Summary
Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.
Abstract
Nell'ultimo decennio, diverse popolazioni di cellule staminali adulte sono state identificate in pelle umana 1-4. L'isolamento di precursori multipotenti dermici adulti è stata riportata da F. Miller laboratorio D 5, 6. Questi primi studi hanno descritto una popolazione di cellule precursori multipotenti da adulto derma mammiferi 5. Queste cellule - SKPs denominati, per i precursori della pelle derivate - sono state isolate ed espanse da roditore e la pelle umana e differenziate in progenie sia neurale e mesoderma, compresi i tipi di cellule mai trovati in pelle, come i neuroni 5. Studi immunocitochimiche su SKPs coltura rivelato che le cellule esprimono vimentina e nestina, una proteina filamenti intermedi espressa in precursori neuronali e muscolari scheletriche, oltre a fibronectina e marcatori di cellule staminali multipotenti 6. Fino ad ora, le cellule staminali adulte SKPs di popolazione sono stati isolati da appena raccolti biopsie cutanee dei mammiferi.
ve_content "> Recentemente, abbiamo stabilito e riportato che una popolazione di cellule precursori della pelle derivate potrebbe rimanere presente nelle colture di fibroblasti primari stabiliti da biopsie cutanee 7. L'ipotesi che alcune cellule staminali somatiche potrebbero risiedere in colture di fibroblasti primari a raddoppi di popolazione iniziali era compatibili con i seguenti osservazioni: (1) SKPs e colture di fibroblasti primari sono derivate dal derma, e quindi un piccolo numero di cellule SKP potrebbero rimanere presente nelle colture di fibroblasti dermici primari e (2) colture primarie di fibroblasti coltivati da aliquote congelate che sono state sottoposti a temperatura sfavorevole durante la conservazione o il trasferimento conteneva un piccolo numero di cellule vitali che rimanevano 7. Queste cellule rare sono stati in grado di espandere e potrebbero essere diversi passaggi più volte. Questa osservazione suggerisce che un piccolo numero di cellule con elevata potenza proliferazione e resistenza alle sollecitazioni erano presenti in colture di fibroblasti umani 7.Abbiamo approfittato di questi risultati per stabilire un protocollo per il rapido isolamento di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti primari che sono prontamente disponibili presso le banche dei tessuti di tutto il mondo (Figura 1). Questo metodo ha un significato importante in quanto consente l'isolamento di cellule precursori quando i campioni di pelle non sono accessibili mentre colture di fibroblasti possono essere disponibili da parte delle banche dei tessuti, in tal modo, aprendo nuove opportunità per analizzare i meccanismi molecolari alla base di malattie genetiche rare e le malattie di modellazione in un piatto.
Protocol
1. Isolamento SKP da colture di fibroblasti primari
- Colture di fibroblasti o di banche di cellule o ottenuti direttamente da biopsie della pelle sono mantenute in coltura in crescita dei fibroblasti mezzo DMEM contenente 15% siero fetale di vitello, glutammina 2 mM, 10 mg / ml di penicillina e 10 mg / ml di streptomicina.
Fibroblasti umani GMO3349C e GMO8398A sono stati ottenuti dal Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) e sono stati utilizzati in questo studio.
- Culture di raddoppi di popolazione (PPD), da 20 a 35 sono stati utilizzati per colture SKP ad una confluenza del 80%. Un 10 centimetri tessuto cultura piatto (BD Falcon) contiene circa 1.5x10 6 celle.
- Lavare le cellule con PBS e incubare con 2 ml di soluzione di tripsina (0,25%, Invitrogen) per 1 ora a 37 ° C.
- Raccogliere le cellule dalla piastra con 5 ml di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo falcon 15 ml.
- Incubare le cellule a 4 ° C per 24 hr.
- Preparare terreno di crescita SKP consistente di DMEM-F12, 03:01 (V / V) e 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml di EGF (BD Biosciences), B27 siero supplemento libero 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) e 25 micron / ml di gentamicina (Invitrogen).
- Agglomerare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare direttamente in 4 ml SKP mezzo di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale 25 centimetri 2 (BD Falcon).
- Incubare il matraccio a 37 ° C e monitorare la cultura per la formazione sfera giorno per 3 a 4 settimane.
