Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

Abstract

ויטמין A חיונית לראייה וגדילה / התמיינות של כמעט כל איברי האדם. החלבון מחייב רטינול פלזמה (RBP) הוא עקרוני ומוביל ספציפי של ויטמין בדם. כאן אנו מתארים טכניקת אופטימיזציה לייצר ולטהר הולוגרמות RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד את ההובלה של ויטמין על ידי הקולטן גבוהה זיקת RBP STRA6. הטכניקה הראשונה מאפשרת לייצר כמות גדולה באיכות גבוהה הולוגרמות RBP (100% טיעון עם רטינול) לויטמין A מבחני תחבורה. RBP איכות הגבוהה הוא חיוני למבחנים תפקודיים בגלל misfolded RBP משחרר ויטמין זיהום חיידקים בקלות והכנת RBP יכול לגרום לחפצים. טכניקות ניטור בזמן אמת כמו electrophysiology תרמו תרומה מכרעת למחקרים של תחבורת קרום. תחבורת רטינול הקולטן בתיווך RBP לא נתח בזמן אמת עד לאחרונה. הטכניקה השנייה שתוארה כאן היא פליליתניתוח L-עת שחרור STRA6-קטליזאטור רטינול או הטעינה. השיטה השלישית היא ניתוח בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור תחבורת רטינול מהולוגרמות RBP לסלולרי רטינול חלבון אני מחייב (CRBP-I). טכניקות אלה מספקות רגישות ורזולוציה גבוהה בחשיפת מנגנון ספיגת הוויטמין של הקולטן RBP.

Introduction

ויטמין A היא מולקולה אורגנית שהיא חיוני להישרדות אנושית ותפקוד התקין של כמעט כל איברי האדם. ויטמין נגזר (רטינואידים) להשתתף באירועים ביוכימיים וסלולריים מגוונים כולל את החישה של אור ל1,2 חזון והרגולציה של ביטוי גנים ותרגום חלבונים במהלך התפתחות עוברית וברקמות בוגרות 3-6. למרות רטינול יש את היכולת לפזר מערכתי, האבולוציה באה עם חלבון פלזמת רטינול מחייב, חלבון נישא ספציפי לויטמין תחבורה בדם כדי להשיג יעילות וסגולית גבוהה ולהימנע מרעילויות קשורות דיפוזיה 7-10 אקראית. קולטן זיקה גבוהה שנקשר לRBP ולוקח ויטמין היה שיערות ב1970 11-13. למרות ראיות שהצטברו בשלושה עשורים על קיומו של הקולטן RBP 14-31, השערת הקולט נדונה במשך שנים רבות בשל existencדואר של הגדרה לא נכונה של הולוגרמות RBP. ההגדרה הנכונה של הולוגרמות RBP היא שזה מורכב 01:01 זיקה הגבוהה בין רטינול וRBP. שאיבה חוזרת של הולוגרמות RBP ידי ממס אורגני היא הכרחית כדי לייצר apo-RBP. הגדרה זו משמשת כמעט על ידי כל המעבדות הלומדות RBP 7,9,32-35 או קולט RBP 14-31,36-42. ההגדרה לא הנכונה של הולוגרמות RBP ששמשה להפריך את קיומו של הקולטן RBP היא התערובת החריפה של רטינול החופשי עם apo-RBP. מאז הפונקציה של הקולטן RBP בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP היא לשחרר רטינול מהולוגרמות RBP, קולט RBP היה לשחק שום תפקיד בספיגת רטינול אם רטינול הוא חופשי להתחיל עם (כפי שהוצע על ידי ההגדרה הנכונה של הולו RBP-).

