Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Published: February 8, 2013 doi: 10.3791/50198
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,2, 3, 3, 1,2,4,5
1Department of Oncology, Georgetown University, 2Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University, 3Stem Cell Dynamics, Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health, 4Department of Medicine, Georgetown University, 5Department of Nanobiomedical Science and WCU Research Center of Nanobiomedical Science, Dankook University

Summary

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

Abstract

הדמית זמן לשגות ניתן להשתמש כדי להשוות התנהגות של תאים בתרבית ראשונית preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי שונים של סרטן השד. לדוגמה, זמן בין חלוקות התא (גלגולים סלולריים), מספרים סלולריים אפופטוטיים, אבולוציה של שינויים מורפולוגיים, ומנגנון של יצירת מושבות ניתן לכמת והשוואה בתאים שנשאו נגעים גנטיים ספציפיים. תרביות תאים ראשוניות אפיתל חלב נוצרות מבלוטות חלב ללא גידול מוחשי. בלוטות resected זהירות עם הפרדה ברורה משרירים סמוכים, בלוטות לימפה הוסרו, והשעיות תא בודד של תאי האפיתל חלב מועשר נוצרות על ידי רקמת שד ריסוק ואחרי ניתוק וסינון האנזימטית. השעיות תא בודד מצופות וממוקמות ישירות מתחת למיקרוסקופ בתוך תא חממה עבור הדמית חית תאים. שישה עשרה 650 x 700 מיקרומטר מיקרומטר שדות בתצורת 4x4 מכל well של צלחת 6-גם הם צלמו כל 15 דקות במשך 5 ימים. תמונות זמן לשגות נבדקות ישירות למדוד התנהגויות סלולריות שיכול לכלול מנגנון ותדירות של יצירת מושבות תאים בתוך 24 השעות הראשונות של ציפוי לתאים (לעומת צבירת התפשטות תאים), שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים. מעקב תא בודד משמש ליצירת מפות גורל תא למדידה של חיי תא בודדים וחקירות של דפוסי חלוקת תא. נתונים כמותיים מנותחים סטטיסטי לאמוד את ההבדל משמעותי בהתנהגות מתואמת עם נגעים גנטיים ספציפיים.

Introduction

מודלי עכבר מהונדס גנטי הם כלים כדי ללמוד ולהבין איך נגעים גנטיים שונים תורמים לסיכון להתפתחות סרטן השד. לדוגמה, עכברים מהונדסים גנטי הראו כי שילוב של שלושה גורמים: האובדן של השד באורך מלא 1 הסרטן, התחלה מוקדמת (BRCA1) גנים בתאי האפיתל חלב, haploinsufficiency ניבט קו החלבון p53 גידול (TP53), וחלב אפיתל תא ממוקד עד מוסדר אלפא קולטן אסטרוגן (עידן) תוצאות ביטוי בהתפתחות של סרטן השד ב100% של BRCA1 (ו) וירוס 11/f11/Mouse חלב גידול (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (floxed ט-op) -ER/MMTV-reverse טטרציקלין transactivator (rtTA עכברים על ידי גיל 12 חודשים בהשוואה לאחוזים הנמוכים יותר דיווחו בBRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - עכברים ללא עידן על ביטוי (~ 50 - 60%) ועכברי BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre ללא TP53 haploinsufficiency (<5%). 1

הדמית זמן לשגות דינמית של ההתנהגות של תאי האפיתל חלב ראשוני preneoplastic מגלה הבדלים בהתנהגות תא המוערכים פחות בקלות בסעיפי רקמות סטטיות. שינויים בשגשוג והתמיינות תאים הם נצפו בחלב ראשוניים מנישאי מוטצית BRCA1 אדם. 2 יצירת השעיות תא הבודד של תאי האפיתל חלב ראשוניים מרגיל ועכברים מהונדסים גנטי נוצרות דרך התנערות האנזימטית של רקמת בלוטת חלב resected. 3 זמן לשגות תמונות נתפסות להעריך מנגנון ועיתוי של הופעה ושכיחות של שינויים מורפולוגיים בתאי אפיתל כולל מעבר-mesenchymal (EMT) ואפופטוזיס מושבת תא. דור של מפות גורל תא, כימות של משך הזמן בין חלוקות תא (גלגולים סלולריים), וקביעת הדפוסים של חלוקת תאים מתאפשרים על ידי שימוש במעקב מהתא בודד. טיםכלי מעקב של '(TTT) הוא תוכנה זמינה בפומבי משמשת ליצירת מפות גורל תא בודד. השירות שלה בהבהרת מנגנונים של גורל תא נקבע 4,5 בחינת התפתחות תקינה תא גזע hematopoietic 6-9 והדור של נוירונים. 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנית כללית

