetti vengono letti una sola volta con l'endpoint di lettura mode prima olo-RBP (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. Per avviare il saggio retinolo carico, all-trans retinolo (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti in fioca luce rossa. La piastra viene letta una volta prima apo-RBP viene aggiunto a 0 min. Appena apo-RBP viene aggiunto, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore.
- Dopo che tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (ad esempio mostrato in Figura 2) dal software Omega Data Analysis (BMG Labtech) in Microsoft Excel per l'analisi dei dati. Ciascun punto di tempo genera un file che contiene le letture di tutte le condizioni sperimentali. Ad esempio, se ci sono 20 punti di tempo, consolidare i 20 file in un unico file di Excel per l'analisi dei dati.
- Per l'analisi dei dati, i segnali di fluorescenza prima dell'aggiunta di retinolo o holo-RBP a 0 min sono considerati segnali di fondo und sottratti dai segnali finali fluorescenza a tutti i tempi. Sebbene i segnali di fondo sono bassi rispetto alla fluorescenza in retinolo olo-RBP, sottraendo il fondo elimina l'influenza aspecifica di dispersione della luce dalle membrane e permette di concentrarsi sulla fluorescenza retinolo di holo-RBP o retinolo aggiunta a 0 min.
3. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto di retinolo da Holo-RBP a CRBP-I
- Retinolo-EGFP è un nuovo trasferimento di risonanza di fluorescenza (FRET), coppia che è stata recentemente istituita 41. STRA6-catalizzata trasporto retinolo da olo-RBP per EGFP-CRBP-I è monitorata in tempo reale misurando retinolo-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteina di fusione con 6XHis tag (EGFP-CRBP-I) viene prodotto in cellule di mammifero e viene purificata su resina Ni-NTA prima dell'esperimento. EGFP-CRBP-I possono essere memorizzati in PBS con inibitori della proteasi per un breve periodo di tempo a 4 ° C. Alternativamente la proteina di fusione is congelati in -80 ° C in piccole aliquote.
- Prima che le reazioni, preparare una bloccato Microfluor-2 piastra e membrane come descritto sopra. Lavare i pozzetti della piastra Microfluor-2 una volta con 200 microlitri di PBS prima dell'aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto).
- In tempo reale retinolo-EGFP FRET è misurata utilizzando Polarstar Omega con l'eccitazione 320EX filtro e i filtri di emissione 460-10 e 510-10 con simultanei duello di emissione ottica di fluorescenza. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1800 per canale. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione.
- Per avviare le reazioni, EGFP-CRBP-I (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti. La piastra viene letta sullace si utilizza la modalità di lettura Endpoint prima olo-RBP è aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente dalla misurazione ogni 5-10 minuti per 1-2 ore.
- Dopo tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (esempio mostrato in Figura 3) dal software Omega analisi dei dati per Microsoft Excel per l'analisi dei dati come descritto sopra.
- Retinolo-EGFP FRET è calcolata la variazione dinamica del rapporto delle accettore / donatore picchi di emissione 47. L'equazione 41 per calcolare questo rapporto è [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], dove t 510, 510 b, t 460, e 460 b rappresentano le emissioni a 510 nm dopo l'inizio della reazione ( t = tempo di punto), a 510 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), a 460 nm dopo l'inizio della reazione (tempo t = punto), ed a 460 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), rispettivamente.
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Representative Results
Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3).
Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfuro errati. Pertanto, ripiegando in presenza del ligando retinolo è criticamente importante per ottenere ben piegato RBP. Abbiamo trovato che se la reazione ripiegamento non viene eseguita correttamente, misfolded specie RBP (es misfolded RBP-I in Figura 1) può predominare l'intera preparazione e la resa di alta qualità olo-RBP può essere molto bassa dopo purificazione HPLC. Pertanto, HPLC non è possibile risolvere il problema del ripiegamento poveri. Come mostrato nella
Una volta purificata alta qualità olo-RBP o apo-RBP è disponibile, può essere usato per studiare STRA6 catalizzata trasporto retinolo. Sia il tempo reale saggio di rilascio retinolo caricamento e dosaggio retinolo dipendono monitoraggio retinolo fluorescenza. Una fonte di declino artificiale di retinolo fluorescenza è il legame non specifico di RBP al piatto di plastica (una volta RBP è legato alla parete di plastica, non può più essere misurata in soluzione). Abbiamo provato molte condizioni di blocco e ha scoperto che Blocker caseina (Pierce) è più efficace nel ridurre questo calo non specifico e recettore-indipendente di retinolo fluorescenza. Un'altra fonte di declino artificiale di retinolo fluorescenza è scarsa qualità del RBP, come discussosopra.