זיהוי האחרון של הקולטן RBP כחלבון תחום multitransmembrane נקרא STRA636 ותפקודו בספיגת הוויטמין מהולוגרמות RBP 36-43 חזקה טוען נגד ההשערה כי RBP לאצריך קולט לספק ניתוחים מדוקדקים ויטמין A. נמצאו כי STRA6 יש 9 תחומים הטרנסממברני עם N-הסופי ממוקמים extracellularly וC-Terminus ממוקמים intracellularly 40. ממוקם בין הטרנסממברני 6 ו 7 הוא תחום מחייב חיוני RBP 39. STRA6 מצמיד הן LRAT וCRBP-אני בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP, אך גם לא LRAT CRBP-אני דרוש לחלוטין לSTRA6 פעילות מוגברת 41. היכולת של STRA6 לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP היא המפתח לויטמינה פעילות ספיגה 41. על ידי הסתמכות על STRA6 לשחרר רטינול, ויטמין מסירה בRBP יכול להסיע ויטמין למקד את התאים ברקמות פריפריה עם סגוליות גבוהות ויעילות.

החשיבות הקריטית של הגדרת הולוגרמות RBP והכנה מודגמת לא רק הדיון ההסטורי על קיומו של הקולטן RBP, אלא גם על ידי שלושה עיתונים האחרונים הבוסס על הולוגרמות RBP אונטערשייד הגדרותשונה שמפה מהגדרה המקורית ונכונה 44-46. העיתון הראשון השתמש בהגדרת הולוגרמות RBP ששמשה לפסול את קיומו של הקולטן RBP ללמוד RBP קולט 44. את המסמכים השניים ושלישיים באו עם הגדרה שלישית של הולוגרמות RBP שעשתה את זה אפילו פחות סביר לרטינול להיחקר כדי ליצור מורכבות נכונות עם RBP 45,46. מחקרים אלה הוכנו על ידי ערבוב 3 H-retinol/RBP הולוגרמות RBP (אפילו לא apo-RBP) עם 3 H-רטינול. מאז assay זה לא היה לי 3 H-retinol/RBP נוצר ולא להסיר המוגזם חופשי 3 H-רטינול 45,46, זה לא assay לספיגת H-3 מ 3 H-retinol/RBP רטינול, אבל הוא חופשי 3 assay דיפוזיה H-רטינול. זה כבר הראה בעבר כי STRA6 לא לשפר את ספיגת הסלולר של רטינול בחינם על ידי LRAT 38 או CRBP-41. כמעט כל רטינול חייב RBP בדם ואין להבחין freהדואר רטינול. פונקציה עיקרית של הקולטן RBP היא לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP במהלך ספיגת רטינול מהולוגרמות RBP 41. אם רטינול הוא שוחרר באופן מלאכותי, או בצורה החופשית להתחיל עם 45,46, קולט RBP אין צורך. התוצאות השונות באופן דרמטי המתקבלות מבדיקת דיפוזיה רטינול החופשית בהשוואה למבחנים הבוסס על הוכן כראוי הולוגרמות RBP להמחיש כי הכנה הנכונה של RBP הן קריטיות עבור המבחנים הפונקציונליים שלו.

RBP יכול להיות מטוהר מסרום האדם 41, אך ההליך מורכב והתשואה היא נמוכה. גישה חלופית היא לייצר RBP בE. coli. בגלל E. coli אין יכולת כראוי לקפל חלבונים מופרשים יונקים עם יותר מזוג אחד של אג"ח דיסולפיד כמו RBP, זה חיוני כדי לקפל RBP ולטהר את החלבון המקופל בצורה נכונה. חלבוני Misfolded לא מתנהגים בצורה שונה מרק RBP המקופל תוקן במבחנים שונים,אבל גם לגרום להצטברות חלבון במהלך האחסון. מאותה הסיבה, apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP. אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימלי לייצר RBP איכות גבוהה 100% עמוסים רטינול דרך ביטוי חיידקים, מקפל, וטיהור HPLC. טיהור HPLC מסירה RBP מקופל באופן שגוי, אלא גם זיהום חיידקים משמעותי שיכול לגרום לממצאים חמורים אם RBP משמש במבחני העברת אותות לא רק. גם אנו מתארים שתי טכניקות בזמן אמת ניטור רגישים ללמוד תחבורת רטינול ידי STRA6. שני הטכניקות תלויות בRBP באיכות גבוהה. בשל מגבלות מקום, בטכניקות הקלסיות של ויטמין retinoid מבוסס וHPLC מבוסס רדיואקטיבי A מבחני ספיגה אינן מתוארות כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור, מקפלים, וטיהור HPLC של הולו-RBP