  1. צור תרבויות העיקריות של תאי אפיתל חלב preneoplastic מבלוטות חלב של הנדסה גנטית ולשלוט עכברי סוג פראי.
  2. צלם תמונות חי תאים כל 15 דקות באמצעות תוכנת רכישת תמונת Volocity (גרסת 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) לתקופה של עד 5 ימים.
  3. צפו בתמונות זמן לשגות ולהעריך עיתוי ואת המנגנון של יצירת מושבות תאי אפיתל, שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים.
  4. המרת Volocity נוצר. ערימות TIFF ל. קבצי JPG באמצעות שינוי שם קבצים דיגיטליים תמונה (שינוי השם 2.1.6, אוטומצית MetaMorph מיקרוסקופי ותוכנת ניתוח תמונה (התקנים מולקולריים, LLC Sunnyvale, CA) וhttp://www.softpedia.com/get / מערכת / ניהול קבצים /-Rename.shtml) כדי לאפשר תאימות עם תוכנת כלי המעקב של טים (TTT,"Target =" _blank tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
  5. שימוש TTT, ליצור מפות גורל תא לקביעת הזמן בין חלוקות תא (גלגולים סלולריים) ודפוסים של חלוקת תאים (סימטרי לעומת סימטרי).
  6. ניתוח נתונים כמותיים משלבי 3 ו 5 לעיל כדי לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין דגמים השונים של עכבר מהונדס גנטי ו / או פקדי סוג פראי.

2. דור של תרביות תאים ראשוניות חלב אפיתל

  1. הכן מדיה מלאה לבידוד של תאי האפיתל חלב יחידים הבאים וריאציה של הוראות היצרן (EpiCult-B עכבר בינוני קיט, טכנולוגיות Stemcell, ונקובר, BC). שלב 450 מ"ל בינוני Epi-Cult-B, תוספת 50 מ"ל Epi-B קאלט התפשטות, סרום שור עוברי (5% FBS), 50 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (PenStrEP) ופקטור 10 ng / ml צמיחת אפידרמיס (EGF).
  2. הכן דיסוציאציה מדיה על ידי שילוב של חלק 1 של תערובת 10x collagenase / Hyaluronidase עם 9 חלקי מדיה מלאה מ2.1.
  3. להרדים את העכבר ולהמשיך מייד לנתיחה לאחר המוות. מקום עכבר על הגב שלה על פלטפורמת קלקר נתיחה לאחר מוות ולאבטח את כל ארבעת הגפיים כדי שהעור של גחון הוא מתוח. להרוות עור גחון ושיער, כולל שכיסה את הגפיים, עם 70% אתנול. לחשוף # 2/3 (חזה) ו# 4/5 (מפשעתי) בלוטות חלב על ידי ביצוע חתך קו אמצע דרך העור (לא יזין הצפק), המשתרע לY-חתך דרך העור המדיאלי של כל איבר וחזית הפוך חתך Y דרך העור המדיאלי של כל איבר אחורי.
  4. באמצעות נתיחה בוטה, להפריד את העור מunderlyingperitoneum, למשוך בחזרה בשני הצדדים של העור עד שהוא מתוח, ולאבטח אותו לנתיחה לאחר מות פלטפורמת הקלקר באמצעות סיכות. החל מהצד החיצוני, השתמש נתיחה בוטה עם שימוש נבון של disseמספרי ction לבודד מפשעתי השלמים ו / או בלוטות חלב בית חזה מרקמת חיבור בסיסית ושרירים. הנח לא יותר משני בלוטות חלב בצלחת פטרי סטרילית 10 סנטימטרים ולעבור למכסת מנוע תרבית רקמה.
  5. במכסת מנוע תרבית רקמה, לבחון בלוטות לבלוטות הלימפה חלב המזוהים כגושים קטנים, מעוגל וברורים עם צבע צהבהב. הסרת בלוטות לימפה מהבלוטה מקיפה באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים. ברר ברקמת שד ל~ 1 3 קוביות מ"מ באמצעות שני אזמלים סטריליים, אחד בכל יד.
  6. מקום טחון רקמת שד ב5 מ"ל דיסוציאציה מדיה, לערבב ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2-3 פעמים באמצעות פיפטה 10 מ"ל, ו דגירת הלילה (עד ~ 16 שעות) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם CO 2 ב5% צינור 50 מ"ל חרוטים עם כובע משוחרר.
  7. למחרת בבוקר, להכין תערובת קרה של פתרון 'חלק 1 הנקס מאוזן המלח (HBSS) מכיל 2% FBS ו4 חלקים נאגר פתרון אמוניום כלוריד לקדם האדום blתמוגה ood תא (HFAmCl) כמו גם HBSS הקר בתוספת 2% FBS (HF). טרום חם טריפסין-EDTA (0.25%), 5 מ"ג / המ"ל Dispase בתמיסת המלח המאוזנת של האנק השתנה, 1 מ"ג / המ"ל DNase, ומדיה מלאה.
  8. הסר את צינור צנטריפוגה חרוטים עם רקמת השד מהחממה ועדינות דופק פעמי מערבולת 2-3 שניות. צנטריפוגה הצינור ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C), והשלך את supernatant.
  9. Resuspend הגלולה במינימום של 10 מ"ל וHFAmCl צנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
  10. הוסף 3 מ"ל טריפסין-EDTA לגלולה ולערבב תחילה עם 5 מ"ל פיפטה ולאחר מכן עם micropipettor P1000 עד מגויד דקות (1-3). הוסף 10 המ"ל HF, צנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
  11. הוסף 2 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ​​ו 200 Dispase μl של 1 מ"ג / המ"ל DNase לגלולה ולערבב עם micropipettor P1000 לדקות 1. מדגם צריך להיות cloג'ודי אך לא סיבי. אם סיבי, להוסיף 100 μl של DNase אני ומערבב שוב.
  12. הוסף 10 המ"ל הקר HF, מסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
  13. Resuspend הגלולה הסופית במדיה מלאה. לכמת את המספר הכולל של תאים (באמצעות hemocytometer או קולטר נגדי). שתי בלוטות חלב להניב כ 1 x 06-1 אוקטובר x 10 7 תאים. תאי אפיתל פלייט עיקריים בצלחת שטוחה תחתית 6-גם בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים לכל היטב.

