Summary
אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.
Abstract
במהלך העשור האחרון, מספר אוכלוסיות תאי גזע בוגרים זוהו בעור אנושי 1-4. הבידוד של מבשרי עור מבוגרים multipotent דווח לראשונה על ידי מילר פ D מעבדה 5, 6. מחקרים המוקדמים אלה תאר אוכלוסיית תאי מבשר multipotent מהדרמיס יונקים בוגרים 5. תאים אלה - SKPs כינה, למבשרי עור נגזרים - היו מבודדים והתרחבו ממכרסמים ועור אנושי ומובחן לצאצאים הן עצביים וmesodermal, כולל סוגי תאים לא נמצאו בעור, כגון תאי עצב 5. מחקרי immunocytochemical על SKPs תרבית גילו כי תאים הביעו vimentin וnestin, חלבון נימה ביניים באו לידי ביטוי בשרירי מבשרי עצבים ושלד, בנוסף לפיברונקטין וסמני תאי גזע multipotent 6. עד עכשיו, את SKPs אוכלוסיית תאי גזע הבוגרים היו מבודד מביופסיות עור יונקים טריים שנאספו.
ve_content "> לאחרונה, הקמנו ודיווחתי כי אוכלוסייה של תאים מבשר נגזרים עור יכולה להישאר קיימת בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות שנקבעו מביופסיות עור 7. ההנחה שכמה תאי גזע הסומטיים אולי מתגוררים בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות באוכלוסיית הכפלות הייתה מוקדמות בהתבסס על תצפיות אלה: (1) SKPs ותרבויות פיברובלסטים העיקריות נגזרים מדרמיס, ולכן מספר קטן של תאי SKP יכול להישאר קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי הראשוני ו( 2) תרבויות פיברובלסטים ראשוניות גדלו מ aliquots הקפוא שהיו נתון שלילי הטמפרטורה במהלך אחסון או ההעברה הכיל מספר קטן של תאים שנותרו קיימא 7. תאים נדירים אלה היו מסוגלים להרחיב ואפשר היה passaged מספר פעמים. תצפית זו הציעה כי מספר קטן של תאים עם עוצמה התפשטות גבוהה והתנגדות ללחץ היו קיימים בתרבויות האנושיות פיברובלסטים 7.אנחנו ניצל את הממצאים אלה להקמת פרוטוקול לבידוד מהיר של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים העיקריות הזמינים בקלות מבנקי רקמות ברחבי העולם (איור 1). לשיטה זו משמעות חשובה שכן היא מאפשרת בידוד של תאים מבשר כאשר דגימות עור אינן נגישים תוך תרבויות פיברובלסטים עשויות להיות זמינות מבנקי רקמות, ובכך, פותחות הזדמנויות חדשות לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות גנטיות נדירות כמו גם מחלות בדוגמנות מנה.
Protocol
1. בידוד SKP מתרבויות פיברובלסטים הראשוניים
- תרבויות פיברובלסטים או מבנקים או תאים המתקבלים ישירות מביופסיות עור נשמרות בתרבות בפיברובלסטים צמיחת מדיום DMEM המכיל 15% עוברי עגל בסרום, גלוטמין 2 מ"מ, 10 מ"ג / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין מ"ל 10 מ"ג /.
אדם fibroblasts GMO3349C וGMO8398A התקבלו מהמכון למחקר רפואי Coriell (קמדן, ניו ג'רזי) ושמשו במחקר זה.
- תרבויות מהכפלות אוכלוסייה (קובצי PPD) 20 עד 35 שמשו לתרבויות SKP בconfluency של 80%. צלחת אחת 10 ס"מ תרבות רקמות (BD פלקון) מכילה כ 1.5x10 6 תאים.
- שטוף תאים עם PBS ו דגירה עם פתרון 2 מיליליטר טריפסין (0.25%, Invitrogen) במשך שעה 1 ב 37 ° C.
