Summary
植入癌细胞进入器官来源可以作为一个有用的临床前模型来评估新疗法。 MB49膀胱癌细胞可在膀胱内以下膀胱灌注生长。该协议表明了鼠标膀胱肿瘤植入和腺病毒转染的目的导尿。
Abstract
膀胱癌是泌尿生殖道和新的治疗方法,可以减少复发和进展所需要的第二种最常见的癌症。肿瘤微环境中可以显著影响肿瘤的发展和治疗反应。因此,它通常是可取的生长的肿瘤细胞中生成它们的器官。本协议描述膀胱癌原位模型,其中MB49小鼠膀胱癌肿瘤细胞通过导管灌入膀胱。在这个模型中成功的肿瘤细胞植入需要保护的葡糖胺聚糖层,其可通过物理或化学的方法来完成的中断。在我们的协议膀胱用胰蛋白酶处理前细胞滴注。膀胱的导管也可用于递送治疗剂,一旦肿瘤被建立。这个协议描述,表达荧光素酶报告基因的腺病毒构建体的传递。虽然Ø乌尔协议进行了优化的短期研究,侧重于基因传递,小鼠膀胱导尿的方法具有广泛的应用。
Introduction
膀胱癌是泌尿生殖道有近75,000预计在2012年1新病例和15,000死亡的第二位最常见的癌症。高复发率需要终身随访,这使得膀胱癌治疗最昂贵的癌症之一。膀胱癌已侵及肌层可能转移到肝脏,通过淋巴系统肺或骨。晚期肿瘤导致仅5年后20-40%的生存多式联运治疗。因此,迫切需要有效的治疗策略旨在减少浅表性膀胱癌的复发和进展,以及改善治疗效果的晚期患者。
新型疗法的发展需要临床前模型下初步的体外评估,以评估疗效。肿瘤微环境中可以显著影响癌症的发展和响应能力,从而强调了需要preclinic在肿瘤的发生或人的模型可以建立在器官来源。一种方法是转基因模型中的肿瘤自发产生的或可诱导的器官特异性的方式发展。转基因膀胱癌模型的一个很好的协议,已出版2。转基因模型的缺点是肿瘤倾向于慢慢地和以比希望的少的均匀发展。此外,保持了繁殖群体的成本,必须考虑到。另一种转基因模型是肿瘤细胞原位移植,其中有很短的时间帧的肿瘤成立市售小鼠的利益。虽然一些人膀胱癌细胞系可原位生长(我们已成功地使用UM-UC-3),它可能是可取的,以建立肿瘤的免疫活性小鼠。两种鼠膀胱癌细胞系,其中原位生长是MBT-2和MB49 3。由于MBT-2细胞被污染的复制C型逆转录病毒4,我们选择MB49细胞进行我们的研究。要注意,MB49细胞从雄性小鼠中分离和原位植入是在雌性小鼠中进行解剖结构的原因是重要的。这有便于识别的植入细胞的Y染色体标记的好处,但性别不匹配可能是一个缺点的免疫学研究。
膀胱上皮是由葡糖胺聚糖(GAG)层,其功能是作为由微生物屏障感染内衬。此屏障也可以用肿瘤细胞和几种方法植入干扰已被开发来克服这一困难( 表1)。电灼已被广泛用作物理手段破坏GAG层5-13和协议证明电灼最近已公布在朱庇特的14。但是,如果一个电灼单元不可用,化学手段破坏对GAG层如硝酸银或聚-L-赖氨酸也可以使用15-24。肿瘤是由膀胱 的短暂暴露于少量体积的硝酸银有效地建立(5-10微升,0.15-1.0 M,〜10秒),或用聚-L-赖氨酸的较长的接触(100 微升的0.1毫克/毫升为20分钟)( 表1)。在这里,我们描述了使用胰蛋白酶,以促进MB49细胞植入的方法。
在试图改善的治疗方法为膀胱癌,基因疗法已经获得了显著关注。从临床上看,膀胱癌基因治疗由于容易获得器官的能力和在本地提供有效载荷的理想目标。已被研究用于膀胱癌基因治疗的病毒载体包括一种溶瘤单纯疱疹病毒25,逆转录病毒26,金丝雀痘病毒27,牛痘病毒,腺相关病毒,和adenoviru第28号。在我们的协议的第二部分中,我们描述了用于病毒递送,几乎是相同的肿瘤细胞的灌注的方法。在我们的实验室中感兴趣的是新颖的方法,以基因递送,我们使用表达萤光素酶转基因的腺病毒载体通过生物发光评估的发展。然而,可用于输送各种试剂膀胱导管的方法,因此具有广泛的适用性。
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Protocol
所有涉及动物的程序进行了审查和批准的机构动物护理和使用委员会在南卡罗来纳医科大学。该协议是根据美国农业部的D类止痛批准。