3. הדמית Live-תא

  1. מייד לאחר ציפוי התאים, הנח את הצלחת 6-היטב היטב על במת מיקרוסקופ בתוך 5% CO 2 / רוויים humidity/37 ° C טמפרטורת חדר דגירה. התאם את הקבל לקולר תאורה ומרכז את טבעות השלב. לניסויים שהוצגו כאן, הפוך ניקון אקליפס TE300/PerkinElmer ספינינג הדיסק Confocalמערכת מיקרוסקופ במצב לעומת שלב widefield עם עדשה אובייקטיבית 10x הייתה בשימוש.
  2. תוכנת רכישת תמונה פתוחה, וליצור שם ספרייה עבור תמונות זמן לשגות, ולשמור במיקום עם מספיק מקום לקבצים גדולים. הניסויים שהוצגו כאן תוכנה מנוצלת Volocity תמונת רכישה (גרסת 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
  3. אפשר הצלחת כדי לאזן במיקרוסקופ החממה למינימום של 15 דקות. מנמיך את העדשות, כדי למנוע הפרעת שלב עדשה. תחת הכותרת "במה", בחר "כייל שלב". לרכוש מחדש את המטוס, סט מוקד Z = אפס תחת x, y, z כרטיסייה וסימן נקודתי ההדמיה על ידי בחירה באפשרות "הוסף נקודה" תחת "במה" הכותרת. נקודתי Place במרכזו של כל היטב של הצלחת 6 היטב להדמיה כהדמיה לעומת שלב עשויות להיות מעוות בסמוך לפריפריה של בארות פלסטיק. סדר נקודות בכיכר בשדות 4 4 x (650 x 700 מיקרומטר שדות מיקרומטר), כל אחד עם חפיפה קטנה (כ 5%). שמור את הנקודות הנבחרות תחת "צבידואר ".
  4. תחת "שלב", בחר "הפוך מפת מוקד" ופעל לפי הנחיות כדי להגדיר את המיקוד של כל נקודה. הגדר עיתוי רכישת תמונה כדי ללכוד 4 תמונות לשעה (כל 15 דקות). זה יכול להיות מותאם בהתאם לדרישות של הניסוי הספציפי. שמור את מפת המוקד תחת "במה".
  5. לחץ לחיצה ימנית על "יבוא תמונות" בצד ימין כלי הבר ולשמור את הגדרות ההדמיה. לחץ על כפתור ההקלטה כדי להתחיל את ההדמיה. לאחר השעה 1, לבדוק את הפוקוס של תמונות כדי לראות אם יש צורך בהתאמה.
  6. לפקח ולהמשיך הדמיה חייה במשך 5 ימים, שהסתיים כאשר תאים הופכים confluent.