- איסוף תאים מהצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהעביר את ההשעיה תא צינור פלקון 15 מ"ל.
- דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- הכן את מדיום גידול בהיקף SKP של DMEM-F12, 3:01 (V / V) ו40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 סרום תוסף חינם 2% (Invitrogen), 1 מיקרוגרם / מ"ל Fungizone (Invitrogen) ו25 מיקרומטר / מיליליטר gentamycin (Invitrogen).
- גלולה התאים ב -1,200 סל"ד במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה באופן ישיר ב4 מדיום גידול SKP מ"ל. מעבירים את ההשעיה התא לבקבוק 25 ס"מ 2 תרבית רקמה (BD פלקון).
- דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ולנטר את התרבות להיווצרות כדור ביום למשך 3 עד 4 שבועות.
2. תנאי תרבות Sphere
- תרבות תאים בסנטימטר 2 בקבוק 25 (BD פלקון) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לנער את הבקבוק מדי יום במרץ כדי למנוע תאים לדבוק בחלקו התחתון של הבקבוק. במידת צורך, פיפטה מעלה ומטה עם פיפטה סטרילית 2 מ"ל לנתק את התאים חסיד ולהעביר את התרבות לבקבוק חדש.
- ספירות הראשונות להתחיל לבנות תוך 3 to 4 ימים.
- בואו תחומי משקעים לתחתית בקבוק ושינוי מחצית בינונית כל 3 ימים. כדי לשמור על אותו הריכוז הסופי של גורמי גדילה להוסיף גורמי גדילת 2X למדיום גידול SKP מוכן טרי.
- שמור על הנפח קבוע מרבי 4 מ"ל.
- כאשר התחומים להגיע לגודל של 200 מ"מ ~ הם צריכים להיות passaged על ידי פירוק הכדורים לגודל קטן יותר על ידי נמרץ pipetting למעלה ולמטה עם 2 מ"ל פיפטה.
- התרבות מחולקת לשני 25 ס"מ 2 צלוחיות (BD פלקון) ותרבויות כדורים הן להאכיל כמתואר בשלב 2.4).
- התחומים נאספים לסמני תאי גזע הקרנה על ידי 16 עד 21 יום.
ההליך מ2.6) ו2.7) מתאר את ההתפשטות של הספירות ל (1) מאפשר nutriments וגורמי צמיחה במסגרת מדיום SKP לגשת לכל התאים בתוך כל תחום ו( 2) להרחיב את תחום תרבות SKP לפני שימוש.
בדרך כלל תרבויות Sphere תחת מ"ק שלנותנאי lture לשמור את היכולת לגדול על פני תקופה של שלושה חודשים והם passaged בין 3 עד 4 פעמים.
3. Immunocytochemistry עבור סמני תאי גזע
- תרבויות Sphere נקצרים בPBS על ידי 16 עד 21 יום. תרבויות הן pelleted ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות.
- התחומים הם resuspended בנפח קטן של PBS.
- צייר שני עיגולים עם עט DAKO של כ 0.5 מיקרומטר קוטר בשקופיות מיקרוסקופ (מותג פישר).
- הוסף 50 μl של השעיה כדור לעיגולים.
- בדקו על ידי מיקרוסקופ אור לנוכחות של תחומים בכל טיפה.
- תן את טיפות יבשה מתחת למכסת המנוע.
- כך או להקפיא את השקופיות ב -80 ° C או להמשיך עם הפרוטוקול מכתים immunofluoresence.
- למכתים immunofluorescence, לתקן את השקופיות עם מתנול מראש מקורר (100%) ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- שטוף את השקופיות עם PBS.
- לחסום את השקופיות עם PBS/10% בסרום שור עוברי / 0.02% X100 טריטוןבמשך שעה לפחות 1.
