Summary
Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia video
Abstract
Liquidazione fagocitaria dei patogeni fungini e microrganismi più in generale, può essere considerato costituito da quattro fasi distinte: (i) la migrazione dei fagociti al sito in cui si trovano i patogeni; (ii) riconoscimento di pattern molecolari associati al patogeno (PAMPs) tramite modello recettori di riconoscimento (PRR), (iii) immersione di microrganismi legati alla membrana cellulare dei fagociti, e (iv) il trattamento delle cellule inghiottito all'interno fagosomi maturazione e la digestione della particella ingerito. Studi che valutano la fagocitosi in toto sono informativi 1, 2, 3, 4, 5, ma sono limitati nel senso che normalmente non rompere il processo di migrazione in giù, immersione e maturazione phagosome, che può essere pregiudicato differenziale. Inoltre, tali studi valutare assorbimento come un singolo evento, piuttosto che come un processo continuo dinamico. Abbiamo recentemente sviluppato avanzate dal vivo di cellule tecnologie di imaging, e hanno unito questi con genetico analisi funzionale di entrambicellule del patogeno e host per creare una piattaforma interdisciplinare per l'analisi della funzione delle cellule immunitarie innate e patogenesi fungina. Questi studi hanno rivelato nuovi aspetti della fagocitosi, che potevano essere osservati con sistematica analisi temporale delle interazioni molecolari e cellulari tra i fagociti umani e agenti patogeni fungini e microrganismi infettivi più in generale. Per esempio, abbiamo cominciato a definire la seguente: (a) i componenti della superficie cellulare per ogni fase del processo di riconoscimento, immersione e l'uccisione delle cellule fungine 1, 6, 7, 8, (b) come geometria della superficie influenza l'efficienza di assorbimento macrofagi e uccisione di lievito e cellule ifali 7, e (c) come engulfment conduce ad alterazioni del ciclo cellulare e il comportamento di macrofagi 9, 10.
In contrasto istantanee singole punto temporale, live-cell video microscopia permette un'ampia varietà di cellule ospiti e patogeni da studiare come cosequenze continua che in periodi di tempo lunghi, fornendo informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici, tra cui la migrazione cellulare, la replica e il traffico vescicolare. Qui si descrive in dettaglio come preparare host e cellule fungine, e per eseguire l'esperimento di video microscopia. Questi metodi possono fornire ad un utente-guida per gli studi futuri con altri fagociti e microrganismi.
Protocol
1. C. albicans crescita e Condizioni
- Preparare SC-Ura piastre di agar con l'aggiunta di 6,9 g di base di lievito senza amminoacidi azoto, 1 ml di NaOH 1 M, 10 ml 1% (w / v) di sale hemisulphate adenina e 20 g di agar tecnica (precedentemente descritto in 11). Portare a volume di 900 ml con acqua distillata H 2 O. Autoclave, lasciare raffreddare agar, ma non abbastanza per solidificare, e quindi si aggiungono 50 ml di soluzione salina al 40% di D-glucosio e 50 ml sterile 4% SC-Ura dropout in condizioni asettiche. Mescolare, versare in piastre di Petri e lasciare piastre di agar raffreddare e solidificare. Piastre di agar Conservare a 5 ° C fino al momento dell'uso.
- Streak C. albicans sierotipo A ceppo CAI4 + CIp10 dalle scorte glicerolo conservati a -80 ° C su SC-Ura piastra di agar.
- Incubare la piastra a 30 ° C fino a formare colonie e conservare a 5 ° C.
- Cultura un singolo C. albicans colonia in 5 ml SC-Ura medio (ricetta come in 1.1, ma senza agar tecnico) e incubare una notte a 30° C, 200 rpm per generare fase stazionaria C. albicans.
2. C. albicans colorazione Uso isotiocianato di fluoresceina (FITC)
- Aggiungere 10 microlitri C. cultura albicans overnight a 990 microlitri di PBS (pH 7,4) ed eseguire una conta cellulare utilizzando un emocitometro.