4. צפייה ישירה של תמונות זמן לשגות להערכת עיתוי ומנגנון יצירת המושבות ראשונית אפיתל הסלולרי, תחולה של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים

  1. צפייה ישירה של תמונות זמן לשגות ניתן לבצע באמצעות כל תוכנת צפייה בוידאו תואמת (למשל http:/ / Www.real.com/ RealPlayer או תוכנות חינם זמינות מסחרי אחרות). תמונות ניתן לראות ב. פורמט TIFF בשלב זה או לאחר המרה לקבצי JPG. (ראה שלב 5).
  2. כדי לקבוע מנגנון של יצירת מושבות ראשונית, להתחיל עם מחסנית אחת דימוי מייצג אתר הדמיה אחד על הצלחת. במסגרות ראשוניות, תאים יהיו צפים. בצע תמונות סדרתיים כדי לקבוע מתי תא אפיתל 1 שומר על הצלחת. בשלב זה, תאי האפיתל יכולים להיות מזוהים ומובחן מן fibroblasts ידי מורפולוגיה cuboidal יותר שלהם. עקוב תא אפיתל יחיד זה דרך תמונות סדרתיים וגורלה של מעל 24 שעות לאחר מכן. להקליט אם הוא הופך להיות מוקף בתאי האפיתל נוספים או עובר אגף או אפופטוזיס תא. אם מוקף בתאי אפיתל, המנגנון של יצירת מושבות ניתן לקבוע באופן ישיר, על ידי הצגה אם התאים שמסביב נגזרים מתאים צפים שאז המצרפי עם תא החסיד הראשוני (הים) אומחלוקה של תא החסיד הראשוני. רשום את מספר המושבות שהוקמו על ידי צבירת תא לעומת חלוקת תא במהלך 24 השעות הראשונות.
  3. כדי לקבוע את מספר התאים בתחילה חסיד העוברים אפופטוזיס על תקופת זמן מסוימת, בצע את תמונות סידוריות להופעת תכונות קלסיות של אפופטוזיס מתפתחות בתא שהיה חסיד (http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html), ומספר התאים אפופטוטיים זוהו במהלך כל תקופת ההדמיה או בתוך מסגרות זמן מסוימות נרשמו.
  4. במשך זמן, תאי אפיתל בתרבות לשנות המורפולוגיה שלהם מצורת cuboidal ראשונית להופעה בקנה אחד עם EMT מוארכת יותר. בצע תמונות סדרתיים כדי לקבוע היום / שעה לאחר ציפוי כאשר זה מתרחש.

5. שינוי קובץ תמונה

  1. שנה את שמות תיקיות וקבצי התמונה בהתאם לדרישות לתוכנת כלי המעקב של טים השתמש בתוכנה חופשיה כמו שינוי השם 2.1.6 (http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml) כדי לשנות שמות קבצים בקבוצות. צור תיקייה אחת המכילה את כל התיקיות וקבצים של הניסוי ושם לתיקייה (לדוגמה:
  2. יצירת תיקיית משנה עבור כל נקודה / מצב שבו התרבות הייתה הדמיה. תנו לתיקיות: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. מספר המיקום צריך להיות 3 ספרות. דוגמה: 072511RN_p001. לשים את כל קבצי התמונה של עמדת הפרט בתיקיית המשנה.
  3. הוסף timepoint (באמצעות 5 ספרות) ומספר ערוץ (מאחר שקיים רק ערוץ אחד, שדה בהיר, השתמש "0") בסופו של כל שם קובץ בפורמט זה:
    EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
  4. ליצור קובץ יומן לכל תפקיד על ידי הורדת TTTlogfileconverter התכנית הראשונה חינם מאתר TTT. הפעל את תכנית TTTlogfileconverter ובחר את תיקיית הניסוי. קלט מרווח תמונה (בשניות). לתמונה שצולמה בכל 15 דקות, זן 900 שניות. לאחר מכן לחץ על הכפתור הירוק קבצים הסמוי יומן.

