Summary
وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من خلايا
Abstract
إزالة مسببات الأمراض الفطرية من أكلة، والكائنات الحية الدقيقة بصورة عامة، يمكن اعتبار أن تتكون من أربع مراحل متميزة: (ط) من الهجرة البالعات إلى موقع حيث توجد الكائنات الممرضة، (الثاني) الاعتراف الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) من خلال نمط مستقبلات الاعتراف (PRRs)، (الثالث) من الكائنات الحية الدقيقة الإحاطة منضمة إلى غشاء الخلية بلعمية، و (رابعا) من الخلايا المعالجة اجتاحت داخل phagosomes النضج والهضم للجسيمات بلعها. تقييم الدراسات التي البلعمة في مجملها هي برامج إعلامية 1، 2، 3، 4، 5 لكنها محدودة من حيث أنها لا كسر عادة أسفل إلى عملية الابتلاع، والهجرة ونضوج يبلوع، والتي قد تتأثر بشكل مختلف. وعلاوة على ذلك، مثل هذه الدراسات تقييم امتصاص كحدث واحد، بدلا من أن تكون عملية ديناميكية مستمرة. وقد وضعنا مؤخرا المتقدمة تقنيات التصوير الخلية الحية، وتضافرت هذه مع التحليل الوظيفي لكلا الوراثيةالممرض والمضيف الخلايا لخلق منصة متعددة التخصصات لتحليل الفطرية وظيفة الخلايا المناعية الفطرية والمرضية. وقد كشفت هذه الدراسات جوانب من رواية البلعمة أنه لا يمكن ملاحظتها باستخدام التحليل الزمني المنتظم للتفاعلات الجزيئية والخلوية بين البالعات الإنسان ومسببات الأمراض الفطرية والكائنات الدقيقة المعدية بشكل عام. على سبيل المثال، بدأنا لتحديد ما يلي: (أ) مكونات سطح الخلية المطلوبة لكل مرحلة من مراحل عملية الابتلاع، والاعتراف وقتل الخلايا الفطرية 1، 6، 7، 8، (ب) الهندسة سطح كيف يؤثر على كفاءة امتصاص البلاعم وقتل الخميرة والخلايا خوطي 7؛ و (ج) كيف الإحاطة يؤدي إلى تغيير في دورة الخلية وسلوك الضامة 9 و 10.
وعلى النقيض من واحد لقطات نقطة زمنية، ويعيش خلايا المجهري الفيديو تمكن مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض التي يتعين دراستها كما شاركntinuous متواليات على مدى فترات زمنية طويلة، وتوفير المعلومات المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والنسخ والاتجار حويصلي. نحن هنا وصف بالتفصيل كيفية إعداد المضيف والخلايا الفطرية، وإجراء التجارب المجهري الفيديو. يمكن توفير هذه الأساليب من قبل المستخدم دليل للدراسات المستقبلية مع البالعات الأخرى والكائنات الحية الدقيقة.
Protocol
1. C. البيض النمو والشروط
- إعداد لوحات أجار SC-أورا بإضافة 6،9 النيتروجين ز الخميرة دون قاعدة الأحماض الأمينية، 1 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم، 10 مل 1٪ (W / V) الأدينين الملح hemisulphate و 20 ز أغار التقنية (التي سبق وصفها بالتفصيل في 11). تشكل إلى 900 مل حجم المقطر مع O. 2 H الأوتوكلاف، والسماح لتبرد أجار، ولكن ليس بما يكفي لترسيخ، ثم قم بإضافة 50 مل العقيمة 40٪ D-غلوكوز و 50 مل العقيمة 4٪ التسرب SC-أورا في ظل ظروف معقمة. خلط، تصب في أطباق بتري ويترك ليبرد لوحات أجار ويصلب. لوحات أجار المحل في 5 ° C حتى الاستخدام.
- خط C. البيض النمط المصلي A + سلالة CAI4 CIp10 من المخزونات الجلسرين تخزينها في -80 درجة مئوية إلى لوحة أجار SC-أورا.