- Per facilitare la visualizzazione di C. albicans durante saggi di fagocitosi, macchia 1 × 10 8 C. albicans usando 1 mg / ml FITC in 0,05 M tampone carbonato-bicarbonato (pH 9,6) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Per rimuovere FITC non legato, lavare C. albicans in 1 ml 1 x PBS, centrifugare a 3000 xg per 5 min, rimuovere surnatante e risospendere pellet in 1 ml 1 x PBS. Ripetere 3 volte.
- Risospendere pellet a 1 x 10 6 cellule / mL in 1 x PBS.
3. Preparazione della linea cellulare di macrofagi J774.1 mouse
- Mantenere J774.1 macrofagi nel 75 cm 2 tessutobeute di coltura in DMEM supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina a 37 ° C con 5% di CO 2. La preparazione di macrofagi primari è descritto altrove in dettaglio 12, 13.
- Raschiare J774.1 cellule dal pallone di coltura tissutale e trasferire in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 600 g per 5 min per ottenere un pellet di cellule.
- Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di pre-riscaldato terreno DMEM integrato. Contare le celle utilizzando un emocitometro e la piastra 1 × 10 6 J774.1 macrofagi in 2 ml di terreno DMEM integrato in un 35 mm vetro piatto a base di imaging. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Prima di imaging, sostituire DMEM integrato con 2 ml di pre-riscaldato integrato CO 2-media indipendenti (con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina) contenente 1 mM LysoTracker Red ND-99.
4. Cella in diretta Video Microscopia Assay fagocitosi
- La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e di eccitazione / emissione filtri per le macchie scelti (FITC e TRITC).
- Acceso il riscaldamento microscopio prima dell'esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo impiegato per la temperatura della camera di stabilizzare varia per diverse configurazioni microscopio.
- Accendere il microscopio e il computer, e caricare il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare le J774.1 macrofagi. Ottimizzare l'aspetto delle immagini TRITC e DIC regolando la percentuale di luce trasmessa e tempi di esposizione.
- Rimuovere il piatto di imaging e aggiungere 3 × 10 6 FITC-tinto C. albicans a tlui servire. Registrare il tempo che C. albicans è aggiunto al piatto. Ritorna il piatto sul palco e ottimizzare l'aspetto delle immagini FITC, se necessario. Impostare un elenco punti se necessario.
- Iniziare immagini quando tutti i punti sono a fuoco e i canali sono ottimizzati. Cattura FITC, immagini e TRITC DIC ogni minuto per 6 ore.
Representative Results
Qui vi mostriamo i risultati rappresentativi per C. assorbimento albicans da una linea cellulare murina di macrofago J774.1 durante un live-6 hr cella esperimento di video microscopia. Figura 1 è un rappresentante live-cell film microscopia video, che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. Live-cell microscopia video consente interiorizzazione di C. albicans da visualizzare senza la necessità di macchiare Candida esterno. Tuttavia, durante questi esperimenti, C. albicans è stato colorato con il colorante sensibile al pH FITC (verde), che viene spenta durante acidificazione dei fagosomi macrofagi, e facilita la conferma che Candida è stata internalizzata (Figura 1). Per la visualizzazione di un ulteriore aiuto ingerito C. albicans, macrofagi sono state colorate con il colorante fluorescente rosso LysoTracker rosso DND-99, che scomparti macchie acide e serve come non specifico marcatore di maturazione phagosome.La figura 2 è un fermo immagine dal vivo a cellule esperimento di video microscopia e illustra la variazione del numero di C. albicans ingerito dalle singole J774.1 macrofagi. In questo esperimento, l'82% dei macrofagi J774.1 inghiottito almeno un C. cella albicans alla fine del saggio fagocitosi 6 ore. In figura 3, il numero di internalizzato C. cellule albicans per macrofagi viene segnalato. Il numero medio di C. albicans assunte per macrofagi è 3.4, ma è interessante notare i macrofagi possono ingerire fino a 16 cellule fungine. figura 4 è una sequenza di immagini fisse da un rappresentante in tempo reale delle cellule esperimento di video microscopia che mostra un macrofago phagocytosing C. cellule albicans, crescita ifa con il macrofago e lisi infine macrofagi. Figura 4 illustra che videomicroscopia consente l'analisi dei seguenti eventi engulfment di cellule bersaglio, cioè dati può essere generato per il killing dei macrofagi da C. albicans ife in relazione al numero e morfogenesi di cellule bersaglio ingeriti, e come uccisione macrofagi riguarda maturazione phagosome che può essere studiata in tempo reale.