- דגירה עם נוגדן ראשוני (למשל נוגדנים נגד Nanog אנטי Nestin, אנטי Oct4, אנטי TG30,, לוח 3) דילול בחסימת המאגר: PBS/10% FBS במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
- לשטוף 3 פעמים עם חסימת חיץ ודגירה עם נוגדנים משני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- לשטוף 3 פעמים עם חסימת פעמים חיץ ו3 עם PBS.
- שקופיות הר עם Vectashield הרכבה בינונית (וקטור Inc).
- ניתוח דגימות לביטוי של סמנים בתאי גזע על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.
4. ניתוח PCR בזמן אמת של רמות ביטוי של סמני תאי גזע
- קח כ 2-3 תרבויות Sphere מ"ל מיום 18 עד 21.
- הגלולה בתחומי 1,200 סל"ד במשך 5 דקות ולשאוב כל המדיום.
- בודד RNA מן הספירות באמצעות Minikit RNeasy (Qiagen, ולנסיה, קליפורניה).
- להעריך את טוהר הרנ"א על ידי ספקטרומטריית וagarose ג'ל. </ P>
- לסנתז cDNA (רברס טרנסקריפטאז Omniscript (Qiagen)) באמצעות רנ"א הכל הסלולרי כתבנית.
- לאמת את הסמנים בתאי גזע על ידי שימוש בזמן אמת פריימרים-PCR לסמני תאי גזע (שמוצג בטבלה מס '1) בכוח SYBR גרין PCR mastermix (יישומי Biosystems) עם ריכוז של 375 ננומטר של כל צבע יסוד ו50 ng של תבנית ב20 μl עוצמת תגובה. GAPDH משמש כשליטת אנדוגני.
- להגברת שימוש denaturation ראשונית על 95 מעלות צלזיוס במשך 2.5 דקות ואחרי 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות.
- לנתח את הריצה עם 2 שיטה (ΔΔCt) 8.
5. בידול מכוון לתאי שריר חלק
- ספירות מהיום 21-26 היו מצופה ל -6 מנות התרבות גם (BD פלקון) במדיום SKP.
- תאים הורשו לדבוק ולהיגמל מהתחומים במדיום SKP עבור 72 שעות.
- תאי שריר חלק (SMCs) differentiatיון התחיל ביוזמת הוחלף בינוניות עם בינוני בידול SMC המורכב גבוה גלוקוז שונה Dulbecco נשר הבינוני (Invitrogen) המכיל 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), ו -2.5 TGF-B1 ng / ml (Invitrogen) .
- מדיום הוחלף כל 3 ימים עם מוכן טרי בינונית בידול SMC לתקופה של 3 עד 4 שבועות בתרבויות.
- הקרנה עבור סמני SMC בוצעה לאחר 3 עד 4 שבועות על ידי אימונוהיסטוכימיה.
- תאים היו קבועים עם פתרון paraformaldehyde 4% ב-PBS למשך 10 דקות.
- תאים היו permeabilized עם PBS המכיל 0.3% טריטון X-100 למשך 30 דקות.
- תאים הודגרו עם נוגדנים נגד αSMA (MO851, Dako, 1:100), או calponin (M3556, Dako, 1:100) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר ומעובד יותר, כמתואר ב3.12) ל3.15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מראים כי אוכלוסייה של תאים באופן סלקטיבי כדי ליצור הרחבת תחומי SKP בתנאי גידול מבוקרים בהיקף של EGF וFGF2 קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני (איור 1) כפי שדיווחנו לאחרונה 7.
תרבויות פיברובלסטים מקובצי PPD 15 עד 25, כי בדרך כלל מתאימה לזני fibroblasts הזמינים העיקריים מבנקים סלולריים ששימשו במחקר זה. תרבויות פיברובלסטים שהוגשו לטיפול זוגי הכולל טיפול בטמפרטורה קרה יחד עם דלדול רות למשך 24 שעות שתוארו בשיטה זו נוצרו תרבויות reproducibly המכילים כדורים צפים (המכונה גם בגוף embryoid EB) חולקים מאפייני צמיחה דומים לזו שתוארו קודם לכן לSKPs נגזר ישירות מדגימות עור 7, 9.