1。细胞移植
- 在执行程序前两天,板1×10 6 MB49细胞转化为T-25瓶。使用添加有10%FBS(和抗生素,如果需要的话)高糖DMEM。一个烧瓶中足以为每个组最多5只小鼠将被麻醉并植入平行。
- 在手术当天,通过用无菌DMEM基础培养基(1:2稀释)稀释无菌0.25%组织培养级胰蛋白酶至0.125%胰蛋白酶制备用于滴注。 1.2毫升足以用于10只小鼠。放置在37℃水浴中平衡。
- Prewarm加热垫和其下的麻醉系统将用于提供一本nosecones定位soflurane。将干净的吸水垫在加热垫。
- 把小鼠放入麻醉系统的感应腔和诱导麻醉,用3%异氟烷。当老鼠已经失去了知觉,这是由脚趾捏反射消失核实,将它们转移到nosecones。确保每个动物是在仰卧位,并正确放置在加热垫,以保持体温。
- 减少异氟醚的浓度为2%维持麻醉。
- 应用眼药膏,以双眼,以防止干燥。
- 可选步骤:删除腹毛。如果在体内生物发光成像,将执行头发放在下腹部,必须清除。
- 套用一个慷慨层的脱毛霜,如薇婷,最低1毛皮在腹部的广场上,注意不要接触外生殖器。等待3分钟。
- 用干海绵擦拭的面积去除毛发,然后用湿海绵来清洁皮肤。如果需要的话重复一次。
- 导尿,膀胱
- 润滑新,无菌24政小儿静脉导管用无刺激性的润滑凝胶,如肯塔基州。取下并丢弃针头。如果流体的导管周围泄漏是常见的问题, 即得 。它发生比在10小鼠1比较频繁,较大孔的导管(20 G)都可以使用。这可能在老年超过8周的小鼠是一个重要的考虑因素。
- 握住导管的枢纽,用你的另一只手的拇指和食指传播鼠标的后腿和暴露尿道口。轻轻将导管插入尿道以45°角,改变角度,以一个并列的板凳完全插入。
- 完全插入后,提起导管轻轻,保持它平行于工作台,并在视觉上确认,它被放置在尿道和不阴道,这是低于它。如果正确地放置,所述导管将能够在serted完全自阴道比尿道短。
- 降低了异氟醚的浓度为1%。
- 附加的前端至P200移液器和通过施加抽吸到导管的外端从膀胱中移除尿。从导管毂除去任何剩余的尿液。尿倒掉,留下导管的位置。
- 小心吸取80微升0.125%胰蛋白酶溶液进入导管的轮毂,避免产生气泡。附1毫升空气充式注射器的导管套筒,慢慢地压低柱塞0.1-0.2毫升交付胰蛋白酶进入膀胱。
- 留在原地的注射器和导管组件15分钟。为任何剩余的麻醉小鼠(最多4个)重复步骤1.8-1.11。请继续等候期间的下一个步骤。提示:最初,它可能是有帮助的别人准备的细胞(步骤1.12)。
- 准备MB49细胞植入。细胞铺板在1×10 6每T-2的5瓶48小时前注入(步骤1.1)。
- 除去介质并加入500微升0.25%胰蛋白酶的烧瓶中。当细胞分离加入5 ml完全DMEM重悬细胞。取出50微升等分试样进行计数,并且离心剩余在1,000 rpm离心5分钟。在离心步骤继续步骤1.12.2和1.12.3。
- 使用血细胞计数器计数细胞。计算细胞/ ml。然后计算以使细胞沉淀,以4×10 6个细胞/ ml(每50μl的2×10 5个细胞)所需的体积。
- 从离心细胞倒出上清液,并用中止细胞至4×10 6个细胞/ ml(如计算步骤1.12.2)所需的体积重悬在DMEM基础培养基中沉淀。保持细胞在室温下。
- 当达到用于气囊的胰蛋白酶处理15分钟时间点,从导管离开导管的位置分离的空气填充的注射器。花了胰蛋白酶将正常LY流回了通过导管。通过抽吸与P200的移液器除去从膀胱任何剩余的胰蛋白酶如上述步骤1.9和丢弃。
- 立即吸取50微升MB49细胞悬液到导管的轮毂。附加1毫升空气充式注射器的导管的轮毂和通过慢慢压下柱塞0.1-0.2毫升递送细胞至膀胱。重复此步骤,最多四次,植入所有五只小鼠。丢弃任何未使用的单元格。
- 离开导管,注射器组装到位,使细胞在膀胱停留50分钟。
- 轻轻地从尿道撤出导管,注射器组装。关闭异氟醚浓度为零,每次移动鼠标一个或两个客场从鼻锥恢复加热垫英寸。
- 当鼠标已经恢复了翻正反射,将其放回笼子。
2。腺病毒的膀胱内交货(8天细胞移植后)
