Summary
Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células de
Abstract
Aclaramiento fagocítica de los hongos patógenos y microorganismos en general, se puede considerar que consisten en cuatro etapas distintas: (i) la migración de los fagocitos al sitio donde se encuentran los patógenos; (ii) el reconocimiento de patógenos asociados a patrones moleculares (PAMP) a través del patrón receptores de reconocimiento (PRRS), (iii) entrampamiento de microorganismos unidos a la membrana de la célula fagocítica, y (iv) la transformación de las células sumido en fagosomas maduración y la digestión de la partícula ingerida. Los estudios que evalúan la fagocitosis en su totalidad son informativos 1, 2, 3, 4, 5, pero están limitados en que normalmente no romper el proceso en la migración, la inmersión y la maduración del fagosoma, que puede ser afectado diferencialmente. Además, tales estudios valorar la aceptación como un acontecimiento único, en lugar de como un proceso dinámico continuo. Recientemente hemos desarrollado avanzados células vivas tecnologías de imagen, y éstos se han combinado con el análisis genético funcional de amboscélulas patógenas y de acogida para crear una plataforma interdisciplinaria para el análisis de la función celular inmune innata y la patogénesis fúngica. Estos estudios han revelado aspectos novedosos de la fagocitosis de que sólo podían ser observados mediante el análisis sistemático temporal de las interacciones moleculares y celulares entre los fagocitos humanos y hongos patógenos y microorganismos infecciosos más general. Por ejemplo, hemos comenzado a definir lo siguiente: (a) los componentes de la superficie celular para cada etapa del proceso de reconocimiento, la inmersión y la muerte de las células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) la forma geometría de la superficie influye en la eficiencia de la absorción de macrófagos y la muerte de células de levadura y de hifas 7, y (c) cómo inmersión conduce a la alteración del ciclo celular y el comportamiento de los macrófagos 9, 10.
En contraste con las instantáneas individuales tiempo del punto, en vivo de células microscopía de vídeo permite una gran variedad de células huéspedes y patógenos a ser estudiado como cosecuencias continua que durante períodos de tiempo prolongados, proporcionando información espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos, como la migración celular, la replicación y el tráfico vesicular. A continuación se describe en detalle cómo preparar huésped y las células fúngicas, y llevar a cabo los experimentos de microscopía de vídeo. Estos métodos pueden proporcionar a un usuario-guía para futuros estudios con otros fagocitos y microorganismos.
Protocol
1. C. albicans Crecimiento y Condiciones
- Preparar SC-ura placas de agar mediante la adición de 6,9 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 1 ml de NaOH 1 M, 10 ml 1% (w / v) de sal hemisulfato de adenina y 20 g de agar técnica (descrito anteriormente en detalle en 11). Constituyen el volumen a 900 ml con agua destilada H 2 O. Autoclave, agar permitir que se enfríe, pero no lo suficiente para solidificarse y, a continuación añadir 50 ml estéril 40% de D-glucosa y 50 ml estéril 4% de deserción SC-Ura en condiciones asépticas. Mezclar, verter en placas de Petri y dejar las placas de agar se enfríe y solidifique. Placas Tienda de agar a 5 ° C hasta su uso.
- Streak C. albicans serotipo A, cepa CAI4 + CIp10 de stocks de glicerol almacenada a -80 º C en placa de agar SC-ura.
- Incubar la placa a 30 ° C hasta que se forman colonias y se almacena a 5 ° C.
- Cultura una sola C. albicans colonia en 5 ml SC-Ura medio (receta como en 1.1, pero sin agar técnico) e incubar durante la noche a 30° C, 200 rpm para generar la fase estacionaria C. albicans.
2. C. albicans tinción utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)
- Añadir 10 l C. cultura albicans durante la noche a 990 l de PBS (pH 7,4) y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro.
