Summary
Vi beskriver metoder for live-cell video mikroskopi av
Abstract
Fagocytisk klarering av sopp-patogener, og mikroorganismer mer generelt, kan bli vurdert for å bestå av fire forskjellige stadier: (i) overføring av fagocytter til området der patogener er plassert i, (ii) anerkjennelse av patogen-assosierte molekylære mønstre (PAMPs) gjennom mønsteret anerkjennelse reseptorer (PRRs), (iii) engulfment av mikroorganismer bundet til phagocyte cellemembranen, og (iv) behandling av omsluttet celler innen modning phagosomes og fordøyelse av inntatt partikkel. Studier som vurderer fagocytose i sin helhet er informative 1, 2, 3, 4, 5, men er begrenset ved at de normalt ikke bryte prosessen ned til migrasjon, engulfment og phagosome modning, som kan bli påvirket ulikt. Videre, slike studier vurdere opptak som en enkelt hendelse, snarere enn som en kontinuerlig dynamisk prosess. Vi har nylig utviklet avanserte live-cell imaging teknologi, og har kombinert disse med genetisk funksjonell analyse av bådepatogen og vert celler for å skape en tverrfaglig plattform for analyse av medfødte immunceller funksjon og sopp patogenesen. Disse studiene har avdekket nye sider ved fagocytose som bare kunne observeres ved hjelp systematisk timelige analyse av molekylære og cellulære interaksjoner mellom menneskelige fagocytter og sopp patogener og smittsomme mikroorganismer mer generelt. For eksempel har vi begynt å definere følgende: (a) komponentene i celleoverflaten kreves for hvert trinn av prosessen med anerkjennelse, engulfment og dreping av soppceller 1, 6, 7, 8, (b) hvor flategeometri påvirker effektiviteten av makrofag opptak og dreping av gjær og hyphal celler 7, og (c) hvor engulfment fører til endring av cellesyklusen og oppførselen makrofager 9, 10.
I motsetning til enkle tidspunktet øyeblikksbilder, muliggjør levende-celle video mikroskopi en rekke vertsceller og patogener studeres som continuous sekvenser over lengre tidsperioder, som gir romlig og tidsmessig informasjon om et bredt spekter av dynamiske prosesser, herunder celle migrasjon, replikering og vesicula menneskehandel. Her beskriver vi i detalj hvordan å forberede vert og sopp celler, og å gjennomføre video mikroskopi eksperimenter. Disse metodene kan gi en bruker-guide for fremtidige studier med andre fagocytter og mikroorganismer.
Protocol
1. C. albicans Vekst og betingelser
- Forbered SC-ura agarplater ved tilsetning 6,9 g gjær nitrogen base uten aminosyrer, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenin hemisulphate salt og 20 g teknisk agar (tidligere beskrevet i detalj i 11). Sminke volum til 900 ml med destillert H 2 O. Autoklav, tillate agar avkjøles, men ikke nok til å stivne, og deretter tilsett 50 ml steril 40% D-glukose og 50 ml sterilt 4% SC-ura frafall under aseptiske forhold. Bland, helles i petriskåler og forlate agarplater å avkjøle og stivne. Oppbevar agarplater ved 5 ° C inntil bruk.
- Streak C. albicans serotype En belastning CAI4 + CIp10 fra glycerol bestander lagret ved -80 ° C på SC-ura agarplate.
- Inkuber platen ved 30 ° C til kolonier form og oppbevar ved 5 ° C.
- Kultur én C. albicans koloni i 5 ml SC-ura medium (oppskrift som i 1.1, men uten teknisk agar) og inkuber over natten ved 30° C, 200 rpm for å generere stasjonære fasen C. albicans.
2. C. albicans Farging Bruke fluorescein isothiocyanat (FITC)
- Tilsett 10 pl C. albicans overnatter kultur til 990 pl PBS (pH 7,4) og utføre en celletall med en haemocytometer.