  1. להפוך את BL-21cells עם וקטור pET3a מחסה cDNA לRBP האנושי עם 6x התג שלו על N-הסופי. לגדל את BL-21 התאים הפכו בייקר על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת 40 מ"ל LB עם carbenicillin עד OD ב 600 ננומטר מגיע 0.5. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת RBP IPTG ל1mm. לגדל את החיידקים על 37 מעלות צלזיוס עוד 5 שעות.
  2. RBP מיוצר בE.coli הוא בעיקר נוכח בגופי הכללה מסיסות. כדי להעשיר את גופי הכללה, תאי גלולה ב -10,000 XG במשך 20 דקות. אז sonicate את התאים על קרח ב5 המ"ל PBS עם מעכבי פרוטאז, ואחרי 2 מחזורים של הקפאה והפשרה. גלולים במורד גופי ההכללה ב20000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. הסרת supernatant ולשמור על הקמצוץ על קרח.
  3. Solubilize הכללת גוף הגלולה ידי sonication ב10 הידרוכלוריד מ"ל 7.5 M guanidine. הוסף נפח 1/2 (5 מ"ל) של 25 מ"מ טריס חיץ, pH 9.0 וDTT לג סופיoncentration של 10 מ"מ. מערבב נמרצות פתרון במיקסר מערבולת לילה בטמפרטורת חדר כדי להפחית באופן מלא ולפגל חלבונים.
  4. צנטריפוגה חלבון הפתרון להסיר חומר מסיס ב18000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. אחרי הספין, להעביר את supernatant לצינור חדש ולמקם את הצינור על קרח.
  5. הכן ארבעה כרכים (60 מ"ל) של חיץ refolding (25 mM טריס, pH 9.0, 0.3 mM ציסטין, ציסטאין mM 3.0, 1 mM EDTA). דגת חיץ refolding. גם להכין רטינול mM 600 μl 10 באתנול באור אדום עמום. שמור את זה בחושך על קרח. שניהם חיץ refolding ופתרון רטינול צריכים להיות טרי.
  6. לקרר גם פתרון החלבון וחיץ refolding על קרח במשך לפחות 30 דקות. טמפרטורה גבוהה יותר סבירה מפחיתה את האיכות קפלה מחדש RBP. הוסף פתרון 10 μl רטינול בתורו תוך פתרון חלבון מעורב נמרץ בכוס בקרח dropwise 1 מיליליטר חיץ וקפל שוב. חזור על פעולה זו עד שכל חיץ refolding ורטינולהם הוסיפו. ממשיך לערבב תגובה על קרח בחושך במשך 5 שעות.
  7. ספין למטה תגובת refolding ב24000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. זה חיוני כדי להסיר אגרגטים מייד אחרי תגובת refolding.
  8. להתרכז פתרון supernatant באמצעות 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO 10 יא) לכ 10 מ"ל. אל תתרכז פתרון קפל מחדש יותר מרמה זו. להתרכז יותר מדי יביא לצבירת חלבון ומוריד את התפוקה ואיכות הסופית של RBP המקופל בצורה נכונה. לדלל את הדגימה המרוכזת עם הקור PBS עד 100 מ"ל. מטרת שלב זה היא כדי להסיר את הרכיבים בתגובת refolding שמפריע לטיהור ניקל.