כאן אנו מראים כי שימוש בשיטה שדיווחנו לאחרונה 7, אנחנו בודד אוכלוסייה של לסה"נlls מתרבויות פיברובלסטים ראשוניים כי תערוכת מאפיינים דומים לתאי הגזע / מבשר העצביים multipotent, מבודדת וזיהה בדרמיס האנושי ועכבר באמצעות תנאי neurosphere תרבות 5, 10, 11. אלה SKP-נגזרים מתרבויות פיברובלסטים האנושיות העיקריות להראות עוצמה עצמי חידוש כפי שהם יכולים להיות מורחבים וpassaged לפחות תקופה של שלושה חודשים במבחנה (עיין בסעיף שיטה). כשהגיעו לתחומי גודל של 150 עד 200 מיקרומטר בקוטר לאחר 18 עד 21 ימים בתרבית, הם היו שבורים למטה לתוך מכאני ממוצע של 50 מיקרומטר בקוטר ואפשרו מחדש להרחיב בתרבות השעיה במדיום SKP. התחומים מקולקלים אלה הורשו לגדול עד שהגיעו 200 מיקרומטר לפני שpassaged שוב כפי שתואר בסעיף שיטה. אפשר היו passaged תחומי SKP לפחות שלוש פעמים. תצפית זו מצביעה על כך שתאים בתוך הספירות היו מסוגלים לחדש את עצמו ולהרחיב בתנאי תרבות neurosphere כOthers ודיווחנו 5, 7.
יתר על כן, תאי SKP אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים הביעו רכס עצבי וnestin נוירון בתאי גזע סמן כמו גם תאי הגזע העוברי שעתוק הגורמים Nanog וOct4 ומשטח סמן תא pluripotent TG30 (איור 2), באופן דומה לSKP נגזר ישירות מעור ביופסיות 5, 7, 10. אימונוהיסטוכימיה בתחומי SKP הצביעה איתות חיובית nestin בציטופלסמה, אוק 4 הציג אות גרעינית מנוקדת וNanog הראה אות גרעינית מתפזרת יותר (איור 2). בנוסף, הסמן פני התא של pluripotent תאי גזע העוברי האנושי TG30 נתן מכתים קרום cytoplasmic חיובית על הכנות כדור SKP (איור 2). באמצעות PCR בזמן אמת, אנחנו גם אישר את נוכחותו של mRNAs הקידוד nestin וOct4 בהכנת רנ"א מבודדת מתחומי SKP שנאספו על ידי ביום 18 בתרבות (איור 3 ו5,10 ביופסיות עור אדם. כדי לבחון עוד יותר את multipotency של SKP נגזר מתרבויות פיברובלסטים, שגרמנו לתאים אלה להתמיין לתאי שריר חלק (איור 4). לאחר שבועות אינדוקציה 3 במדיום המכיל את גורמי גדילת PDGF-BB וTGF-B1 12, immunocytochemistry אישר את הביטוי של סמני SMC, αSMA, calponin בSMCs נגזר מSKPs אלה (איור 4).
באופן קולקטיבי, וממצאי שיטה זו מראים כי תחומי SKP שבודדו מתרביות פיברובלסטים ראשוניות חולקים מאפיינים דומים לאלה שנגזרים מביופסיות עור וחייבים לנבוע מאוכלוסיית תאי גזע בוגרים המתגוררת בתוך הדרמיס העור האנושי.
| שם | Entrez מזהה | רצף פריימר | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | ה-F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 נ"ב |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | ה-F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 נ"ב |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4 באוקטובר | 5460 | ה-F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 נ"ב |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
טבלת מס '1. רשימה של פריימרים המשמשים לPCR בזמן אמת וqPCR.
| נוגדן | חברה | מספר קטלוג | תגובות |
| אנטי Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| אנטי Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| אנטי TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| אנטי Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| אנטי αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| אנטי Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| אלקסה פלואוריד; 555 החמור נגד ארנב IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| אלקסה פלואוריד; 555 חמור אנטי עכבר IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| אלקסה פלואוריד; 488 חמור אנטי עכבר IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| אלקסה פלואוריד; 488 חמור נגד ארנב IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
לוח 3. רשימה ממוצא נוגדנים.