- احتضان لوحة في 30 ° C حتى شكل مستعمرات وتخزينها في 5 ° C.
- ثقافة واحدة C. البيض مستعمرة في 5 المتوسطة SC-أورا مل (كما هو الحال في وصفة 1.1، ولكن من دون أجار التقنية) واحتضان بين عشية وضحاها في 30° C، 200 دورة في الدقيقة لتوليد ثابتة C. المرحلة البيض.
2. C. البيض تلوين باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC)
- إضافة 10 ميكرولتر C. البيض الثقافة بين عشية وضحاها إلى 990 ميكرولتر PBS (درجة الحموضة 7.4) وتنفيذ عدد خلايا باستخدام haemocytometer.
- لمساعدة التصور من C. البيض خلال فحوصات البلعمة، وصمة عار 1 × 10 8 C. البيض باستخدام 1 ملغ / مل في FITC 0،05 العازلة كربونات بيكربونات-M (الرقم الهيدروجيني 9.6) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- لإزالة FITC غير منضم، وغسل C. البيض في 1 مل PBS × 1، الطرد المركزي في 3،000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف بيليه وresuspend في 1 مل PBS × 1. كرر 3 مرات.
- إعادة تعليق بيليه في 1 × 10 6 خلية / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني × 1.
3. إعداد الخط الخليوي ماوس J774.1 البلاعم
- الحفاظ على J774.1 الضامة الأنسجة في 75 2 سمقوارير الثقافة في المتوسطة DMEM تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 200 U / مل البنسلين / الستربتوميسين و2 مم L-الجلوتامين في 37 ° C مع 5٪ CO 2. يوصف إعداد الضامة الأساسي في أي مكان آخر في التفاصيل 12 و 13.
- تتخلص الخلايا من J774.1 الأنسجة قارورة الثقافة ونقلها إلى أنبوب 50 مل الصقر. الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية.
- إزالة طاف بيليه وresuspend في 10 مل قبل تحسنت المتوسطة DMEM تستكمل. عد الخلايا باستخدام لوحة haemocytometer و1 × 10 6 J774.1 الضامة في 2 مل تستكمل DMEM المتوسطة في طبق زجاج 35 مم التصوير مقرا لها. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- قبل التصوير، واستبدال تستكمل DMEM المتوسطة مع 2 مل قبل تحسنت تستكمل CO 2-المستقلة المتوسطة (مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 200 U / مل البنسلين / الستربتوميسين و2 مم L-الجلوتامين) تحتوي على 1 ميكرومتر الأحمر LysoTracker DND-99.
4. فيديو حية مجهرية الخلية البلعمة الفحص
- اختيار المجهر سوف تعتمد على ما هو متوفر محليا، ولكن الإعداد المجهر سوف تحتاج إلى تضمين مرحلة مقلوب، وغرفة البيئية تسخينها إلى 37 درجة مئوية والإثارة / الانبعاثات المرشحات لاختيار البقع (FITC وTRITC).
- تشغيل المدفأة المجهر قبل التجربة وإتاحة الوقت الكافي لدائرة مراقبة البيئة الحارة إلى 37 ° C. فإن الوقت الذي يستغرقه لدرجة حرارة الغرفة لتحقيق الاستقرار تختلف عن الاجهزة المجهر مختلفة.
- بدوره على المجهر والكمبيوتر، وتحميل البرمجيات التصوير. تحميل طبق التصوير على المسرح المجهر وضبط التركيز للعثور على الضامة J774.1. تحسين مظهر الصور TRITC ومدينة دبي للإنترنت عن طريق ضبط نسبة الضوء المرسل والأوقات التعرض.
- إزالة الطبق التصوير وإضافة 3 × 10 6 FITC الملطخة C. البيض لرانه طبق. تسجيل الوقت الذي C. يضاف البيض إلى الطبق. إعادة الإناء لمرحلة وتحسين مظهر الصور FITC إذا لزم الأمر. إعداد قائمة نقاط إذا لزم الأمر.