2. Sfera Culture Condizioni
- Cellule di coltura in una beuta 2 25 cm (BD Falcon) a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Agitare il matraccio vigorosamente giorno per evitare cellule di aderire al fondo del pallone. Se necessario, pipettare su e giù con una pipetta sterile 2 ml per staccare cellule aderenti e trasferire la cultura di un pallone nuovo.
- Prime sfere iniziano a costruire entro 3 to 4 giorni.
- Lasciare sfere sedimenti sul fondo del pallone e il cambiamento metà del mezzo ogni 3 giorni. Per mantenere la stessa concentrazione finale di fattori di crescita aggiungere fattori di crescita 2X alla SKP terreno di coltura preparati al momento.
- Tenere il volume costante massimo 4 ml.
- Quando sfere raggiungono una dimensione di ~ 200 millimetri dovrebbero essere diversi passaggi rompendo le sfere di piccole dimensioni di vigorosa pipettando su e giù con una pipetta 2 ml.
- La cultura è diviso in due 25 centimetri 2 boccette (BD Falcon) e sfere culture sono alimenti come descritto al punto 2.4).
- Sfere sono raccolti per marcatori di cellule staminali di screening per giorno da 16 a 21.
La procedura da 2.6) e 2.7) descrive la propagazione delle sfere a (1) permette di nutrienti e fattori di crescita compresi nel SKP medie di accedere a tutte le cellule all'interno di ogni sfera e (2) per espandere la cultura sfera SKP prima dell'uso.
Tipicamente culture sfera sotto i nostri cucondizioni lture mantengono la capacità di crescere su un periodo di tre mesi e sono diversi passaggi da 3 a 4 volte.
3. Immunocitochimica di marcatori di cellule staminali
- Culture Sphere sono raccolte in PBS da giorno 16 al 21. Le culture sono pellettato a 1.000 rpm per 5 min.
- Sfere sono risospese in un piccolo volume di PBS.
- Disegnare due cerchi con una penna DAKO di circa 0,5 micron di diametro su vetrini da microscopio (marchio Fisher).
- Aggiungere 50 ml di sospensione sfera in circoli.
- Controllare al microscopio ottico per la presenza di sfere in ciascuna goccia.
- Lasciate asciugare le gocce sotto il cofano.
- O congelare i vetrini a -80 ° C oppure procedere con il protocollo di colorazione immunofluorescenza.
- Per immunofluorescenza, fissare i vetrini con metanolo precedentemente raffreddata (100%) a -20 ° C per 10 min.
- Lavare i vetrini con PBS.
- Bloccare le diapositive con PBS/10% di siero fetale bovino / 0.02% Triton X100per almeno 1 ora.
- Incubare con anticorpo primario (ad esempio anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, gli anticorpi anti-Nanog, tabella 3) diluito in tampone di bloccaggio: PBS/10% FBS per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Lavare 3 volte con tampone di arresto e incubare con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con il blocco tempi di buffer e 3 con PBS.
- Mount diapositive con Vectashield montaggio medium (Vector Inc.).
- Analizzare i campioni per l'espressione di marcatori di cellule staminali mediante microscopia di immunofluorescenza.
4. L'analisi PCR in tempo reale dei livelli di espressione di marcatori di cellule staminali
- Prendete circa 2-3 ml culture Sfera da giorno 18 a 21.
- Pellet le sfere a 1200 rpm per 5 minuti e aspirare tutte di media.
- Isolare RNA dalle sfere utilizzando il Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
- Valutare la purezza dell'RNA mediante spettrometria e gel. </ Li>
- Sintetizzare cDNA (Omniscript trascrittasi inversa (Qiagen)) con il totale di RNA cellulari come modello.
- Convalidare i marcatori di cellule staminali da Realtime-PCR utilizzando i primer per marcatori di cellule staminali (indicata nella Tabella 1) in un Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems), con una concentrazione di 375 nM di ciascun primer e 50 ng di template in un 20 l volume di reazione. GAPDH è utilizzato come controllo endogeno.
- Per l'amplificazione utilizzare un denaturazione iniziale a 95 ° C per 2,5 minuti seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 5 sec e 60 ° C per 20 sec.
- Analizza la corsa con il 2 (ΔΔCt) Metodo 8.
5. Differenziazione Regia in cellule muscolari lisce
- Sfere da giorno 21 al 26 sono stati placcati in 6 piatti della cultura e (BD Falcon) in SKP medie.