STRA6-catalizzata rilascio retinolo, retinolo carico e trasporto del retinolo eventi sono relativamente lente, come mostrato dai dati rappresentativi delle figure 2 e 3. Le reazioni sono relativamente lenti perché ogni RBP si lega una sola molecola di vitamina A e tutti STRA6 reazioni catalizzate dipendono sia vincolante RBP e RBP dissociazione per continuare. Per STRA6-catalizzata reazione di rilascio retinolo di continuare, olo-RBP può legare solo dopo apo-RBP dissocia. Per STRA6-catalizzata carico reazione retinolo di continuare, apo-RBP può legare solo dopo olo-RBP dissocia. Per tutte le tecniche in tempo reale di monitoraggio descritte qui, abbiamo trovato che la frequenza ideale di misurazione è una misura ogni 5 min o 10 min. Anche se le misure più frequenti in grado di creare una maggiore risoluzione temporale, i file risultanti dati saranno estremamente grande, perché ogni punto di tempo crea un file di Excel.
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Figura 1. Purificazione di RBP ripiegato su HPLC per ottenere olo-RBP 100% carico di retinolo. Nichel resina purificata ripiegata RBP viene applicata alla colonna a scambio ionico AX-300 da un gradiente passo NaCl (220 mM 10 min, 15 min 360 mm, 1.000 mm e 15 min). La correttamente piegato olo-His-RBP viene rilasciato ed è stato eluito a 360 nM NaCl. Spettri di assorbimento (250 nm-400 nm) dei picchi corrispondenti a ben piegati olo-RBP, misfolded RBP-1, misfolded RBP-2, e la contaminazione sono mostrati (picco proteina è indicato da una linea blu verticale e retinolo picco è indicato da linea rossa verticale). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 2. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata carico retinolo in apo-RBP e il rilascio retinolo da olo-RBP. Questo saggio ha svolto un ruolo importante nel rivelare ciò che STRA6 può fare da solo senza LRAT o CRBP-IA Un esempio di file di dati grezzi per il STRA6-catalzyed retinolo carico e rilascio retinolo come indicato dal software Omega Data Analysis. Per iniziare la reazione retinolo rilascio, holo-RBP viene aggiunto STRA6 membrana o membrana di controllo a 0 min. Per iniziare la reazione retinolo carico, retinolo viene aggiunto STRA6 membrana o membrana di controllo premiscelato con apo-RBP a 0 min. Misure di fluorescenza di 320 nm di eccitazione e di emissione 460 nm rivelato l'andamento temporale delle reazioni. Reazioni 1-6 monitor di retinolo carico in apo-RBP (1, 3, e 5 sono STRA6 reazione, 2, 4, e 6 sono reazioni di controllo). Reazioni 7-12 monitor di retinolo carico in apo-RBP (7, 9, e 11 sono STRA6 reazione, 8, 10, e 12 sono reazioni di controllo). B. I segnali finali calcolati per reazioni mostrate in A. Il grafico di sinistra è stata calcolata sulla base di reazioni 1 a 6. Il grafico a destra è stata calcolata sulla base di reazioni 7-12. La massima segnale di fluorescenza è definito come 1 nel grafico a sinistra. La fluorescenza di olo-RBP aggiunto a 0 min è definita come 1 nel grafico a destra. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP a CRBP-IA Un esempio di file di dati grezzi che monitora la FRET tra retinolo e EGFP come indicato dal software Omega Data Analysis. A 0 min, holo-RBP viene aggiunta alle reazioni contenenti STRA6 membrana (reazioni 1, 3 e 5) o membrana di controllo con EGFP-CRBP-I avviare le reazioni (reazioni 2, 4, e 6). Simultanee misure duello di emissione per eccitazione a 320 nm ha rivelato la traccia verde come il corso di emissione 460-10 tempo e la traccia blu come il corso di emissione 510-10 tempo. B. Il finale calcolato FRET segnali per le reazioni mostrate in A. Il FRET segnali sono stati calcolati secondo i metodi in fase 3.6. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-RBP 48,49.