  9. ספין הפתרון עוד פעם אחת ב24000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. חשוב להסיר כל משקע. העברת supernatant לשני צינורות 50 מ"ל, כל 1 מ"ל מכיל slurry Ni-נ.ת. ע שנשטף עם PBS. סובב את הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. דוגרי f תמיסה המדוללתאו 1 שעה יכולה לגרום למשקעים של חלבוני misfolded שצריך להסירו.
  10. ספין למטה את הצינורות ב 500 XG ל3 דקות. הסרת supernatant בזהירות. צף דבר יש להסיר. הוסף הקר PBS עד 30 מ"ל לכל צינור. ספין שוב להסיר את supernatant. חזור על תהליך זה עד שאתה לא רואה שום דבר, אלא חרוזים בצינור.
  11. העברת שרף Ni-נ.ת. ע לעמודה ריקה. שטוף את השרף עם 20 כרכי עמודה של 10 מ"מימ imidazole, 500 המ"מ NaCl ב PBS. Elute-RBP ב 5 כרכי טור של 100 המ"מימ imidazole ב PBS. אל תאחסנו את הפתרון הזה לתקופה ממושכת של זמן, והקפאה מפחיתה את התפוקה ואיכות הסופית. לתוצאה הטובה ביותר, לטהר RBP על ידי HPLC באופן מיידי.
  12. דיאליזה-RBP מטוהר משרף Ni-נ.ת. ע נגד 25 המ"מ טריס, 8.4 pH, וmM NaCl 120. Concentrator יכול לשמש גם להחלפת בולם. דוגמאות ברורות לHPLC ידי צנטריפוגה XG ב 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C ממש לפני כל ריצה.
  13. לטהר הולוגרמות RBP על HPLC באמצעות יוניםחילופי העמודה AX-300 על ידי שיפוע צעד NaCl (220 מ"מ 12 דקות, 15 דקות 360 מ"מ, ו1000 mM 15 דקות) באמצעות 25 מ"מ טריס, pH 8.4 כשלב נייד ב1 מ"ל / דקה. ככל שעולה בריכוז NaCl, הולוגרמות-RBP הוא שוחרר תוך apo-RBP וmisfolded RBP להישאר מחויב לעמודה (איור 1). אם refolding RBP לא נעשה בצורה אופטימלית, misfolded RBP (למשל misfolded RBP-אני באיור 1) יכול לשלוט כל ההכנה.
  14. שחזר המקופל כראוי הולוגרמות RBP מהשברים בשיא 360 המ"מ NaCl. זהירות לפקח על פרופיל elution של שלב בצורה נכונה וmisfolded-RBP. ב1000 mM NaCl, רובו misfolded-RBP יש לשחררו.
  15. ברים המכילים הולוגרמות RBP הם נקווים, מרוכזים, ודיאליזה נגד PBS הלילה ב 4 ° C. בדקו את התשואה סופית ואיכות (330 nm/280 ננומטר) על ידי ספקטרופוטומטר. מוצר מקופל בצורה נכונה צריך להיות יחס של 330 ננומטר nm/280 מעט גבוה יותר מאשר 1 (איור 1).
  16. לproducדואר apo-RBP, מוסיף נפח שווה של heptane למטוהרי הולוגרמות RBP ומערבב בעדינות על ידי החלפה בין הלילה ב 4 ° C. צנטריפוגה ב16,000 גרמו עבור 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי התחתון בזהירות לצינור חדש (הימנעות המשקע בממשק). חזור על התהליך שלוש פעמים בדגירת 3 שעות לכל אחד. בדקו קליטה בספקטרופוטומטר Nanodrop לוודא שיא ננומטר 330 ירד לרמת הרקע.