- Le cellule sono stati autorizzati ad aderire e diventare troppo grande dalle sfere in media SKP per 72 ore.
- Cellule muscolari lisce (SMC) differenzianteione iniziato avviato dal sostituito il mezzo con SMC terreno di differenziamento costituito alta glucosio di Dulbecco Modified Eagle Medium (Invitrogen) contenente il 5% FBS, 5 ng / ml di PDGF-BB (Invitrogen), e 2,5 ng / ml di TGF-b1 (Invitrogen) .
- Mezzo è stato cambiato ogni 3 giorni con appena preparato terreno di differenziamento SMC per un periodo di 3 a 4 settimane in culture.
- Lo screening per i marcatori SMC è stata eseguita dopo 3 o 4 settimane di immunoistochimica.
- Cellule sono state fissate con soluzione di paraformaldeide 4% in PBS per 10 min.
- Le cellule sono state permeabilizzate con PBS contenente 0,3% Triton X-100 per 30 min.
- Le cellule sono state incubate con anticorpi contro αSMA (MO851, Dako, 1:100), oppure calponina (M3556, Dako, 1:100) per 1 ora a temperatura ambiente e successivamente trattati come descritto in 3.12) a 3.15).
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Representative Results
Si dimostra che una popolazione di cellule che selettivamente si espandono per generare sfere SKP sotto condizione di una crescita controllata, comprensivi di EGF e FGF2 sono presenti in colture di fibroblasti cutanei primari (figura 1), come abbiamo riportato di recente 7.
Colture di fibroblasti da PPD 15 e 25 che in genere corrispondono ai fibroblasti primari ceppi disponibili da banche di cellule sono stati utilizzati in questo studio. Colture di fibroblasti sottoposti al doppio trattamento consistente in un trattamento freddo con nutrimento esaurimento per 24 ore descritto nel presente metodo riproducibile culture generate contenenti sfere galleggianti (indicato anche come embryoid EB corpo) che condividono caratteristiche di crescita analogo a quello precedentemente descritto per SKPs derivate direttamente da campioni di pelle 7, 9.
Qui mostriamo che con il metodo che abbiamo recentemente riportato 7, isoliamo una popolazione di cells da colture primarie di fibroblasti che presentano proprietà simili alle cellule staminali / precursori neurali multipotenti, isolato e identificato nel derma umano e di topo usando condizioni di coltura neurosfere 5, 10, 11. Questi SKP-derivato da colture primarie di fibroblasti umani mostrano auto-rigenerante potenza in quanto possono essere ampliati e diversi passaggi per almeno un periodo di tre mesi in vitro (fare riferimento alla sezione metodo). Quando sfere raggiunto una dimensione di 150 a 200 micron di diametro dopo 18 a 21 giorni in coltura, sono stati meccanicamente suddivisi in una media di 50 micron di diametro e lasciati riespandere in coltura in sospensione in mezzo SKP. Queste sfere rotte verso il basso è stato permesso di crescere fino a raggiungere 200 micron prima di essere diversi passaggi di nuovo come descritto nella sezione Metodo. SKP sfere potrebbero essere diversi passaggi almeno tre volte. Questa osservazione indica che le cellule all'interno delle sfere erano capaci di auto rinnovarsi ed espandersi in condizioni di coltura o come neurosferedri e abbiamo riportato 5, 7.
Inoltre, queste cellule SKP derivati da colture di fibroblasti espresso cresta neurale e neurone di cellule staminali marcatore nestin così come la cellule staminali embrionali fattori di trascrizione Nanog e Oct4 e il marcatore di superficie delle cellule pluripotenti TG30 (Figura 2), in modo simile al SKP derivato direttamente dalla pelle biopsie 5, 7, 10. Immunoistochimica su SKP sfere indicato segnale positivo nestin nel citoplasma, 4 ottobre ha mostrato un segnale nucleare punteggiata e Nanog ha mostrato un segnale nucleare più diffusa (Figura 2). Inoltre, il marcatore di superficie cellulare di pluripotenti staminali embrionali umane cellule TG30 ha dato una colorazione positiva membrana citoplasmatica su SKP preparativi sfera (Figura 2). Utilizzando real time PCR, abbiamo anche confermato la presenza di mRNA codificante nestin e Oct4 in preparazione RNA isolato da sfere SKP raccolti dal giorno 18 in coltura (Figura 3 5,10. Per testare ulteriormente la multipotenza del SKP derivato da fibroblasti, abbiamo indotto queste cellule a differenziarsi in cellule muscolari lisce (Figura 4). Dopo 3 settimane di induzione in terreno contenente i fattori di crescita PDGF-BB e TGF-b1 12, immunocitochimica confermato l'espressione dei marcatori SMC, αSMA, calponin nelle SMC derivati da questi SKPs (Figura 4).