- Para ayudar a la visualización de C. albicans durante ensayos de fagocitosis, mancha 1 × 10 8 C. albicans utilizando 1 mg / ml de FITC en 0,05 M tampón carbonato-bicarbonato (pH 9,6) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Para quitar FITC unida, lavar C. albicans en 1 ml de PBS 1 X, se centrifuga a 3.000 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS 1 x. Repita 3 veces.
- Resuspender el sedimento en el 1 × 10 6 células / l en 1 x PBS.
3. Preparación de la línea celular de macrófago de ratón J774.1
- Mantener J774.1 macrófagos en 75 cm 2 de tejidomatraces de cultivo en medio DMEM suplementado con 10% (v / v) de suero fetal de ternera (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina, a 37 ° C con 5% de CO 2. La preparación de los macrófagos primarios se describe en detalle en otra 12, 13.
- Raspar J774.1 células del matraz de cultivo de tejidos y transferir a un tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 600 xg durante 5 minutos para obtener un sedimento celular.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml pre-calentado medio suplementado DMEM. Contar las células usando un hemocitómetro y la placa de 1 × 10 6 J774.1 macrófagos en 2 ml de medio suplementado con DMEM en una placa de formación de imágenes 35 mm a base de vidrio. Incubar toda la noche a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Antes de la formación de imágenes, sustituir el medio complementado con 2 ml de DMEM precalentado suplementado CO 2-independiente de medio (con 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina) que contiene 1 mM LysoTracker Red NOM-99.
4. Live Video Microscopía fagocitosis celular Ensayo
- La elección de microscopio dependerá de lo que está disponible localmente, pero la configuración microscopio tendrá que incluir una fase invertida, una cámara ambiental calentada a 37 ° C y de excitación / emisión filtros para las manchas elegidos (FITC y TRITC).
- Encender el calentador de microscopio antes del experimento y tiempo suficiente para que la cámara de control ambiental calentar a 37 ° C. El tiempo necesario para estabilizar la temperatura de la cámara variará para diferentes configuraciones de microscopio.
- Encienda el microscopio y la computadora, y cargar el software de imágenes. Monte el plato de imagen en la platina del microscopio y ajustar el enfoque para encontrar las J774.1 macrófagos. Optimizar la apariencia de las imágenes TRITC y DIC ajustando el porcentaje de luz transmitida y los tiempos de exposición.
- Quitar el plato de imagen y añadir 3 × 10 6 FITC-manchado C. albicans frente a la tque repartir. Registre el tiempo que C. albicans se añade al plato. Vuelva a colocar el plato al escenario y optimizar la apariencia de las imágenes FITC si es necesario. Establecer una lista de puntos si es necesario.
- Comenzar imágenes cuando todos los puntos están en el enfoque y los canales están optimizados. Capturar imágenes FITC, TRITC y DIC cada minuto durante 6 horas.
Representative Results
Aquí nos muestran resultados representativos de C. captación albicans por una línea celular de macrófagos murinos J774.1 durante un 6 hr vivo de células experimento microscopía de vídeo. Figura 1 es un representante vivo de células película microscopía de vídeo, que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Vivo de células microscopía de vídeo permite la internalización de C. albicans para ser visualizado sin la necesidad de teñir Candida externa. Sin embargo, durante estos experimentos, C. albicans se tiñeron utilizando el colorante sensible al pH FITC (verde), que se inactivó durante la acidificación del fagosoma de macrófagos, y facilita la confirmación de que Candida ha sido interiorizado (Figura 1). Para visualizar la ayuda adicional de ingestión C. albicans, los macrófagos fueron teñidas utilizando el tinte fluorescente rojo LysoTracker rojo DND-99, que compartimientos manchas ácidas y sirve como un marcador no específico de la maduración del fagosoma.La Figura 2 es una imagen fija a partir de un experimento de vídeo en vivo de células microscopía e ilustra la variación en el número de C. albicans ingeridos por macrófagos individuales J774.1. En este experimento, 82% de los macrófagos J774.1 engullido al menos una C. albicans celular al final del ensayo de fagocitosis 6 hr. En la Figura 3, el número de internalizada C. células albicans por macrófago se informa. El número medio de C. albicans adoptadas hasta por macrófagos es 3,4, pero es interesante que los macrófagos pueden ingerir hasta 16 células fúngicas. Figura 4 es una secuencia de imágenes fijas de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago phagocytosing C. células albicans, crecimiento de hifas con la lisis de macrófagos y en última instancia los macrófagos. Figura 4 ilustra que la microscopía de vídeo permite el análisis de los eventos siguientes entrampamiento de las células diana, es decir los datos pueden ser generados para el killing de los macrófagos por C. albicans hifas en relación con el número y la morfogénesis de las células diana ingeridos, y cómo se relaciona con matanza macrófagos maduración del fagosoma que puede ser estudiado en tiempo real.