2. ניטור בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור רטינול השחרור וטוען רטינול

  1. חסום Microfluor-2 לוח שחור 96-היטב (Thermo Scientific) עם 200 μl של החוסם קזאין (פירס) לילה ב 4 ° C כדי למנוע הידבקות ספציפית של הולוגרמות RBP לפלסטיק. החוסם קזאין נותן אפקט החסימה הטובה ביותר של כל פתרוני החסימה שבדקנו.
  2. קרומים טריים מתאים לבטא STRA6 או תאי בקרה נשטפים באמצעות PBS ועברו המילטון מזרק (Gastight # 1710) 6 פעמים כדי לייצר השעיה אחידה בPBS. אנחנו בדרך כלל להשתמש בקרומים הנגזרים מ1 / 100 עד 1/20 מתאים שגודלו בצלחת 100 מ"מ לתגובה.
  3. לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 μl של PBS. לקרר את הצלחת על קרח לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב).
  4. ניטור בזמן אמת של רטינול פלואורסצנטי נמדד באמצעות אופטיקה קרינה של POLARstar האומגה (BMG Labtech) עם 320ex מסנן העירור ופליטת מסנן 460-10. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ"מ) והרווח מוגדר ב1800. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל"ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה.
  5. כדי להתחיל את assay השחרור רטינול, הבארות לקרוא פעם אחת באמצעות נקודתי קצה קריאה מ 'שיר הלל לפני הולוגרמות RBP (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות. כדי להפעיל את בדיקת העמסת רטינול, רטינול כל טרנס (בדרך כלל 1 מיקרומטר ריכוז סופי) הוא הוסיף לבארות תחת אור אדום עמום. הצלחת היא לקרוא פעם אחת לפני apo-RBP מתווספת ב0 דקות. ברגע שapo-RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות.
  6. אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (לדוגמה שמוצגת באיור 2) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה (BMG Labtech) ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים. כל נקודת זמן יוצרת קובץ המכיל את הקריאה של כל תנאי הניסוי. לדוגמה, אם יש 20 נקודות זמן, לאחד 20 קבצים לתוך קובץ אחד Excel לצורך ניתוח נתונים.
  7. לצורך ניתוח נתונים, את אותות קרינה לפני התוספת של רטינול או הולוגרמות RBP ב0 דקות נחשבים אותות רקעד נוכה מאותות הקרינה הסופיים בכל נקודתי הזמן. למרות אותות הרקע נמוך בהשוואה לרטינול פלואורסצנטי בולוגרמות RBP, החסרת הרקע מבטל את ההשפעה הספציפית של פיזור אור על ידי הקרומים ומאפשר להתמקד בפלואורסצנטי רטינול של הולוגרמות RBP או רטינול הוסיף ב0 דקות.

3. ניטור בזמן אמת של תעבורת STRA6-קטליזאטור של רטינול מהולו-RBP לCRBP-

  1. רטינול-EGFP היא העברה חדשה פלואורסצנטי תהודה (סריג) זוג שלא מכבר הוקמה 41. תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-מנוטר בזמן אמת על ידי מדידת רטינול-EGFP סריג. חלבון היתוך EGFP-CRBP-עם 6XHis תג (EGFP-CRBP-I) מיוצר בתאי יונקים ומטוהר על שרף Ni-נ.ת. ע לפני הניסוי. EGFP-CRBP-אני יכול להיות מאוחסן בPBS עם מעכבי פרוטאז, לתקופה קצרה של זמן ב 4 ° C. לחלופין חלבון היתוכיs קפואה ב-80 מעלות צלזיוס בaliquots הקטן.
  2. לפני התגובות, להכין Microfluor-2 צלחת וקרומים כמתוארים לעיל חסומה. לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 PBS μl לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב).
  3. זמן האמת רטינול-EGFP סריג נמדד באמצעות POLARstar אומגה עם העירור 320ex הסינון ומסנני הפליטה ו460-10 510-10 באמצעות אופטיקה קרינת פליטה דו הקרב בו זמנית. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ"מ) והרווח מוגדר ב1800 לכל ערוץ. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל"ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה.
  4. כדי להתחיל את התגובות, EGFP-CRBP-I (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף לבארות. הצלחת היא לקרוא עלce שימוש במצב קריאת Endpoint לפני הולוגרמות RBP מתווסף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף על ידי מדידה כל 5-10 דקות לשעות 1-2.
  5. אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (דוגמה מוצגת באיור 3) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים כמתוארים לעיל.
  6. רטינול-EGFP סריג מחושב על ידי השינוי הדינמי בשיעור של פסגות פליטת acceptor / תורם 47. המשוואה 41 לחישוב יחס זה היא [(510 לא -510 ב) / (460 לא -460 ב)], שבו 510 לא, 510 ב, 460 לא, ו460 ב מייצגים פליטה ב510 ננומטר לאחר תחילת התגובה ( t = נקודת זמן), ב510 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP מתווסף (ב = רקע), ב460 ננומטר לאחר תחילת התגובה (= נקודת הזמן t), וב460 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP נוסף (= רקע ב), בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מציגים כאן תוצאות יציגות לייצור הולוגרמות RBP וטיהור על ידי HPLC (איור 1), ניתוח בזמן האמת של STRA6-קטליזאטור שחרור רטינול מהולוגרמות RBP וטעינת רטינול לapo-RBP (איור 2) והניתוח בזמן אמת של תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-I (איור 3).