Collettivamente, questo metodo e risultati dimostrano che le sfere SKP isolati da colture di fibroblasti primari condividono proprietà simili a quelle derivate da biopsie cutanee e devono derivare da una popolazione di cellule staminali adulta residente nel derma della pelle umana.
| Nome | Entrez ID | Sequenza Primer | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4 ottobre | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabella 1. Elenco dei primer utilizzati per la real time PCR e qPCR.
| Anticorpo | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| anti-Nestin | CHEMICON | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 asino anti-coniglio IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 asino anti-topo IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 asino anti-topo IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 asino anti-coniglio IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabella 3. Elenco di origine anticorpi.
Figura 1. Isolamento di SKPs da colture di fibroblasti primari. Metodo per SKP cultura sfera partendo da colture primarie di fibroblasti dermici GMO3349C al passaggio 12 è delineato. Giorno 0 mostra la sospensione dei fibroblasti di partenza in SKP mezzo di crescita. Giorno 4 mostra la formazione sfera visibile. Giorno 17 mostra una tipica sfera SKP 3D. Barra della scala: 50 mm e 100 micron come indicato.arge.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Immunofluorescenza di sfere SKP derivati da colture di fibroblasti primari. Analisi di immunofluorescenza eseguita su SKPs derivati da colture di fibroblasti umani primari (GMO3349C). Sfera da giorno 16 sono stati depositati su vetrini da microscopio e colorate con anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 e anticorpi anti-Nanog come indicato. I nuclei sono stati di contrasto con un DNA macchia DAPI (blu). Barra della scala: 20 mm. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Cellule-derivato muscolari lisce da sfere SKP isolati da colture di fibroblasti primari. SKP-sfere derivate da fibroblasti primari sono stati diretti a differenziarsi in cellule muscolari lisce (SMC). (A), per immagini con contrasto di fase ricapitolando le varie fasi della cultura dalla cultura sfera SKP alla differenziazione SMC (pannello superiore). (B) SMCs derivati da SKP sfere sono stati indicati per immunomacchiate marcatori SMC, α-smooth muscolo actina (αSMA) e calponina come indicato. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Utilizzando il metodo qui descritto, le cellule staminali cutanee naive possono essere isolati da colture di fibroblasti dermici primari. Usando questo approccio, abbiamo recentemente riportato l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti derivati da pazienti con una sindrome genetica rara, di Hutchinson-Gilford progeria sindrome 7. Come mostrano qui quei precursori cellule esprimono marcatori di cellule staminali sono in grado di auto-rinnovamento e possono essere indirizzate a differenziarsi in diverse linee cellulari tra cui fibroblasti e cellule muscolari lisce (si veda la Figura 4 da Wenzel et al., 2012) 7. Questo metodo offre diversi vantaggi per il metodo precedentemente riportato per l'isolamento di SKPs da campioni di pelle di mammifero 10. SKP può essere isolato da colture primarie di fibroblasti che sono o appena stabiliti da biopsie cutanee o da colture primarie di fibroblasti già esistenti e può essere ottenutodalle banche di cellule di tutto il mondo. Questo nuovo approccio offre la possibilità di studiare l'implicazione di cellule staminali adulte nella patogenesi di diverse malattie genetiche e rare per le quali campioni di pelle non sono immediatamente disponibili. Infine, questo metodo fornisce una finestra di opportunità per esplorare la biologia delle cellule staminali adulte e sezionare il loro impatto durante lo stato fisiologico e la malattia. In conclusione, questo approccio offre un modo nuovo e rapido per isolare la pelle cellule precursori derivati.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt (5090371), la Christine Kühne Center for Allergy Research and Education (CK-CARE), e la Bayerischen Staatsministerium (a KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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