Figura 1. Vivo de células película microscopía video que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Los macrófagos son teñidos con el colorante fluorescente rojo LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Los macrófagos y C. albicans fueron co-cultivadas por un período de 6 horas a 37 ° C en CO 2-independiente completa medio. Las imágenes fueron capturadas a intervalos de 1 min durante 6 hr. Los macrófagos se puede ver el establecimiento de contacto célula-célula con C. albicans, que es seguido por la absorción de C. albicans en fagosomas de los macrófagos. Las flechas apuntan a C. albicans antes de la inmersión por J774.1 macrófagos. Este video también muestra que la fluorescencia FITC es QuEnched siguiente inmersión de C. albicans. Barra de escala, a 10 m. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 2. Representante vivo de células microscopía de imagen fija de vídeo que muestra la variación en el número de C. albicans engullido por los macrófagos individuales. Los macrófagos (teñidas utilizando LysoTracker rojo DND-99) fueron co-cultivadas con FITC-manchado C. albicans (verde). Hay variación en el número de C. envuelto albicans (un número junto a una flecha indica el número de C. albicans envuelta), y en C. morfología albicans (levadura es decir versos hifa). Barra de escala, a 20 m.
Figura 3. Gráfico que muestra el número de C. albicans ingerido por J774.1 de macrófagos murinos al final de 6 ensayos de fagocitosis hr. Los datos representan 2 experimentos independientes. Un total de 100 macrófagos fueron contados a partir de 3 campos de cada experimento, dando un total de 600 macrófagos individuales.
Figura 4. Una serie de imágenes de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago (M) y C. albicans (C) antes de y durante el reconocimiento (A, B), y durante y después de la absorción (C, D). C. albicans hifas continúan creciendo dentro del macrófago (E, F), lo cual puede resultar en la lisis de los macrófagos (G). Otros macrófagos son reclutados en el sitio de ruptura y de intento de ingerir el liberado C. albicans (H). Los macrófagos son teñidos con el tinte rojo fluorescente LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Tenga en cuenta que la tinción FITC se inactivó después de C. albicans captación por los macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, a 10 m.
Discussion
Aquí, el método para el uso de microscopía de vídeo en vivo de células para estudiar la fagocitosis de macrófagos se describe. Microscopía de vídeo ofrece múltiples capas adicionales de información para el análisis. Una ventaja básica es que los datos de absorción se puede generar (de un solo experimento) para cualquier punto de tiempo durante todo el período de observación de 6 horas. Más importante aún, el método descrito permite el análisis diferencial de las etapas individuales de la fagocitosis. Hemos, por ejemplo, se muestra que los cambios en la absorción global de C. glicosilación albicans y mutantes morfogénesis por las líneas celulares de macrófagos y macrófagos primarios puede ser una consecuencia de los cambios en la migración de macrófagos hacia las células diana o la tasa de inmersión vez que el contacto célula-célula se establece 7.