ללא refolding, RBP מיוצר בחיידקים כמעט misfolded לחלוטין בשל נוכחותם של איגרות חוב דיסולפיד שגויות רבות. לכן, מקפל בנוכחות רטינול יגנד הוא חשוב וקריטי בהשגת RBP מקופל היטב. מצאנו כי אם תגובת refolding לא נעשתה בצורה נכונה, misfolded מיני RBP (למשל misfolded RBP-אני באיור 1) יכולים לשלוט כל ההכנה והתשואה של איכות גבוהה הולוגרמות RBP יכול להיות נמוך מאוד לאחר טיהור HPLC. לכן, HPLC לא יכול לתקן את הבעיה של קיפול מחדש של עניים. כפי שניתן לראות ב (איור 1). אמנם באופן חלקי misfolded RBP עדיין קושר רטינול, קומפלקס רטינול / RBP הוא הרבה פחות יציב, וביתר קלות RBP משחרר המחויב רטינול. Misfolded RBP יכול להוביל למסקנות שגויות מניסויי ויטמינים הקשורות RBP או. הבדל נוסף בין RBP שלב בצורה נכונה וmisfolded RBP הוא ששלב בצורה נכונה הולוגרמות RBP הוא יציב במשך שנים ב 4 ° C בPBS. אםהכנת הולוגרמות RBP יש misfolded זיהום RBP, חומרים מסיסים יצאו לאחר תקופה של אחסון. חומרים מסיסים ניתן לצפות לאחר מסתחרר הפתרון במהירות גבוהה ב 4 ° C. Apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP.

ברגע מטוהר באיכות גבוהה הולוגרמות RBP או apo-RBP זמין, ניתן להשתמש בו כדי ללמוד תחבורת רטינול STRA6-קטליזאטור. שניהם assay בזמן האמת רטינול השחרור ובדיקת העמסת רטינול תלוי בניטור רטינול פלואורסצנטי. מקור אחד של ירידה מלאכותית של רטינול פלואורסצנטי הוא המחייב הספציפי של RBP לצלחת הפלסטיק (פעם RBP קשור לקיר הפלסטיק, זה כבר לא יכול להימדד בפתרון). בדקנו הרבה מצבי חסימה ומצאתי כי החוסם קזאין (פירס) הוא יעיל ביותר בהפחתת ירידה ספציפית וקולט עצמאי זו של רטינול פלואורסצנטי. מקור נוסף לירידה מלאכותית של רטינול פלואורסצנטי הוא איכות ירודה של RBP, כפי שנדוןלעיל.

STRA6-קטליזאטור רטינול שחרור, רטינול טעינה ורטינול תחבורה הם אירועים איטיים יחסית, כפי שמוצגים בנתוני הנציגויות באיורים 2 ו 3. התגובות שלהם איטיות יחסית, מכיוון שכל RBP נקשרה מולקולה של ויטמין 1 וכל תגובות STRA6-catalyzed תלויות בשניהם RBP המחייב וRBP דיסוציאציה להמשיך בלבד. לSTRA6-קטליזאטור תגובת רטינול שחרור להמשיך, הולוגרמות RBP יכול להיקשר רק לאחר מנתק apo-RBP. ל- STRA6 קטליזאטור תגובת רטינול טעינה להמשיך, apo-RBP יכול להיקשר רק לאחר מנתק הולוגרמות RBP. לכל טכניקות הניטור בזמן אמת שתוארו כאן, מצא כי התדירות האידיאלית של מדידה היא מדידה אחת כל 5 דקות או 10 דקות. למרות שמדידות תכופות יותר יכולות ליצור רזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר, את קבצי הנתונים שיתקבלו יהיו גדולים מאוד כי כל נקודת זמן יוצרת קובץ Excel.