Le tecniche in tempo reale di monitoraggio qui descritte sono basate sulla fluorescenza intrinseca di retinolo. La spinta iniziale di sviluppare questi saggi è che siamo stati limitati dalle informazioni che può essere rivelato dai saggi classici radioattivi e HPLC a base di saggi. Per esempio, abbiamo scoperto che la vitamina STRA6 ha poco Un'attività assorbimento da sola in vitamina A dosaggi di assorbimento, ma non è facile spiegare la bassa attività di STRA6 di vitamina A o di captazione senza LRAT CRBP-I 41. In retinile saggi a base di esteri, è facile comprendere che STRA6 per sé non rende estere retinile STRA6 perché non è un enzima che ha attività LRAT. Tuttavia, anche in saggi basati retinolo, STRA6 ha ancora poca attività da sola. Ha STRA6 ha alcuna attività di assorbimento di vitamina A a tutti? In caso contrario, come si può CRBP-I o LRAT accelerare la sua attività? Se lo fa, perché ha bisogno di CRBP-I o LRAT? Anche se i test radioattivi e HPLC-saggi basati non rispondere a queste domande, abbiamo concluso che STRA6 dovrebbe avere la capacità di liberare retinolo da RBP. Abbiamo anche pensato che un saggio di fluorescenza retinolo potrebbe rivelare questa attività. Retinolo misura di fluorescenza ha permesso di studiare il movimento del libero retinolo nelle cellule fotorecettrici vertebrati dopo la luce sbiancamento dei pigmenti visivi in tempo reale 50,51. Come può recettore RBP essere monitorato misurando la fluorescenza retinolo? È stato scoperto nelprimi anni 1970 da parte di due gruppi di ricerca, che ha notevolmente migliorato retinolo fluorescenza quando si lega alla RBP 52,53. Abbiamo trovato che STRA6-catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP causa una diminuzione della fluorescenza retinolo, mentre STRA6-catalizzata loading retinolo in apo-RBP causa un aumento di fluorescenza retinolo. Sebbene saggi radioattivi e HPLC saggi basati sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'assorbimento della vitamina A, saggi di fluorescenza non era stato utilizzato per studiare l'attività del recettore RBP fino a tempi recenti, probabilmente perché le membrane endogeni utilizzati come fonte del recettore hanno fluorescenza di fondo molto elevato e una miscela complessa di proteine leganti retinoidi / enzimi che rende difficile interpretare il contributo di ciascuna proteina. Gli strumenti attualmente disponibili sono sensibili anche ciò che rende queste tecniche più fattibile. Oltre a una misurazione diretta della fluorescenza, la nuova retinolo-EGFP FRET coppia 41 accoppiata con ottiche simultanee emissione duellopermette di studiare il trasporto di retinolo retinolo proteine leganti in tempo reale e nelle reazioni contemporaneamente.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da National Institutes of Health di sovvenzione R01EY018144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| guanidine hydrochloride | EMD | 5010 | |
| cystine | Sigma | C8755 | |
| cysteine | Sigma | C7352 | |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | |
| Tris | Fisher | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| retinol | Sigma | R7632 | |
| carbenicillin | Fisher | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
| imidazole | EMD | 5720 | |
| heptane | EMD | HX0295-1 | |
| Blocker Casein | Pierce | 37528 | |
| Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) | Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor-2 plate | Fisher | 14-245-177 | |
| Hamilton syringe Gastight #1710 | Fisher | 14-824-655 |
References
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