- يبدأ التصوير عند كل نقطة في التركيز وهي الأمثل القنوات. القبض على FITC والصور وTRITC DIC كل دقيقة لمدة 6 ساعة.
Representative Results
هنا نعرض النتائج ممثل عن C. البيض امتصاص بواسطة خط الخلية الفئران البلاعم J774.1 خلال 6 ساعة الخلية الحية فيديو التجربة المجهري. الرقم 1 هو ممثل المجهري لقطات فيديو حية خلايا الفيلم، والتي تبين من البلعمة C. البيض من قبل الضامة J774.1 الفئران. الخلية الحية المجهري الفيديو تمكن من استيعاب C. البيض لتكون تصور من دون الحاجة إلى وصمة عار المبيضات الخارجية، ولكن خلال هذه التجارب، C. كانت ملطخة البيض باستخدام الصبغة درجة الحموضة حساسة FITC (الخضراء)، التي تطفئ خلال تحمض من يبلوع البلاعم، ويسهل تأكيد أنه تم المنضوية المبيضات (الشكل 1). لمزيد من المساعدات التصور C. بلعها كانت ملطخة البيض، الضامة باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر LysoTracker الأحمر DND-99، والتي البقع الحمضية وحجرات بمثابة علامة غير محددة من النضج يبلوع.الرقم 2 هو صورة ثابتة من تجربة الفيديو الحية المجهري خلايا ويوضح الاختلاف في عدد C. تناولها من قبل البيض الضامة J774.1 الفردية. في هذه التجربة، اجتاحت 82٪ من J774.1 الضامة واحد على الأقل C. البيض الخلية في نهاية الفحص البلعمة 6 ساعة. في، 3 الشكل عدد C. المنضوية وتفيد التقارير البيض خلايا البلاعم في. متوسط عدد C. تناول البيض في البلاعم هو 3.4، ولكن المثير للاهتمام الضامة يمكن استيعاب ما يصل إلى 16 الخلايا الفطرية. الشكل 4 هو سلسلة من الصور الثابتة من ممثل الخلية الحية فيديو التجربة المجهري يظهر البلاعم phagocytosing C. البيض الخلايا، خوط النمو مع البلاعم البلاعم وتحلل في نهاية المطاف. الشكل 4 يوضح أن المجهري الفيديو تمكن من تحليل الأحداث التالية الإحاطة من الخلايا المستهدفة، يمكن إنشاء أي بيانات لكيlling من قبل الضامة C. البيض خيوط فيما يتعلق بعدد والتشكل من الخلايا المستهدفة بلعها، وكيف قتل البلاعم يتعلق النضج يبلوع التي يمكن دراستها في الوقت الحقيقي.
الشكل 1. لايف خلايا فيلم فيديو يظهر الفحص المجهري البلعمة من C. البيض من قبل الضامة J774.1 الفئران. هي ملطخة الضامة باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر LysoTracker الأحمر DND-99، وC. هي ملطخة FITC باستخدام البيض (الخضراء). الضامة وC. وشارك في تربيتها البيض لمدة من 6 ساعة عند C ° 37 في CO 2-كاملة مستقلة المتوسط. تم التقاط الصور على فترات لمدة 6 دقيقة 1 ساعة. ويمكن رؤية الضامة إنشاء خلية اتصال مع خلايا C. البيض، والذي يليه ثم امتصاص C. البيض في phagosomes البلاعم. الأسهم تشير إلى C. البيض قبل الإحاطة التي كتبها J774.1 الضامة. هذا الفيديو يبين لنا أيضا أن مضان FITC هو quenc[هد] الإحاطة التالية C. البيض. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الشكل 2. المجهري الممثل لقطات فيديو حية خلايا تباين صورة ثابتة تظهر في عدد من كانديدا البيكانز اجتاحت الضامة الفردية. والضامة (الملون باستخدام LysoTracker الأحمر DND-99) شارك في تربيتها مع FITC الملطخة C. البيض (الخضراء). هناك تفاوت في عدد C. اجتاحت البيض (عدد القادم إلى سهم يشير إلى عدد البيض C. اجتاحت)، وفي C. البيض مورفولوجيا (أي الآيات الخميرة خوط). شريط النطاق، 20 ميكرومتر.