איור 1. בידוד של SKPs מתרבויות פיברובלסטים ראשוניים. השיטה לתרבות SKP תחום החל מתרבויות פיברובלסטים עורי הראשוני GMO3349C בחלוף 12 הוא התווה. יום 0 מראה את ההשעיה פיברובלסטים מתחילה במדיום גידול SKP. יום 4 מראה היווצרות תחום גלויה. יום 17 מציג תחום SKP 3D טיפוסי. בר סולם: 50 מ"מ וכפי שצוין 100 מיקרומטר.arge.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. מכתים immunofluorescence תחומים SKP הנגזרים מתרבויות פיברובלסטים הראשוניות. ניתוח Immunofluorescence בוצע על SKPs נגזר מתרבויות פיברובלסטים הראשוניות האנושיות (GMO3349C). תחום מהיום 16 הופקדו על שקופיות מיקרוסקופ ומוכתם בנוגדנים נגד Nanog אנטי Nestin, אנטי TG30, אנטי Oct4 וכפי שצוין. גרעינים היו counterstained עם ה-DNA DAPI כתם (כחול). בר סולם:. 20 מ"מ לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. תאי שריר חלק, נגזר מתחומי SKP שבודדו מתרביות פיברובלסטים ראשוניות. SKP-תחומים הנגזרים מfibroblasts העיקרי הופנו להתמיין לתאי שריר חלק (SMCs). (א) בניגוד שלב הדמיה משחזרת את פעולות התרבות שונות מתרבות כדור SKP לבידול SMCs (פנל העליון). (ב) SMCs נגזר מתחומי SKP היה immunostained לסמני SMC ציינו, α-סמוטשעות השריר אקטין (αSMA) וcalponin כפי שצוינו. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש בשיטה המתוארת במסמך זה, ניתן לבודד תאי גזע עורי נאיבי מתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני. שימוש בגישה זו, לאחרונה דיווחו בידוד והאפיון של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים שמקורם בחולים עם תסמונת גנטית נדירה, האצ'ינסון-גילפורד progeria תסמונת 7. כמו להראות להלן הסמנים האלה מבשר תאים המפורשים בתאי גזע מסוגלים התחדשות עצמית ויכולים להיות מופנה להתמיין לסלולארי שושלות שונות כולל fibroblasts ותאי שריר חלק (עיין באיור 4 מוונצל et al., 2012) 7. שיטה זו מציעה מספר יתרונות לשיטה שדווחה בעבר לבידודה של SKPs מעור דגימות יונקים 10. יכול להיות מבודד מתרבויות SKP פיברובלסטים העיקריות שהם או שהוקמו זה עתה מביופסיות עור או מתרבויות פיברובלסטים הראשוניות שכבר קיימות וניתן להשיגמתא בנקים ברחבי העולם. גישה חדשה זו מציעה את האפשרות ללמוד את המשמעות של תאי גזע בוגרים בפתוגנזה של מחלות גנטיות שונות ונדירות עבורו דגימות עור אינן זמינות בקלות. לבסוף שיטה זו מספקת חלון ההזדמנויות לחקור ביולוגיה של תא גזע בוגרים ולנתח את ההשפעה שלהם במצב פיסיולוגי ומחלות. לסיכום גישה זו מציעה דרך חדשנית ומהירה לבודד תאים מבשר שמקורם בעור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן אלכסנדר פון הומבולדט (5090371), המרכז לחקר כריסטין Kühne אלרגיה וחינוך (CK-CARE), וStaatsministerium Bayerischen (לKD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