- For å hjelpe visualisering av C. albicans under fagocytose analyser, beis 1 × 10 8 C. albicans med tallene fra 1 mg / ml FITC i 0,05 M karbonat-bikarbonatbuffer (pH 9,6) i 10 min ved romtemperatur i mørke.
- Å fjerne ubundet FITC, vask C. albicans i 1 ml 1 x PBS, sentrifuger ved 3000 x g i 5 min, fjern supernatant og resuspender pelleten i 1 ml 1 x PBS. Gjenta 3 ganger.
- Gjensuspender pellet på 1 × 10 6 celler / mikroliter i 1 x PBS.
3. Forberedelse av J774.1 Mouse Macrophage cellelinje
- Opprettholde J774.1 makrofager i 75 cm 2 vevkultur kolber i DMEM medium supplert med 10% (v / v) føtalt kalveserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin ved 37 ° C med 5% CO 2. Fremstillingen av primære makrofager er beskrevet annet sted i detalj 12, 13.
- Skrap J774.1 celler fra vev kultur kolbe og overføre til en 50 ml Falcon-rør. Sentrifuger ved 600 x g i 5 min for å oppnå en cellepellet.
- Fjern supernatant og resuspender pellet i 10 ml forvarmet supplert DMEM medium. Telle celler ved hjelp av en haemocytometer og plate 1 × 10 6 J774.1 makrofager i 2 ml supplert DMEM medium i en 35 mm glass-basert bildebehandling parabolen. Inkuber over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Før til avbildning erstatte supplert DMEM medium med 2 ml forvarmet supplert CO 2-uavhengig medium (med 10% (v / v) føtalt kalveserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin) inneholder en pM LysoTracker Red DND-99.
4. Live Cell Video Mikroskopi Fagocytose Assay
- Valg av mikroskop vil avhenge av hva som er tilgjengelig lokalt, men mikroskopet oppsett må inkludere en omvendt fase, et miljøkammer oppvarmet til 37 ° C og eksitasjon / emisjon filtre for de valgte flekker (FITC og TRITC).
- Slå på mikroskopet varmeapparatet før forsøket og gi tilstrekkelig tid for miljøkontroll kammeret oppvarmes til 37 ° C. Tiden tatt for kammertemperatur å stabilisere vil variere for ulike mikroskop oppsett.
- Slå på mikroskopet og datamaskinen, og legg bildebehandlingsprogrammer. Monter bildebehandling rett på mikroskopet scenen og justere fokus for å finne de J774.1 makrofager. Optimaliser utseendet TRITC og DIC bildene ved å justere andelen av overført lys og eksponeringstider.
- Ta av bildebehandling form og legg i 3 × 10 6 FITC-farget C. albicans til than parabolen. Registrerer tiden som C. albicans er lagt til parabolen. Returner parabolen til scenen og optimalisere utseendet på FITC bilder hvis det er nødvendig. Sett opp et poeng liste hvis nødvendig.
- Commence bildebehandling når alle punktene er i fokus, og kanalene blir optimalisert. Fang FITC, TRITC og DIC bilder hvert minutt i 6 timer.
Representative Results
Her viser vi representative resultater for C. albicans uptake av murine makrofag cellelinje J774.1 under en 6 timers levende-cellers video mikroskopi eksperiment. Fig. 1 er en representativ levende-celle video mikroskopi film, som viser fagocytose av C. albicans etter murine J774.1 makrofager. Live-celle video mikroskopi gjør internalisering av C. albicans å bli visualisert uten behov for å farge ekstern Candida. Men under disse eksperimentene, C. albicans ble farget ved hjelp av pH-følsomme fargestoff FITC (grønn), som er bråkjølt under forsuring av makrofag phagosome og letter bekreftelse at Candida er internalisert (figur 1). For ytterligere å støtte visualisering av inntatt C. albicans, makrofager ble farget med røde fluorescerende fargestoff LysoTracker rød DND-99, som flekker sure avdelinger og fungerer som en uspesifikk markør for phagosome modning.Fig. 2 er et stillbilde fra et levende-celle video mikroskopi eksperiment og illustrerer variasjonen i antall C. albicans inntas av enkelte J774.1 makrofager. I dette eksperimentet, omsluttet 82% av J774.1 makrofager minst én C. albicans celle ved slutten av den 6 timers fagocytose analysen. I figur 3, antall internalisert C. albicans celler per macrophage er rapportert. Gjennomsnittlig antall C. albicans tatt opp per macrophage er 3,4, men interessant makrofager kan ingest opptil 16 soppcellene. Fig. 4 er en serie av stillbilder fra et representativt levende-celle video mikroskopi eksperiment viser en makrofag phagocytosing C. albicans celler, hypha vekst med macrophage og til slutt macrophage lysis. Figur 4 viser at video mikroskopi muliggjør analyse av bivirkninger etter engulfment av målceller, dvs. data generert for killing av makrofager med C. albicans hyfer i forhold til antallet og morfogenese av inntatt målceller, og hvordan makrofag drap vedrører phagosome modning som kan studeres i sanntid.