小心:这部分协议使用腺病毒,这是一种传染性剂,在严格BSL2准则应处理(http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/)。与传染性病原体进行的所有程序批准了南卡罗来纳医科大学的生物安全委员会。
- 植入小鼠MB49细胞后八天,检查血尿。拿起动物个体在一个白色的一张吸水纸,轻轻按在腹部涂抹的尿液滴在纸张上。尿液是粉红色到红色表示血尿是肿瘤已经建立的标志。肿瘤接受率至少为80%,具有优良的技术可以高达100%。
- 解冻腺病毒库存在冰上并在无菌,室温PBS稀释至10 9 PFU/50微升(2×10 10 PFU /毫升)。
- 如上面的步骤1.3-1.6中所述麻醉小鼠。
- 导尿小鼠按照步骤1.8中所述,取出尿如步骤1.9
- 尿除去后,立即吸取50微升病毒悬液到导管的轮毂。附加1毫升空气充式注射器的导管的轮毂和通过慢慢压下柱塞0.1-0.2毫升递送病毒膀胱。
- 离开导管,注射器组装到位,让病毒在膀胱停留40分钟。
- 轻轻地从尿道撤出导管,注射器组装,并丢弃到10%的漂白粉溶液灭活任何残留的病毒。
- 关闭异氟醚浓度为零,每次移动鼠标一个或两个客场从鼻锥恢复加热垫英寸。
- 当鼠标已经恢复了翻正反射,将其放回笼子。
- 马克笼表明,老鼠已经被灌输与腺病毒。病毒会脱落入笼床上用品数天,所有的笼子里,床上用品必须是处理并适当消毒。
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Representative Results
血尿是在几乎所有的小鼠中观察到内200,000 MB49细胞植入后8天。在非肿瘤小鼠为87.5±19.2毫克(范围77-120毫克,N = 10) 如图1,膀胱重量比双打更从34.7±3.3毫克(范围31-37毫克,N = 4),在小鼠已经植入MB49细胞。在基因传递方面,我们发现,小鼠成像24小时后病毒滴入产生更强的信号超过48小时( 图2)之后。腺病毒转染的动物,它应该用于统计目的的策划组大小时,必须考虑到( 图2和图3)之间的高度变化。如果一个小动物成像系统不可用,来测量荧光素酶转基因的表达的另一种方法是消除和均化膀胱用于体外分析。使用IVIS200小动物系统· 体内分析的比较m和体外分析使用稳态格洛套件,表明( 图3)的数据集之间的良好的相关性。
图1。分析肿瘤负荷。非肿瘤重量的(N = 4)和荷瘤(N = 10)小鼠膀胱200,000 MB49细胞灌注后的9 天 。统计学显着性通过学生的t-试验用GraphPad软件来确定。 * P = 0.0002。 点击这里查看大图 。
图2中, 在体内分析基因表达。 9 PFU AdCMV.Luc(+)。可视化荧光素酶,小鼠用200微克素/鼠腹腔注射。荧光素酶基因的表达,用IVIS200小动物成像系统测量在体内 。 点击这里查看大图 。
图3。通过体内小动物成像和体外测定法中获得的生物发光信号的比较。递送病毒储存缓冲液(空心圆)或1×10 9 PFU AdCMV.Luc(实心圆),二十四小时后,将小鼠分别利用IVIS200成像,然后sacrific编辑。被拆除,并匀浆体外分析使用稳定格洛套件中的生物发光信号的膀胱。通过各方法获得的荧光素酶信号表示以任意单位(AU)。测定(R 2)的系数计算与数据分析加载的Microsoft Excel。 点击这里查看大图 。
侮辱GAG层 | 细胞植入 | 保留时间 | 肿瘤检测与发展 | 参考 |
电灼 | 0.01-1×10 5 MB49 | 血尿:1,000细胞:0/0; 10,000个细胞:4/6,100,000细胞:6/6肿瘤:1,000细胞:0/6; 10,000或多个单元格:6/6,6/6(100%) | 5 | |
ElectrocautERY | 5×10 4 MB49-吕克 | 肿瘤的发病率:90%(如在参考图11) | 6 | |
电灼 | 1×10 5个MB49 | 〜3小时 | 肿瘤发病率:90%在50 | 7 |