Figura 1. Live-cell film microscopia video che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso ND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Macrofagi e C. albicans sono state co-coltivate per un periodo di 6 ore a 37 ° C in completa CO 2-media indipendenti. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min per 6 ore. Macrofagi può essere visto istituisce contatto cellula-cellula con C. albicans, che è seguito da assorbimento di C. albicans in fagosomi macrofagi. Le frecce indicano C. albicans prima immersione da J774.1 macrofagi. Questo video mostra anche che la fluorescenza FITC è QuEnched immersione seguito di C. albicans. Barra della scala, 10 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .
Figura 2. Rappresentativa live-cella video microscopia fermo immagine che mostra variazioni nel numero di C.albicans fagocitati dai macrofagi singoli. I macrofagi (tinto con LysoTracker rosso ND-99) sono stati co-coltura con FITC-tinto C. albicans (verde). C'è una variazione nel numero di C. inghiottito albicans (un numero accanto a una freccia indica il numero di C. albicans inghiottito), in C. albicans morfologia (cioè versi lievito ifa). Scala bar, 20 micron.
Figura 3. Grafico mostra il numero di C. albicans ingerito per J774.1 macrofago murino alla fine del test di fagocitosi 6 ore. I dati rappresentano due esperimenti indipendenti. Un totale di 100 macrofagi sono stati contati da 3 campi di ogni esperimento, per un totale di 600 macrofagi individuali.
Figura 4. Una serie di immagini da un rappresentante live-cell esperimento di video microscopia mostra un macrofago (M) e C. albicans (C), prima e durante il riconoscimento (A, B), e durante e dopo l'assorbimento (C, D). C. albicans ife continuano a crescere nel macrofago (E, F), che può provocare la lisi dei macrofagi (G). Macrofagi altri vengono reclutati al sito di rottura e tentare di ingerire il rilascio C. albicans (H). I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso DND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Si noti che la colorazione FITC si spegne seguendo C. assorbimento albicans da J774.1 macrofagi (C). Scala bar, 10 micron.
Discussion
Qui il metodo per l'utilizzo di live-cell video microscopia a studiare fagocitosi dei macrofagi è descritto. Microscopia video offre molteplici livelli di informazioni per l'analisi. Un vantaggio fondamentale è che i dati di assorbimento può essere generato (da un singolo esperimento) per ogni punto temporale durante tutto il periodo di osservazione 6 ore. Ancora più importante, il metodo descritto consente analisi differenziale delle singole fasi di fagocitosi. Abbiamo, per esempio, mostrato che le variazioni assorbimento complessivo di C. glicosilazione albicans e mutanti morfogenesi da linee cellulari macrofagiche e macrofagi primari può essere una conseguenza di cambiamenti nella migrazione dei macrofagi verso cellule bersaglio o tasso di immersione una volta contatto cellula-cellula è stabilito 7.
Ci sono una serie di trappole da evitare lo svolgimento questi esperimenti. Primo, è molto importante assicurare condizioni ambientali stabili durante la procedura sperimentaleDure. Ciò si ottiene in una camera ambientale che viene impostato alle condizioni sperimentali diverse ore prima di iniziare l'esperimento. La qualità video è altamente dipendente sofisticati moduli che utilizzano laser a infrarossi per mantenere automaticamente il campione z-posizione indipendentemente cambiamenti meccanici o termici eliminando così la necessità di correzioni fuoco manuale.