איור 1 אוהל-width = "5.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
האיור 1. טיהור קפל מחדש RBP על HPLC להשיג 100% הולוגרמות RBP עמוסים ברטינול. ניקל שרף המטוהרים קפלו מחדש RBP מוחל על עמודת חילוף יוני AX-300 על ידי שיפוע צעד NaCl (220 מ"מ 10 דקות, 15 דקות mM 360, ו1000 mM 15 דקות). שלב בצורה נכונה הולוגרמות-RBP הוא שוחרר וeluted ב 360 ננומטר NaCl. ספקטרום קליטה (250 ננומטר-400 ננומטר) של הפסגות המתאימות להתקפל כראוי הולוגרמות RBP, misfolded RBP-1, misfolded RBP-2, וזיהום מוצג גם הם (שיא חלבון מצוין על ידי קו אנכי כחול ורטינול שיא מצוין על ידי קו אנכי אדום). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

d/50169/50169fig2.jpg "/>
איור 2. ניטור בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור טעינת רטינול לapo-RBP ושחרור מרטינול הולוגרמות RBP. assay זה שחק תפקיד חשוב בחשיפה מה STRA6 יכול לעשות לבדו ללא LRAT או CRBP-IA דוגמה לקובץ הנתונים הגולמיים לרטינול טעינת STRA6-catalzyed ושחרור רטינול כפי שמוצג בתוכנת ניתוח נתוני האומגה. כדי ליזום את תגובת שחרור רטינול, הולוגרמות RBP מתווסף לSTRA6 הממברנה או קרום שליטה ב0 דקות. כדי ליזום את תגובת העמסת רטינול, רטינול מתווסף לSTRA6 הממברנה או קרום שליטה מעורבבת מראש עם apo-RBP ב0 דקות. מדידות קרינה לעירור ננומטר 320 ננומטר ופליטת 460 חשפו כמובן הזמן את התגובות. תגובות 1-6 מוניטור רטינול טעינה לapo-RBP (1, 3, ו 5 הן STRA6 תגובה; 2, 4, ו 6 הן תגובות בקרה). תגובות 7-12 מוניטור רטינול הטעינה לapo-RBP (7, 9, ו 11 הן STRA6 תגובה; 8, 10, ו 12 הן תגובות בקרה). B. האותות הסופיים מחושבים לתגובות המוצגים בא הגרף השמאלי חושבו על בסיס תגובות 1-6. הגרף הימני חושב על בסיס תגובות 7-12. אות פלואורסצנציה הגבוהה ביותר מוגדרת כ1 בגרף מהשמאל. הקרינה של הולוגרמות RBP הוסיפה ב0 דקות מוגדרות כ1 בגרף הנכון. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. ניטור בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור רטינול תחבורה מהולוגרמות RBP לCRBP-IA דוגמה לקובץ הנתונים הגולמיים המנטרת סריג בין רטינול וEGFP כפי שמוצג בתוכנת ניתוח נתוני האומגה. ב0 דקות, הולוגרמות RBP מתווסף לתגובות המכילות STRA6 קרום (תגובות 1, 3 ו 5) או קרום שליטה עם EGFP-CRBP-אני ליזום את התגובות (תגובות 2, 4 ו 6). מדידות בו זמנית דו קרב פליטה לעירור ב320 ננומטר חשפו עקבות הירוקות ככמובן 460-10 פליטה הזמן ועקבות כחול ככמובן זמן הפליטה 510-10. ב סופי מחושב סריג אותות לתגובות המוצגות בא סריג אותות חושבו לפי השיטות בשלב 3.6. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו חולקים כאן פרוטוקול ייצור RBP אופטימלי בגלל תהליכי ייצור וטיהור RBP הם קריטיים ליצירת RBP מקופל בצורה נכונה. בהתחשב באפשרות של מיני RBP misfolded והנוכחות של כמויות זעירות של חלבונים חיידקיים אפילו בHPLC המטוהר חיידקים מיוצרים RBP, כדאי להשתמש RBP יליד מסרום כדי לאשר מסקנה הקשורה לRBP. RBP השתן, שהוא זמין באופן מסחרי, היא תערובת מורכבת של מינים רבים של RBP כולל apo-RBP והולוגרמות RBP 48,49.