6. דור של מפות גורל תא של תאים בודדים באמצעות TTT

  1. גreate תיקייה בשם TTTexport ותיקיית משנה בשם TTTfiles שבו יאוחסן כל נתוני המעקב הסלולרי בעקבות הוראות תוכנת TTT
  2. הפעל את תכנית TTT, בחר ראשי תיבות של משתמשים, ולחץ על "המשך".
  3. לחץ על "קבע NAS," בחר את המשתמש יצר תיקייה "TTTexport", ולחץ על אישור. בדפדפן, בחר תיקיית ניסוי, בחר תיקיית עמדה, ולאחר מכן לחץ על כפתור "טען עמדה".
  4. הגדרת גורם לעיני "10x". טען מספר התמונות הנדרשות (טעינה כל התמונות מומלצות לפעם הראשונה).
  5. בחלון עורך תא, בחר "מושבה חדשה" תחת תפריט הקובץ. בחלון הסרט, לחץ על "תא המסלול" או F2 כדי להתחיל לעקוב אחר תא.
  6. זהה את התא בMחלון ovie ועכבר שימוש לממקם את הסמן מעל לתא. מעגל עם מספר התא אמור להופיע לאחר F2 כבר לחץ. השתמש במקש "0" בלוח המספרים של המקלדת כדי לעקוב אחר מיקומו של התא ולהתקדם לתמונה הבאה. הזז את הסמן למעקב המיקום של כל תא בכל מסגרת. כדי למחוק ולחזור למסלול הקודם תמונת העיתונות "הדל" במקלדת הנומרית. כדי להעביר מסגרות קדימה ללא מעקב תא העיתונות "3", וכדי לנוע אחורה בלי מעקב עיתונאים "1" במקלדת הנומרית.
  7. כדי לסמן חלוקת תא לחץ על הכפתור "האגף" בחלון הסרט. כדי לסמן מוות של תאים לחץ על הכפתור "תא המוות" בחלון הסרט. ברגע שחלוקה התרחשה, תאי הבת יכולים להיות במעקב באותה מפת גורל תא על ידי לחיצה ימנית על סמל העיגול של התא בת הייעודי בחלון עריכת התא כדי להתחיל לעקוב אחר מצב באופן אוטומטי.
  8. לחץ על F10 כדי לשמור על העץ. כל עץ יחסוך בקפל התפוקה המיועדתאה (TTTExport). כדי להתחיל מפת גורל תא חדשה, בחר "מושבה חדשה" תחת אז "קובץ" תפריט "פתח" בחלון עריכת התא.
  9. לווח נתונים סלולריים לאחר שאסף את כל חיים מהכרטיסייה "נתונים סלולריים" בחלון עריכת התא.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש במבחן t או של הסטודנט (אם השוואת שני גנוטיפים) או ANOVA (אם משווים> 2 גנוטיפים) כדי לקבוע אם הבדלים בנתונים פרמטריים כגון מספרים של מושבות ראשונות סלולריות, גלגולים סלולריים או שעות עד להופעת EMT בין גנוטיפים שונים מבחינה סטטיסטית משמעותי. תדירות אפופטוטיים ניתן להשוות את המספר / תאים מצופים מספר כוללים של הסטודנטים באמצעות מבחן t או ANOVA או עם מאן ויטני או Kruskal-ואליס כאשר נגזרו כאחוז מתאי חסיד.
  2. לבצע בדיקות חשמל באמצעות נתונים מניתוחים של ניסויים ראשוניים כדי לקבוע כמה ניסיוני משכפל צריכה לבצע ומפות גורל תא שנוצרו מכל לשכפל לים הולםכוח tatistical שימוש חינמי זמין (למשל http://statpages.org/). בניסויים שהוצגו כאן, תרביות תאים שמקורם משלושה עכברים לגנוטיפ היו מספיקות כדי לקבוע אם היו הבדלים משמעותיים סטטיסטי ביצירת מושבות תא וגלגולים סלולריים כאשר שינויים גנטיים ספציפיים שנעשו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי אפיתל ופיברובלסטים יכולים להיות מכובדים על ידי מורפולוגיה של תאים. תאי האפיתל יש צורת cuboidal (איור 1 א-B) ומושבות תאי טופס (איור 1 א). Fibroblasts, סוג של תא סטרומה, יש מורפולוגיה מוארכת (האיור 1C).

תאים היו מעוגלים וצפו בתחילת ההדמיה (איור 2A-D). לאחר התקשרות לצלחת שהם נעשו שטוחים והפגינו הופעת cuboidal סוג (2E איור, ח). על ידי 4 ימים של תרבות הרוב של תאי האפיתל מוארך למורפולוגיה EMT דמוית (איור ט 2-L). שינוי זה התרחש באותה כרונולוגיה בכל גנוטיפים למדו. חלק מהתמונות דיגיטליות היו מטושטשות בגלל תאורת הקולר ויישור טבעת שלב שאינן נכונה (האיור 2D, H, L).