Figur 1. Live-celle video mikroskopi film som viser fagocytose av C. albicans etter murine J774.1 makrofager. Makrofager er farget med røde fluorescerende fargestoff LysoTracker rød DND-99, og C. albicans er farget med FITC (grønn). Makrofager og C. albicans ble co-dyrket i en periode på 6 timer ved 37 ° C i fullstendig CO 2-uavhengig medium. Bilder ble tatt til fange ved 1 minutts intervaller for 6 hr. Makrofager kan ses etablere celle-celle kontakt med C. albicans, som deretter følges av opptak av C. albicans i macrophage phagosomes. Pilene peker C. albicans før engulfment av J774.1 makrofager. Denne videoen viser også at FITC fluorescens er quenched følgende engulfment av C. albicans. Målestokk, 10 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Figur 2. Representant live-cell video mikroskopi stillbilde viser variasjon i antall C.albicans oppslukt av individuelle makrofager. Makrofager (farget med LysoTracker rød DND-99) ble samtidig dyrket med FITC-farget C. albicans (grønn). Det er variasjon i antall C. albicans oppslukt (et tall ved siden av en pil angir antall C. albicans oppslukt), og i C. albicans morfologi (dvs. gjær vers hypha). Skala bar, 20 mikrometer.
Figur 3. Graf viser antall C. albicans ingested per J774.1 murin makrofag ved slutten av 6 timers fagocytose analyser. Dataene representerer 2 uavhengige eksperimenter. Til sammen 100 makrofager ble tellet fra 3 felt fra hvert eksperiment, som gir totalt 600 individuelle makrofager.
Figur 4. En serie bilder fra en representant live-cell video mikroskopi eksperiment viser en macrophage (M) og C. albicans (C) før og under godkjenning (A, B), og under og etter opptak (C, D). C. albicans hyfer fortsette å vokse innenfor macrophage (E, F), som kan resultere i makrofag lysis (G). Andre makrofager blir rekruttert til området av brudd og forsøke å innta den utgitte C. albicans (H). Makrofager er farget med røde fluorescerende fargestoff LysoTracker rød DND-99, og C. albicans er farget med FITC (grønn). Vær oppmerksom på at FITC farging slukket etter C. albicans opptak J774.1 makrofager (C). Skala bar, 10 mikrometer.
Discussion
Her metoden for bruk av levende-celle video mikroskopi å studere macrophage fagocytose er beskrevet. Video mikroskopi tilbyr flere flere lag med informasjon for analyse. Ett grunnleggende fordel er at opptaks data kan genereres (fra ett enkelt eksperiment) for enhver tid punkt hele 6 hr observasjonsperioden. Enda viktigere, muliggjør metoden beskrevet differensial analyse av de individuelle faser av fagocytose. Vi har for eksempel vist at endringer i den samlede opptak av C. albicans glykosylering og morphogenesis mutanter ved macrophage cellelinjer og primære makrofager kan enten være en følge av endringer i makrofag migrasjon mot målceller eller rate av engulfment gang celle-celle kontakt er etablert 7.