Hay una serie de trampas para evitar la hora de realizar estos experimentos. En primer lugar, es muy importante para garantizar la estabilidad de las condiciones ambientales durante todo el procedimiento experimentalDuré. Esto se consigue mejor en una cámara ambiental que se ajusta a las condiciones experimentales durante varias horas antes de comenzar el experimento. La calidad de vídeo es altamente dependiente de módulos sofisticadas que utilizan láseres infrarrojos para mantener automáticamente la muestra z-posición independientemente de los cambios mecánicos o térmicos, eliminando así la necesidad de correcciones de enfoque manual.
Dada la amplia naturaleza de los experimentos, es importante limitar la exposición de luz láser y efectos asociados fotoblanqueo y fotoconversión, que puede ser minimizado mediante el empleo de marcadores altamente fluorescentes, que facilitan bajos tiempos de exposición. El protocolo de tinción FITC se describe aquí es rápido y confiable. Como FITC es un muy brillantes y estables veces mancha, exposición bajos son necesarios y esto la hace ideal para largos FITC time-lapse películas. Sin embargo, nosotros usamos una variedad de manchas de destino diferentes, incluyendo Calcofluor White y colorantes PKH así como organismos marcados.
Durante este estudio, las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min más de un ensayo de fagocitosis 6 hr. El intervalo entre las imágenes se puede ajustar dependiendo del proceso bajo investigación. Por ejemplo, el intervalo se puede disminuir la hora de investigar los procesos rápidos, como el tráfico vesicular. El intervalo de tiempo mínimo estará limitada por las especificaciones de microscopio y una cámara. Hay algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de ajustar tiempos. En primer lugar, la disminución del intervalo entre las instantáneas significa menos puntos se pueden obtener imágenes y el tamaño del archivo será aumentado considerablemente. Por el contrario, aumentando el intervalo de imagen demasiado hará perder la continuidad de la película.
Este enfoque se puede aplicaren principio, para estudiar otros patógenos y la absorción de morir las células huésped. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que la médula ósea de los macrófagos derivados de sialoadhesina deficientes en ratones muestran una unión reducida en gran medida y la fagocitosis de sialilada Campylobacter jejuni 8. Sin embargo, el tamaño solicitado es un determinante importante para la viabilidad, como el análisis de imagen se vuelve cada vez más difícil con una reducción en el tamaño de las células diana. Un sofisticado software de análisis de imagen es esencial para el rápido análisis de microscopía de vídeo, y esto debe ir acompañado de un apoyo adecuado bioinformática para facilitar la generación de algoritmos para estudiar la migración de las células individuales y poblaciones enteras de células 7. Vivo de células microscopía de vídeo en combinación con un sofisticado software de análisis de imágenes para el análisis minuto a minuto de la migración y las interacciones individuales C.albicans-macrófagos, ofrece una visión única de la complejidad de la C. albicans fagocitosis por macrophages. Existe un enorme potencial para expandir estos métodos para estudiar otros patógenos y los fagocitos (células dendríticas, neutrófilos) y el desarrollo de la microscopía de vídeo 3D con imagen interacciones célula-célula con mayor detalle o en más superficies fisiológicos tales como capas de células epiteliales y endoteliales. Esta técnica forma parte de la nueva generación de herramientas en el estudio de las interacciones huésped-patógeno y ayudará a generar información detallada espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar. NG es un beneficiario de las subvenciones sin restricciones para la investigación básica por Gilead Sciences. LE trabaja como consultor de GSK en el desarrollo de fármacos temprano.
Acknowledgments
LPE es un escocés Clinical Fellow Senior y agradece el apoyo de la Oficina de Jefe Científico (SCD/03). Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust del Proyecto Grant LPE (089.930). NARG fue financiado por el Wellcome Trust un programa de subvención (080.088) y una Beca de equipos (075.470) (para DeltaVision), y por una subvención del 7 º PM-2007-2013 (SALUD-F2-2010 a 260,338-ALLFUN). Nos gustaría dar las gracias a la Universidad de Aberdeen instalación de imágenes, en particular, Kevin MacKenzie, de apoyo y útiles consejos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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