התאים הצפים התפתחו coloni התא אפיתל המוגדר פרטes ידי 24 שעות לאחר ציפוי (איור 3 א ', ב'). ניתוח תמונה סידורי גילה כי מושבות אלה שנוצרו על ידי הצטברות של תאים במקום חלוקת תא. בעוד שיבוש BRCA1 על ידי עצמו לא שינה את מספר המושבות שנוצרו, תוספת של TP53 haploinsufficiency משמעותי את מספר המושבות שנוצרו ותוספת של ERα על ביטוי משמעותי את מספר המושבות שנוצרו (האיור 3C).

זה קריטי כדי לנטר את התמונות הדיגיטליות שנרכשו ולהתאים את מפת המוקד לעתים קרובות במהלך 24 השעות הראשונות כמו תאים לצרף לצלחת ולאחר מכן לפחות פעמים ביום כדי להבטיח את התאים להישאר בפוקוס והתרבויות אינן מזוהמות. דיוק של ניתוחים נפגע אם תאי הדמיה הם לא בפוקוס (איור 4).

בניסוי הנציג הציג כאן, שאלה קריטית הייתה לקבוע אם שינויים ברמת ביטוישל גנים הידועים להשפיע סיכון לסרטן שד (BRCA1, TP53, וקולטן אסטרוגן 1 (Esr1) 1) שינה את מספר השעות בין חלוקות תא (חיי תא) או השפע על הדפוסים של חלוקה (סימטרי מול אסימטרי) שבאינם סרטני תאי האפיתל חלב יסודיים. כדי להשיג זאת, מפות גורל תא בודדות (עצים) נוצרה באמצעות TTT. דוגמאות של מפות גורל תא יציגות לכל אחד מארבעת גנוטיפים נבדקו מומחשות (איור 5A-D). הארבעה גנוטיפים של התאים שנבדקו היו פראי מסוג (לא מניפולציה גנטית) (האיור 5A), אובדן של BRCA1 באורך מלא (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre) (איור 5 ב), פסד של BRCA1 באורך מלא בשילוב עם TP53 haploinsufficiency (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -) (איור 5 ג), והפסד של BRCA1 באורך מלא בשילוב עם TP53 haploinsufficiency ורווח של Esr1 (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER) (האיור 5D). דור של מפות גורל תא הופסק כאשר תאים הפכו confluent (~ דורי 3-4) מאז מעקב חד משמעי של תאים בודדים לא היה אפשרי עוד אחרי זה. הדור 0 (זמן חלוקת התא הראשונה) לא נכלל בניתוח של גלגולים סלולריים בגלל משך דור 0 היו ארוכים יותר ומשתנים יותר מאשר הדורים הבאים. דורות 1, 2, 3, ו 4 קובצו יחדיו לניתוחים הסופיים כי לא היו הבדלים משמעותיים בגלגולים סלולריים ממוצעים או שגיאת התקן של הממוצע (SEM) בין הדורים אלה. השוואות של גלגולים סלולריים ממוצעים בין גנוטיפים השונים (האיור 5E) חשפו כי הפסד של BRCA1 באורך מלא הקטין את מספר השעות בין חלוקות תא מ21.3 ± 1.6 שעות (wild-type) ל -16.5 ± 1.0 שעה (BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre). לאtably, למרות אובדן TP53 אלל אחד בנוסף לאובדן של BRCA1 באורך מלא קשור לעלייה משמעותית בdevelopment1 סרטן השד, משמעות חי תא היה ללא שינוי (16.3 ± 1.2 שעות), בהשוואה לעכברים שחסרו BRCA1 בלבד. מעניין לקבל מEsr1 בBRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 עכברים + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER שוחזרו חיי תא משכים לרמות ליד סוג פראי (19.3 ± 2.1 שעות), אם כי העכברים האלה יש שכיחות הגבוהה ביותר של התפתחות סרטן שד מכל הדגמים למדה here.1 ממצאים אלה מצביעים על כך שההפסד של BRCA1 באורך מלא שלא היה קשור תמיד לחיי תא מתקצרים, במקום זה שונה על ידי ERα ביטוי יתר. ניסויים הבאים של צעד אפשריים ניצול טכנולוגיה זו יכולות להיות ניסויי מנת תגובה באמצעות אסטרוגנים שונים, גורמי גדילה אחרים, או רפוי מועמד למדידת ההשפעה שלהם על חיי תא בbackgro הגנטי השונהunds. בניגוד להשפעה על משך חיי תא, אף אחד מהשינויים הגנטיים חקר דפוסי חלוקת תאים כאן משתנים.