Det finnes en rekke fallgruver du bør unngå når du utfører disse eksperimentene. Først, er det svært viktig å sikre stabile miljøforhold hele eksperimentelle prosedure. Dette oppnås best i et miljø kammer som er satt til de eksperimentelle forhold flere timer før oppstart av eksperimentet. Video kvaliteten er svært avhengig av avanserte moduler som bruker infrarøde lasere til automatisk opprettholde utvalg z-posisjon uansett mekaniske eller termiske endringer og dermed eliminere behovet for manuell fokusering korreksjoner.
Gitt den utvidede natur av forsøkene, er det viktig å begrense laserlys eksponering og tilknyttede fotobleking og photoconversion effekter, som kan minimeres ved anvendelse av svært fluorescerende markører som muliggjør lav eksponeringstider. FITC farging protokollen beskrevet her er rask og pålitelig. Som FITC er en svært lyse og stabil flekken, lav eksponering ganger er nødvendig, og dette gjør FITC ideell for lengre time-lapse filmer. Imidlertid vi rutinemessig bruke en rekke forskjellige mål flekker, inkludert Calcofluor White og PKH fargestoffer samt kodede organismer.
Under denne studien ble bilder tatt ved 1 minutts intervaller over en 6 timers fagocytose analysen. Intervallet mellom bildene kan justeres avhengig av prosessen under etterforskning. For eksempel, kan intervallet senkes når gransker raske prosesser som vesikulær handel. Minste tidsintervallet vil være begrenset av mikroskop og kamera spesifikasjoner. Det er noen hensyn å huske på når du justerer timings. Først, vil redusere intervallet mellom øyeblikksbilder bety færre poeng kan avbildes og filstørrelsen vil bli betydelig økt. Tvert imot, vil øke image intervallet for mye sminke filmen mister kontinuitet.
Denne tilnærmingen kan brukesi prinsippet å studere andre patogener og opptak av døende vertsceller. For eksempel har vi nylig vist at benmarg avledet makrofager fra sialoadhesin-mangelfull mus oppviser sterkt redusert binding og fagocytose av sialylated Campylobacter jejuni 8. Imidlertid er målstørrelse en viktig determinant for gjennomførbarhet, som bildeanalyse blir stadig vanskeligere med en reduksjon i målcellen størrelse. Sofistikert bildeanalyse programvare er viktig for rask video mikroskopi analyse, og dette bør kombineres med riktig bioinformatikk støtte til rette for produksjon av algoritmer for å studere migrasjon av individuelle celler og hele cellen bestander 7. Live-celle video mikroskopi i kombinasjon med avansert bildeanalyse programvare for minutt-for-minutt analyse av migrasjon og individuelle macrophage-C.albicans interaksjoner, gir en unik innsikt i kompleksiteten av C. albicans fagocytose ved macrophages. Det er et enormt potensial for å utvide disse metodene for å studere andre patogener og phagocytes (dendrittiske celler, nøytrofile) og å utvikle 3D video mikroskopi til bildet celle-celle interaksjoner i større detalj eller på flere fysiologiske overflater som epiteliale og endotelcelle lag. Denne teknikken er en del av neste generasjon av verktøy i studiet av host-patogen interaksjoner og vil hjelpe generere detaljerte romlig og tidsmessig informasjon om et bredt spekter av dynamiske prosesser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre. NG er en mottaker av ubegrenset tilskudd støtte til grunnforskning ved Gilead Sciences. LE fungerer som konsulent for GSK i tidlig utvikling av legemidler.
Acknowledgments
LPE er en skotsk Senior Clinical Fellow og erkjenner støtte fra Chief Scientist Office (SCD/03). Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust Project Grant til LPE (089 930). NARG ble finansiert av en Wellcome Trust Program Grant (080 088) og et utstyr Grant (075 470) (for DeltaVision), og ved en FP7-2007-2013 Grant (HELSE-F2-2010-260338-Allfun). Vi vil gjerne takke Universitetet i Aberdeen bildebehandling anlegget, spesielt Kevin MacKenzie, for nyttig støtte og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