Data la natura estesa degli esperimenti, è importante limitare l'esposizione della luce laser e associati effetti photobleaching e fotoconversione, che può essere minimizzata utilizzando marcatori altamente fluorescenti, che facilitano i tempi di esposizione. Il protocollo di colorazione FITC qui descritto è veloce e affidabile. Come FITC è molto luminoso e stabile macchia, tempi di esposizione bassi sono necessari e questo rende ideale FITC per lunghi filmati time-lapse. Tuttavia, abbiamo abitualmente utilizzano una varietà di macchie bersaglio diverse, comprese Calcofluoro bianco e coloranti PKH nonché organismi etichetta.
Durante questo studio, le immagini sono state catturate ad intervalli di 1 minuto per un saggio di fagocitosi 6 ore. L'intervallo tra le immagini può essere regolata a seconda del processo in esame. Per esempio, l'intervallo può essere diminuita quando indagando rapidi processi quali il traffico vescicolare. L'intervallo di tempo minimo sarà limitato dalle specifiche microscopio e della fotocamera. Ci sono alcune considerazioni da tenere a mente durante la regolazione delle temporizzazioni. In primo luogo, riducendo l'intervallo tra le istantanee significa meno punti possono essere esposte e la dimensione del file crescerà considerevolmente. Al contrario, aumentando l'intervallo di immagine troppo farà il film perde continuità.
Questo approccio può essere applicatoin linea di principio per studiare altri agenti patogeni e l'assorbimento di morire cellule ospiti. Per esempio, abbiamo recentemente dimostrato che i macrofagi di midollo osseo derivate da sialoadhesin-carente topo esibiscono notevolmente ridotto vincolante e fagocitosi di sialylated Campylobacter jejuni 8. Tuttavia, le dimensioni di destinazione è un fattore determinante per la fattibilità, come analisi di immagine diventa sempre più difficile con una riduzione delle dimensioni delle cellule bersaglio. Sofisticato software di analisi delle immagini è essenziale per l'analisi rapida microscopia video, e questo dovrebbe essere accompagnato da un adeguato sostegno bioinformatica per facilitare la generazione di algoritmi per studiare la migrazione delle cellule singole e popolazioni di cellule intere 7. Live-cell video microscopia in combinazione con software sofisticati di analisi di immagine per il minuto per minuto l'analisi della migrazione e dei singoli macrofagi-C.albicans interazioni, fornisce una visione unica della complessità di C. fagocitosi albicans da macrophages. C'è un enorme potenziale di espandere questi metodi per studiare altri patogeni e fagociti (cellule dendritiche, i neutrofili) e di sviluppare microscopia video 3D a immagini interazioni cellula-cellula in modo più approfondito o su più superfici fisiologiche come strati di cellule epiteliali ed endoteliali. Questa tecnica fa parte della nuova generazione di strumenti per lo studio di interazioni ospite-patogeno e contribuirà a generare dettagliate informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare. NG è un destinatario di sovvenzioni senza restrizioni per la ricerca di base da Gilead Sciences. LE lavora come consulente per GSK nello sviluppo di farmaci iniziale.
Acknowledgments
LPE è una scozzese Senior Fellow clinica e riconosce il sostegno dell'Ufficio Chief Scientist (SCD/03). Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust Progetto Sovvenzione LPE (089.930). NARG è stato finanziato da un programma Wellcome Trust Grant (080.088) e la sovvenzione di attrezzature (075.470) (per DeltaVision), e da un FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010-260338-Allfun). Vorremmo ringraziare l'Università di Aberdeen impianto di imaging, in particolare Kevin MacKenzie, per il supporto e consigli utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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