الشكل 3. الرسم البياني يوضح عدد C. بلعها البيض في الفئران البلاعم J774.1 في نهاية المقايسات البلعمة من 6 ساعة. البيانات تمثل 2 تجارب مستقلة. تم إحصاء ما مجموعه 100 الضامة من 3 حقول من كل تجربة، وإعطاء ما مجموعه 600 الضامة الفردية.
الشكل 4. سلسلة من الصور من ممثل الخلية الحية فيديو التجربة المجهري يظهر البلاعم (M) وC. البيض (C) قبل وأثناء الاعتراف (A، B)، وأثناء وبعد امتصاص (C، D). C. البيض خيوط تستمر في النمو داخل البلاعم (E، F)، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحلل البلاعم (G). ويتم تجنيد الضامة الأخرى إلى موقع تمزق ومحاولة لاستيعاب C. صدر البيض (H). هي ملطخة الضامة باستخدام الصبغة الحمراء الفلورسنت LysoTracكير الأحمر DND-99، وC. هي ملطخة FITC باستخدام البيض (الخضراء). ملاحظة أن تطفئ تلطيخ FITC بعد C. البيض امتصاص J774.1 الضامة (C). شريط النطاق، 10 ميكرومتر.
Discussion
هنا يتم وصف طريقة لاستخدام المجهر لقطات فيديو حية خلايا البلعمة لدراسة البلاعم. المجهر الفيديو يوفر طبقات متعددة من المعلومات الإضافية لتحليلها. واحد الميزة الأساسية هي أن البيانات يمكن أن تتولد امتصاص (من تجربة واحدة) عن أي نقطة زمنية خلال الفترة من 6 الملاحظة ساعة. الأهم من ذلك، يمكن وصف أسلوب التحليل التفاضلي للمراحل البلعمة الفردية. لدينا، على سبيل المثال، أظهرت أن التغيرات في امتصاص العام للC. يمكن البيض ارتباط بالغليكوزيل والمسوخ التشكل من خطوط الخلايا الضامة والبلاعم الأولية يكون إما نتيجة للتغيرات في الهجرة نحو البلاعم أو الخلايا المستهدفة معدل الإحاطة مرة واحدة خلية خلية الاتصال يتم تأسيس 7.
هناك عدد من لتجنب المزالق عند إجراء هذه التجارب. أولا، من المهم جدا لضمان الظروف البيئية المستقرة في جميع أنحاء اإلجراءات التجريبية dure. ويتحقق هذا أفضل في غرفة البيئية التي تم تعيينها للشروط التجريبية عدة ساعات قبل بدء التجربة. جودة الفيديو تعتمد اعتمادا كبيرا على وحدات متطورة ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تستخدم للحفاظ على عينة تلقائيا Z-موقف بغض النظر عن التغييرات الميكانيكية أو الحرارية وبالتالي القضاء على الحاجة إلى التركيز اليدوي التصحيحات.
نظرا لطبيعة ممتدة من التجارب، من المهم للحد من التعرض للضوء ليزر وما يرتبط بها من آثار وphotobleaching photoconversion، والتي يمكن أن يكون الحد الأدنى من خلال توظيف علامات الفلورسنت للغاية، والتي تسهل مرات التعرض المنخفضة. بروتوكول الموصوفة هنا تلطيخ FITC سريعة وموثوق بها. كما هو مطلوب FITC مشرق جدا ومستقرة وصمة عار، وأوقات التعرض المنخفضة وهذا ما يجعل مثالية للأفلام FITC الوقت الفاصل بين الموسعة. ومع ذلك، ونحن نستخدم بشكل روتيني مجموعة متنوعة من البقع المستهدفة المختلفة، بما في ذلك الأصباغ والأبيض Calcofluor PKH وكذلك الكائنات المفتاحية.
معشوقة = "jove_content"> ويجري معظم عملنا نشرت باستخدام مجهر اسعة المجال، ولكن يمكن التقليل من التعرض مزيد باستخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل وبين أيدينا هذا أمر ضروري لمرور الزمن المجهر الفيديو 3D.
خلال هذه الدراسة تم التقاط الصور على فترات أكثر من حد أدنى 1 مقايسة البلعمة 6 ساعة. ويمكن تعديل الفاصل الزمني بين الصور اعتمادا على عملية قيد التحقيق. على سبيل المثال، يمكن أن تنخفض الفاصل عند التحقيق السريع مثل عمليات الاتجار حويصلي. وستقتصر الفترة الزمنية الدنيا من المواصفات المجهر والكاميرا. هناك بعض الاعتبارات أن يوضع في الاعتبار عند تعديل توقيت. أولا، سوف تقليل الفاصل الزمني بين لقطات يعني ولا يمكن تصوير أقل نقطة وسيتم زيادة حجم الملف كبير. على العكس من ذلك، سوف زيادة الفاصل الزمني الصورة كثيرا جعل الفيلم يفقد الاستمرارية.
ويمكن تطبيق هذا النهجمن حيث المبدأ لدراسة مسببات الأمراض الأخرى وامتصاص الخلايا للموت المضيف. على سبيل المثال، لقد أظهرنا مؤخرا الذي يحمل تقلص إلى حد كبير نقي العظم الضامة المستمدة من الفئران التي تعاني من نقص sialoadhesin ملزمة والبلعمة من الصائمية العطيفة sialylated 8. ومع ذلك، حجم الهدف هو من العوامل الهامة للجدوى، وتحليل الصور يصبح من الصعب على نحو متزايد مع انخفاض في حجم الخلية المستهدفة. برامج متطورة تحليل الصور ضروري لتحليل الفيديو السريع المجهري، وينبغي أن يقترن هذا مع دعم المعلوماتية الحيوية المناسبة لتسهيل توليد خوارزميات لدراسة هجرة الخلايا الفردية والسكان الخلية بأكملها 7. الخلية الحية المجهري الفيديو في تركيبة متطورة مع صورة برامج التحليل لتحليل دقيقة تلو الدقيقة للهجرة والفردية التفاعلات البلاعم-كانديدا البيكانز، يقدم رؤية فريدة من نوعها في تعقيد C. البيض البلعمة من قبل macrophagوفاق. هناك إمكانات هائلة لتوسيع هذه الأساليب لدراسة مسببات الأمراض الأخرى والبالعات (الخلايا الجذعية، والعدلات) ووضع الفيديو إلى 3D المجهر التفاعلات الخلية خلية صورة بمزيد من التفصيل أو أكثر على الأسطح الفسيولوجية مثل طبقات الخلايا الظهارية والبطانية. هذه التقنية هي جزء من الجيل القادم من أدوات في دراسة المضيف الممرض التفاعلات وسوف يساعد على توليد معلومات مفصلة المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف. NG هو المستفيد من الدعم غير المحدود لمنح البحوث الأساسية من العلوم جلعاد. LE يعمل كمستشار لتطوير العقاقير GSK في وقت مبكر.
Acknowledgments
LPE هو زميل الاسكتلندي السريرية كبير ويعترف بدعم من مكتب كبير العلماء (SCD/03). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المشروع ويلكوم ترست المنح لLPE (089930). وقد تم تمويل المنح من قبل NARG ويلكوم ترست برنامج (080088) ومنحة معدات (075470) (للDeltaVision)، ومنحة FP7-2007-2013 (HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN). نود أن نشكر جامعة أبردين مرفق التصوير، في ماكينزي كيفن وجه الخصوص، للحصول على الدعم والمشورة مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