电灼 | 1×10 5个MB49 - PSA | PSA:早在植入后4天检测 | 8 | |
电灼 | 1×10 5个MB49 | 肿瘤发病率:90% | 9 | |
电灼 | 5×10 4个MB49 | 2小时 | 肿瘤发生率:83.3%(10/12)在第21天 | 10 |
电灼 | 2×10 4个MB49 | 2小时 | 肿瘤发病率:100%28日 | 11 |
电灼 | 1-5×10 4 MB49 | 3小时 | 血尿:100%由16天;肿瘤发病率:100% | 12 |
电灼 | 1×10 5个MB49 | 3小时 | 肿瘤发生率:97.3%(73/75) | 13 |
锁相环(100UL 0.01%20分钟) | 1×10 5个MB49 - PSA | 2小时 | 肿瘤发病率:100% | 15 |
PLL(0.1毫克/毫升) | 1×10 5个MB49 - PSA | 2小时 | 肿瘤发病率:100% | 16 |
锁相环(100微升0.1毫克/毫升20分钟) | 1×10 5个MB49 | 1小时 | 肿瘤发病率:94%(15/16) | 17 |
PLL(0.1毫克/毫升) | 1×10 6个MB49 | 血尿在第7天:50%,100在14天% | 18 | |
锁相环(100微升0.1微克/毫升20分钟)或22%乙醇 | 1×10 5 MB49 | 1小时 | 肿瘤发病率:未修改膀胱:0%,PLL:80-100%,乙醇40-80% | 19 |
硝酸银(5微升0.2 M) | 1×10 6个MB49 | 1小时 | 肿瘤发病率:100% | 20 |
硝酸银(10微升0.15M的10秒) | 5×10 5 MB49 | 肿瘤发病率:92%(46/50) | 21 | |
硝酸银(8微升1米10秒) | 5×10 5 MB49 | 2小时 | 血尿:100%在7天;天血尿100%,肿瘤发病率:96.7%(29/30只小鼠)在15日 | 22 |
硝酸银5微升0.2M的 | 0.5-2×10 6个MB49 - PSA | 1小时 | PSA检测 | 23 |
盐酸(100微升0.1M的15秒) | 1×10 6个MB49 | 1小时 | 24 |
表1肿瘤检测和发展以下MB49细胞原位移植。不同的物理和化学辱骂已被用于GAG层的破坏,以促进MB49细胞膀胱内生长。实验条件和使用的MB49原位模型以前的研究结果进行了总结。如果可用,在括号中的第一列中的信息包括体积,浓度和剂的接触时间用于GAG层的化学破坏。
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Discussion
在本协议中所述的主要方法是导尿鼠标膀胱,这对细胞的灌注或用于本地传递到膀胱上皮任何代理广阔的应用前景。上文所述的特定的协议进行了优化的短期研究(〜10日)。植入细胞的精确数目是至关重要的,因为更高的细胞数,将导致更快速的肿瘤生长和可能的动物的损失是由于肿瘤负荷大。使用200,000 MB49细胞滴注可能需要高达实施安乐死的动物的25%由14天因过度肿瘤负荷。根据我们的经验,小鼠不会受到肿瘤负荷在12天内受到影响。除了标准的标准,如嗜睡,疏导不良,和/或在这个模型食欲过度肿瘤负荷损失是由排尿无力证明。
此协议的一个重要考虑因素是物流。首先,MB49细胞生长rapidl植入前两天y和电镀百万细胞将产生在滴注的天数期最佳的文化。如果需要对实验动物的数量超过动物,可以在一天内被植入的数量,MB49培养物将必须设置相应的(多天),以防止培养物的过度生长。其次,直到该技术已经完善,用户应与一小群动物。有经验的用户将能够植入6组5只小鼠的每一天没有一个助手(1.5小时/组,包括停留时间)。然而,最初它是有帮助的助手准备和计数细胞滴注。最后,设备的位置是很重要的。理想情况下,生物安全柜和麻醉设备均位于同一个房间。