טכניקות הניטור בזמן אמת המתוארים כאן מבוססים על הקרינה הפנימית של רטינול. התנופה המקורית לפתח המבחנים האלה הייתה שאנחנו מוגבלים על ידי המידע שיכול להתגלות על ידי מבחנים רדיואקטיביים הקלסיים ומבחני HPLC מבוססים. לדוגמה, מצא כי יש מעט ויטמין STRA6 פעילות ספיגה בעצמו במבחני ספיגת ויטמין A, אבל אנחנו לא יכולים בקלות להסביר את הפעילות הנמוכה של STRA6 בויטמין ספיגה ללא LRAT או CRBP-41. במבחנים מבוססים-אסתר Retinyl, קל להבין שSTRA6 על ידי עצמו אינו עושה אסתר Retinyl בגלל STRA6 אינו אנזים שיש פעילות LRAT. עם זאת, גם במבחנים הבוסס על רטינול, STRA6 עדיין יש פעילות קטנה בפני עצמו. האם STRA6 יש כל ויטמין פעילות ספיגה בכלל? אם לא, איך יכול CRBP-I או LRAT להאיץ את פעילותו? אם כן, למה זה צריך CRBP-I או LRAT? למרות שמבחנים רדיואקטיביים ומבחני HPLC מבוססים לא לענות על שאלות אלה, אנו מנומקים שSTRA6 צריך את היכולת לשחרר רטינול מRBP. גם סברנו שבדיקת פלואורסצנטי רטינול עלולה לחשוף את הפעילות הזו. מדידת פלואורסצנטי רטינול אפשרה ללמוד תנועה של רטינול החופשי בתאי קולטי אור החולייתנים אחרי האור הלבן של פיגמנטים חזותיים בזמן האמת 50,51. כיצד יכול פעילות הקולטנית RBP להיות במעקב על ידי מדידת רטינול פלואורסצנטי? הוא התגלה ב1970 על ידי שתי קבוצות המחקר שרטינול שפר פלואורסצנטי דרמטי כאשר חייב RBP 52,53. מצאנו כי שחרור רטינול STRA6-קטליזאטור מהולוגרמות RBP גורם לירידה ברטינול פלואורסצנטי, בעוד STRA6-קטליזאטור טעינת רטינול לapo-RBP גורמת לעלייה ברטינול פלואורסצנטי. למרות שמבחנים רדיואקטיביים מבחני HPLC מבוססים נעשו שימוש נרחב ללמוד ויטמין ספיגה, מבחני קרינה שלא נעשו שימוש כדי לחקור את הפעילות הקולטנית RBP עד לאחרונה, סביר להניח כי את הקרומים אנדוגניים המשמשים כמקור לקולט יש קרינת רקע גבוהה מאוד ויש תערובת מורכבת של חלבונים המחייבים retinoid / אנזימים שהופכת אותו קשה לפרש את התרומה של כל חלבון. המכשירים הרגישים הזמינים כרגע הם גם מה לעשות טכניקות אלה יותר ריאליות. בנוסף לכוון מדידת קרינה, רטינול-EGFP החדש זוג לכעוס 41 יחד עם אופטיקה פליטה דו הקרב בו זמניתמאפשר ללמוד תחבורת רטינול רטינול לחלבונים מחייבים בזמן אמת ובתגובות מרובות בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המענק R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

ביוכימיה גיליון 71 ביולוגיה מולקולרית גנטיקה ביולוגיה תאית אנטומיה פיזיולוגיה רפואת עיניים פרוטאומיקה חלבונים חלבוני תחבורת ממברנה ויטמין A retinoid RBP מורכב תחבורת קרום הקרום הקולטן STRA6 חלבון מחייב רטינול
ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter