Summary
Vi beskriver metoder för live-cell video mikroskopi av
Abstract
Fagocytisk clearance av svamppatogener och mikroorganismer i allmänhet, kan anses bestå av fyra distinkta faser: (i) migrering av fagocyter till den plats där patogener finns, (ii) erkännande av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) genom mönster erkännande receptorer (PRRS), (iii) omvälvning av mikroorganismer bundna till fagocytsystemet cellmembranet, och (iv) behandling av uppslukade celler i förfallande phagosomes och nedbrytning av intagna partikeln. Studier som utvärderar fagocytos i sin helhet är informativa 1, 2, 3, 4, 5 men är begränsade i att de normalt inte bryta processen ner i migration, omvälvning och fagosomen mognad, som kan påverkas differentiellt. Vidare, sådana studier bedömer upptag som en enda händelse, snarare än som en kontinuerlig dynamisk process. Vi har nyligen utvecklat avancerade levande cell imaging teknik och har kombinerat dessa med genetisk funktionell analys av bådepatogen och värd celler för att skapa ett tvärvetenskapligt plattform för analys av medfödda immunceller funktion och svamp patogenes. Dessa studier har visat nya aspekter av fagocytos som endast kunde observeras med systematisk temporal analys av de molekylära och cellulära interaktioner mellan människor fagocyter och svamppatogener och infektiösa mikroorganismer i allmänhet. Till exempel har vi börjat att definiera följande: (a) komponenterna i cellytan som krävs för varje steg i processen för erkännande, omvälvning och dödande av svampceller 1, 6, 7, 8, (b) hur ytgeometri påverkar effektiviteten i makrofag upptag och dödande av jäst och hyfernas celler 7, och (c) hur omvälvning leder till förändring av cellcykeln och beteende makrofager 9, 10.
I motsats till enstaka ögonblicksbilder tidpunkt, möjliggör levande celler videomikroskopi en mängd olika värdceller och patogener som skall studeras som coen fortlöpande sekvenser över långa tidsperioder, vilket ger rumsliga och tidsmässiga informationen på ett brett spektrum av dynamiska processer, inklusive cellmigration, replikering och vesikulär människohandel. Här beskriver vi i detalj hur du förbereder värd och svampceller, och att genomföra experiment video mikroskopi. Dessa metoder kan ge en användarvänlig guide för framtida studier med andra fagocyter och mikroorganismer.
Protocol
1. C. albicans Tillväxt och villkor
- Framställ SC-Ura-agarplattorna genom tillsats 6,9 g jästkvävebas utan aminosyror, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (vikt / volym) adenin hemisulfatsaltet och 20 g teknisk agar (tidigare beskriven i detalj i 11). Fyll volym till 900 ml med destillerat H 2 O Autoklav, låt agar svalna, men inte tillräckligt för att stelna, och tillsätt sedan 50 ml steril 40% D-glukos och 50 ml steril 4% SC-Ura bortfall under aseptiska förhållanden. Blanda, häll i petriskålar och låta agarplattor svalna och stelna. Förvara agarplattor vid 5 ° C tills användning.
- Streak C. albicans serotyp A stam CAI4 + CIp10 från glycerolstamlösningar lagrade vid -80 ° C på SC-Ura agarplatta.
- Inkubera plattan vid 30 ° C tills kolonier form och lagra vid 5 ° C.
- Kultur en enda C. albicans koloni i 5 ml SC-Ura medium (recept som i 1,1, men utan teknisk agar) och inkubera över natten vid 30° C, 200 varv per minut för att generera stationär fas C. albicans.
2. C. albicans färgning med användning fluoresceinisotiocyanat (FITC)
- Tillsätt 10 | il C. albicans övernattkultur till 990 pl PBS (pH 7,4) och utför en cellräkning med en hemocytometer.
- För att underlätta visualisering av C. albicans under fagocytos analyser fläck 1 × 10 8 C. albicans med användning av 1 mg / ml FITC i 0,05 M karbonat-bikarbonatbuffert (pH 9,6) under 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- För att ta bort obunden FITC, tvätta C. albicans i 1 ml 1 x PBS, centrifugera vid 3.000 x g under 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml 1 x PBS. Upprepa 3 ggr.
- Återsuspendera pelleten i 1 x 10 6 celler / ul i 1 x PBS.
3. Beredning av J774.1 Mus makrofagcellinje
- Upprätthålla J774.1 makrofager i 75 cm 2 vävnadodlingsflaskor i DMEM-medium kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin vid 37 ° C med 5% CO 2. Framställningen av primära makrofager beskrivs på annat håll i detalj 12, 13.
- Skrapa J774.1 celler från vävnadsodlingskolv och överför till en 50 ml Falcon-rör. Centrifugera vid 600 x g under 5 minuter för att erhålla en cellpellet.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml kompletterat förvärmd DMEM-medium. Räkna celler med användning av en hemocytometer och plattan 1 x 10 6 J774.1 makrofager i 2 ml kompletterat DMEM-medium i en 35 mm glas-baserad avbildning skålen. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Före bildåtergivning, ersätta kompletterat DMEM-medium med 2 ml förvärmd kompletterat CO 2-oberoende medium (med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin) innehållande 1 Röd M LysoTracker DND-99.
4. Levande celler Video Mikroskopi Fagocytos analys
- Valet av mikroskop kommer att bero på vad som finns tillgängligt lokalt, men mikroskopet installationen måste inkludera en inverterad fas, en miljökammare uppvärmd till 37 ° C och excitations / utsläpp filter för de valda fläckar (FITC och TRITC).
- Slå på mikroskopet värmaren före experimentet och ge tillräcklig tid för miljö styrkammaren värmas till 37 ° C. Den tid det tar för kammaren temperaturen stabiliseras kommer att variera för olika mikroskop inställningar.
- Slå på mikroskop och datorn och ladda bildprogram. Montera avbildning skålen på mikroskopet scenen och justera fokus att hitta de J774.1 makrofager. Optimera utseende TRITC och DIC bilder genom att justera andelen ljus och exponeringstiden.
- Ta bort bildenheten skålen och tillsätt 3 × 10 6 FITC-färgade C. albicans till than maträtt. Notera den tid som C. albicans sättes till skålen. Återgå skålen till scenen och optimera utseende FITC bilder om det behövs. Sätt upp en poäng lista om det behövs.
- Påbörja avbildning när alla punkter är i fokus och kanalerna optimeras. Fånga FITC, TRITC och DIC bilder varje minut under 6 timmar.
Representative Results
Här visar vi representativa resultat för C. albicans upptag av en murin makrofagcellinje J774.1 under en 6 h live-cell videomikroskopi experimentet. Figur 1 är en representativ levande celler videomikroskopi film, visar fagocytos av C. albicans från murina J774.1 makrofager. Levande celler video mikroskopi kan internalisering av C. albicans för att visualiseras utan behov att färga extern Candida. emellertid under dessa experiment, C. albicans färgades med hjälp av pH-känsligt färgämne FITC (grön), som kyles vid surgöring av makrofag fagosomen, och underlättar en bekräftelse på att Candida har internaliserats (figur 1). För att ytterligare bistånd visualisering av intagen C. albicans, makrofager färgades med den röda fluorescerande röd färg LysoTracker DND-99, som färgar sura fack och fungerar som en icke-specifik markör för fagosomen mognad.Fig. 2 är en stillbild från ett levande celler videomikroskopi experiment och visar variationen i antalet C. albicans intas av enskilda J774.1 makrofager. I detta experiment, engulfed 82% av J774.1 makrofager åtminstone en C. albicans cell vid slutet av 6 h fagocytos analys. I Figur 3, antalet internaliserat C albicans celler per makrofager rapporteras. Det genomsnittliga antalet av C. albicans tas upp per makrofag är 3,4, men intressant makrofager kan inta upp till 16 svampceller. Figur 4 är en sekvens av stillbilder från en representativ levande celler videomikroskopi experiment som visar en makrofag phagocytosing C albicans celler hypha tillväxt med makrofag och slutligen makrofag lys. Figur 4 illustrerar att video mikroskopi möjliggör analys av händelser efter omvälvning av målceller kan säga data tas fram för kiRullande av makrofager genom C. albicans hyfer i förhållande till antalet och morfogenes av intagna målceller, och hur makrofager dödande avser fagosomen mognad som kan studeras i realtid.
Figur 1. Levande celler videomikroskopi film visar fagocytos av C. albicans från murina J774.1 makrofager. Makrofager färgas med den röda fluorescerande röd färg LysoTracker DND-99, och C. albicans färgas med FITC (grön). Makrofager och C. albicans samodlades under en period av 6 h vid 37 ° C i fullständig CO 2-oberoende medium. Bilder fångades med 1 min intervaller under 6 timmar. Makrofager kan ses fastställande cell-cellkontakt med C. albicans, som sedan följs av upptag av C. albicans i makrofager phagosomes. Pilarna pekar till C. albicans före omvälvning med J774.1 makrofager. Denna video visar också att FITC fluorescens är quenched efter omvälvning av C. albicans. Skala bar, 10 nm. Klicka här för att se filmen .
Figur 2. Representativa levande celler videomikroskopi stillbild som visar variationen i antalet C. albicans uppslukas av enskilda makrofager. Makrofager (färgade med LysoTracker röd DND-99) samodlades med FITC-färgade C. albicans (grön). Det är variationen i antalet av C. albicans uppslukas (ett nummer bredvid en pil indikerar antalet C. albicans slukade), och i C. albicans morfologi (dvs. jäst verser hypha). Skalstock, 20 um.
Figur 3. Diagram som visar antalet av C. albicans intas per J774.1 murin makrofag vid slutet av 6 tim fagocytos analyser. Data representerar 2 oberoende experiment. Totalt 100 makrofager räknades från 3 fält från varje experiment, vilket gav totalt 600 individuella makrofager.
Figur 4. En serie bilder från en representativ levande celler videomikroskopi experiment som visar en makrofag (M) och C. albicans (C) före och under erkännande (A, B), och under och efter upptag (C, D). C. albicans hyfer fortsätta att växa inom makrofag (E, F), vilket kan resultera i makrofag lys (G). Andra makrofager rekryteras till platsen för brott och försök att inta släpps C. albicans (H). Makrofager färgas med den röda fluorescerande färgämnet LysoTracker röd DND-99, och C. albicans färgas med FITC (grön). Observera att FITC färgning släckes efter C. albicans upptag genom J774.1 makrofager (C). Skala bar, 10 um.
Discussion
Här metod för användning av levande celler videomikroskopi att studera makrofag fagocytos beskrivs. Video mikroskopi erbjuder flera ytterligare lager av information för analys. En grundläggande fördel är att upptagnings data kan genereras (från ett enda experiment) för varje tidpunkt under 6 timmar långa observationsperioden. Ännu viktigare, gör den beskrivna metoden differentiell analys av de enskilda stegen i fagocytos. Vi har till exempel visat att förändringar i den totala upptag av C. albicans glykosylering och mutanter morfogenes av linjer makrofagcellinjer och primära makrofager kan antingen vara en följd av förändringar i migration av makrofager mot målceller eller hastigheten av omvälvning gång cell-cell kontakt upprättats 7.
Det finns ett antal fallgropar att undvika när de utför dessa experiment. För det första är det mycket viktigt att säkerställa stabila miljöförhållanden under den experimentella förfaranderande. Detta uppnås bäst i en miljökammare som är inställd på de experimentella betingelserna flera timmar innan börjar experimentet. Video kvalitet är starkt beroende av sofistikerade moduler som använder infraröda lasrar för att automatiskt bibehålla Sample Z-position oavsett mekaniska eller termiska förändringar vilket eliminerar behovet av manuell fokusering korrigeringar.
Med tanke på den förlängda naturen av experimenten, är det viktigt att begränsa exponeringen laserljus och tillhörande fotoblekning och photoconversion effekter, som kan minimeras genom att använda höggradigt fluorescerande markörer, som underlättar låg exponeringstider. FITC färgningsprotokollet beskrivs här är snabb och pålitlig. Eftersom FITC är en mycket ljus och stabil färg, låg exponeringstider krävs och detta gör FITC idealisk för längre tid-lapse-filmer. Emellertid, använder vi rutinmässigt en mängd olika mål fläckar, inklusive kalkofluor vit och PKH färgämnen samt märkta organismer.
Under denna studie bilder tagna med 1 minuters intervall över en 6 timmar fagocytos analys. Intervallet mellan bilderna kan justeras beroende på processen som undersöks. Till exempel kan intervallet minskas vid utredning snabba processer såsom vesikulär människohandel. Den minsta tidsintervallet kommer att begränsas av mikroskop och kamera specifikationer. Det finns några faktorer att tänka på när du justerar tider. Först kommer minska intervallet mellan ögonblicksbilder innebär färre poäng kan avbildas och filstorlek kommer ökas betydligt. Tvärtom kommer att öka bildens intervallet för mycket att göra filmen förlorar kontinuitet.
Detta tillvägagångssätt kan tillämpasi princip att studera andra patogener och upptag av döende värdceller. Till exempel, har vi visat nyligen att benmärg härledda makrofager från sialoadhesin-brist möss kraftigt uppvisar reducerad bindning och fagocytos av sialylerade Campylobacter jejuni 8. Dock är målstorlek en viktig faktor för genomförbarhet, eftersom bildanalys blir allt svårare med en minskning av målcell storlek. Sofistikerad bildanalys programvara är avgörande för snabb video mikroskopi analys och detta bör kombineras med lämpliga bioinformatik stöd för att underlätta generering av algoritmer för att studera migration av enskilda celler och hela cellpopulationer 7. Live-cell video mikroskopi i kombination med sofistikerad bildanalys programvara för minut-för-minut analys av migration och individuella makrofag-C. albicans interaktioner ger en unik inblick i komplexiteten i C. albicans fagocytos genom macrophages. Det finns en enorm potential att utvidga dessa metoder för att studera andra patogener och fagocyter (dendritiska celler, neutrofiler) och att utveckla 3D-video mikroskopi på bilden cell-cell interaktioner i närmare eller på mer fysiologiska ytor såsom epitel-och endotelceller lager. Denna teknik är en del av nästa generations verktyg i studiet av värd-patogen interaktioner och bidra till att skapa detaljerade geografiska och tidsmässiga information om ett brett spektrum av dynamiska processer.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja. NG är mottagare av obegränsad bidrag stöd till grundläggande forskning av Gilead Sciences. LE arbetar som konsult för GSK i tidig läkemedelsutveckling.
Acknowledgments
LPE är en skotsk Senior Clinical Fellow och erkänner stöd av Chief Scientist kontoret (SCD/03). Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust Project Bidrag till LPE (089.930). NARG finansierades genom en Wellcome Trust program Grant (080.088) och en utrustning (075.470) (för DeltaVision), och av en FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 till 260.338-Allfun). Vi vill tacka universitetet i Aberdeen imaging anläggning, i synnerhet Kevin MacKenzie, för hjälp stöd och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