一个潜在的局限性在于,麻醉设备具有5 nosecones,这是在使用过程中的停留时间。如果大量的小鼠例行植入,SE贝拉尔这种系统可以并行地使用。在理论上,可以使用麻醉的其他方法。然而,异氟醚吸入麻醉的一个好处是,驻留时间可以得到控制。
一旦导管的技术被掌握,这个协议可以应用到一些实验条件。从主膀胱肿瘤衍生的新的膀胱癌的细胞系或细胞可以评价其潜力原位生长。此外,也可以植入不同数量的细胞,以确定所需的肿瘤取阈值量。肿瘤生长速度也被建立。这些变化可以是特别有用的,如果比较是遗传修饰的细胞之间,以确定感兴趣的基因在肿瘤建立或生长速率的影响。用于监测粘附,生长速率,或肿瘤取的,细胞可转染报道基因,例如荧光素酶6。然而,一个重要的conside比为缺氧和坏死的生物发光信号29的影响。导管也可用于递送治疗剂。目前,我们正在使用原位模型来评估基因传递策略, 在体内环境。这种模式将有利于优化交付疗法,并确定其对肿瘤消退和生存的影响。
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Disclosures
作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院R21 CA143505克里斯蒂娜Voelkel - 约翰逊的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of reagent |
Company | Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories | Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
Trypsin* |
MediaTech | MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech | MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone | SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar | Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A | N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm | Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy | ||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy | ||
Catheters* |
Exel International | Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell | NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson | BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies | L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs | 1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
|
*available through multiple vendors |
|||
EQUIPMENT |
|||
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation | Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
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