איור 1
איור 1. מראה של מושבת תא אפיתל (), תא אפיתל (ב '), ופיברובלסטים (C) מהדמית הזמן לשגות. תאי אפיתל מופיעים יותר cuboidal תוך fibroblasts יופיע מוארך יותר. ברי גודל = 50 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. תמונות סדרתיים נציג זמן לשגות מזמן 0, 2 ו 4 ימים להפגין שינויים במורפולוגיה תאית לאורך זמן והבדלים במראה ובללא קוהלהתאורה אה. בשלב 0 התאים המצופים צפה (ספירת ראשי חץ), בימים בתרבות שהם חסידים ולהפגין מורפולוגיה cuboidal סוג (חיצים עבים E, H) ועל ידי ארבעה ימים בתרבות שהם יתארכו ולהפגין EMT-כמו מורפולוגיה (IL חצים הדקים). קולר תאורה קיימת בלוחות AC, EG, וIK. הפנלים D, H ו-L להמחיש תמונות ללא תאורת קולר. תמונות המוצגות הן מאותה נקודת הדמיה לאורך זמן. ברי size = 200 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. מספרים של מושבות תאים אפיתל ביום 1 מגוונות ידי גנוטיפ. () מעוגל תאים צפים בתחילת ההדמיה זמן לשגות. (ב) שתי מושבות תאים אפיתל מייצג (חיצים). (C) מספרים של epitheliaמושבות / מסגרת תא l נוצרו ב 24 שעות מגוונות על ידי גנוטיפ. גרפים ברים להמחיש את השגיאה הממוצעת והתקן של הממוצע. * P <0.05, ANOVA. ברי size = 200 מיקרומטר. תאים מבודדים מבלוטות חלב ללא גידול מוחשי מ10 - ל 12-BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre בן החודש (n = 4), BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / - (n = 3), BRCA1 (N = 3) f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (n = 3), ופראי מסוג העכברים צלמו ללימודים. חמישה ניסויי הדמיה עצמאיים מורכבים מצירופים שונים של עכברים מסוג פראי והמהונדסים גנטיים בוצעו. מדיה הכילה פנול אדום. אין אסטרוגן הוסיף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. תמונות מחוץ לפוקוס לא יכולות להיות מדויקותly נתח. לפני הדמית הצלחת, הצלחת צריכה לשבת בהדמית החממה במשך 15 דקות כדי לאזן. במהלך היום הראשון של הדמיה, ההתמקדות צריכה להיות מסומנת ומותאמת בכל כמה שעות. אחרים כך זה צריך להיבדק פעמים ביום, אבל בדרך כלל נשאר יציב יותר. חץ מציין מושבת תא אפיתל מחוץ לפוקוס.

איור 5
. איור 5 מפות גורל תא נוצרו מתא בודד מעקב באמצעות TTT ל() פראי מסוג, (ב) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre, (ג) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -, ו( ד ') BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER עכברים. תאים שאי אפשר לעקוב אחרי עקב אובדן מחוץ למסגרת או לשכבת תא confluent מסומנים על ידי סימן שאלה. כאשר אין סימן שאלהמצוין, מעקב הסתיים במכוון עקב מפגש תא וחוסר יכולת לעקוב באופן חד משמעי את גורל תא בודד. (E) Mean גלגולים סלולריים מגוונים על ידי גנוטיפ. גרפים ברים להמחיש את השגיאה הממוצעת וסטנדרטית של הגלגולים הסלולריים הממוצעים (זמן בין חלוקות תא) במשך הדורים 1-4 עבור כל גנוטיפ. משמעות גלגולים סלולריים היו קצרים משמעותי בתאי האפיתל חלב שמקורם BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre וBRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - בהשוואה לעכברי סוג פראי. * P <0.05, ANOVA. תאים מבודדים מבלוטות חלב ללא גידול מוחשי מ10 - ל 12-BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre בן החודש (n = 4), BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / - (n = 3), BRCA1 (N = 3) f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (n = 3), ופראי מסוג העכברים צלמו ללימודים. חמישה ניסויי הדמיה עצמאיים מורכבים מצירופים שונים של engin פראי סוג והגנטיעכברי eered בוצעו. מדיה הכילה פנול אדום. אין אסטרוגן הוסיף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים

חשוב לוודא שבלוטות חלב נקצרות מעכברי בנים אותו הגיל לשליטה לשונות הקשורים בגיל בהתנהגות תא אפיתל חלב. כאשר ציפוי התאים, אותו מספר התאים צריך להיות מצופה בכל אחד גם לכל ניסוי. תאים צריכים להיות דלילים יחסית כאשר ציפוי כך שתרבויות לא הופכות confluent מהר מדי כך שניתן לעקוב אחר תאים בודדים מרובים באמצעות תמונות סדרתיים. זה חיוני כי הצלחת תהיה מתאזנת בחממה לפני ההדמיה בגלל ההתמקדות תשתנה אחרי הצלחת היא מתאזנת. ברגע שהחלה הדמיה, ההתמקדות צריכה להיבדק בתדירות גבוהה ומותאם לפי צורך, במיוחד בתוך 24 השעות הראשונות. חשוב לי הטמפרטורה של החממה והמוסדרת מראש המחוממת. מספר האנשים נכנסים ויוצאים מהחדר צריך להיות מוגבל ככל האפשר. אנו ממליצים לתרגל את כל ההיבטים של ישבוגרם את הניסוי מראש כדי להבטיח שחזור ובקרת איכות. כמו בכל ניסויי תרביות התאים, עקרות הן נושא חשוב ומנהגי תרבות סטנדרטיים סטריליים סלולריים יש להשתמש בכל העת.

שמירה וטיפול בקבצי התמונה הגדולים דורשת כמות משמעותית של שטח זיכרון. כונן משותף ברשת או כוננים קשיחים ניידים יכול לשמש. קבצים יומרו פעם זה חשוב לוודא שהתמונות ששמו באופן עקבי בצורה נכונה והושמו בתיקיות מתאימות. תכוף חוסך של נתונים דיגיטליים צריכה להתבצע לאורך כל התהליך.

מגבלות

שיטה זו משתמשת במערכת תרבות 2-D שאינו מאפשרת ניתוח של הבדלים התנהגותיים שיתגלו במערכת תרבות 3-D. משך זמן הגלגולים סלולריים יכול להימדד רק reproducibly לאחר חלוקת התא שנצפה לראשונה כמספר שעות לחלוקת התא הראשונה שלאחר initציפוי IAL של התאים משתנה.

שינויים אפשריים

בהתאם לדרישות של הניסוי, תמונות זמן לשגות ניתן לקחת יותר או בתדירות נמוכה יותר. לדוגמה, אם מבנים תאיים חולפים הם שיש לכמת, מרווח 5 שניות עשוי להיות מתאים יותר. הליכים אחרים ליצירת תרביות תאי אפיתל חלב ראשוניות ניתן להשתמש. כל ציוד הדמיה עלול לשמש ליצירת הדמית זמן לשגות, כל עוד הוא מסוגל לעמוד בדרישות של הניסוי. מערכות חלופיות למעקב מתא בודד יכולות להיות מועסקות. להליך שתואר כאן, שטוחת תחתית פלסטיק סטנדרטי צלחת 6-כן הייתה הולמת. מנות פלסטיק יכולות לשמש לכל עדשות עבודה ארוכות מרחקי האוויר כגון 4x, 10x, ו20x. חשוב לבחור אזורים בסמוך למרכז צלחות הפלסטיק בעת ביצוע הדמיה לעומת שלב מאז הפלסטיק עקום ליד הקצוות ברוב המנות ומעווה את האור.בארות תחתיות זכוכית עובי coverslip תידרשנה לעדשות רגילות עובדות מרחקי טבילה (שמן, מים, גליצרול, וכו '), אשר בדרך כלל בהגדלה גבוהה יותר.

בעיות ירי

כאשר תאים מצופים, תקשורת צריכה להיות מספיק כדי לשמור על גדילת תאים למשך 5 ימים כדי להקטין את הצורך במניפולצית הצלחת על הבמה, עם זאת, במידת צורך, ניתן להוסיף מדיה. מומלץ כי אידוי להישמר עד למינימום. אידוי צריך להיות מנוהל על ידי צבת 3-4 מנות של מי deionized סטרילית בתוך החממה ולמלא אותם בעת צורך. אפשר למלא את הבארות שאינן בשימוש של הצלחת 6-היטב עם מי deionized סטרילי.

אם תמונות לא טוענות לתכנית TTT, יש לבדוק תחילה ולוודא את הקבצים והתיקיות מסודרים ושם בצורה נכונה. לאחר מכן, בדוק אם קובץ היומן הוא בתיקייה הנכונה (ראה שלב 5.5).

Futuיישום מחדש או כיוון לאחר טכניקת מאסטרינג

אותו הנוהל כללי יכול לשמש כדי לנתח את ההתנהגות של סוגי תאים אחרים, כוללים תאי אפיתל אנושיים ראשוניים חלב כמו גם תאי סרטן שד. לדוגמה, התנהגות genotypic ספציפי ו / או תגובה לטיפולי מועמד ניתן לנתח. אוכלוסיות תאים לחלופין, הדמיה של תא פלואורסצנטי הופעל (FAC) ממוינת יכולות להתבצע או תוויות ניאון הוסיפו לעקוב אחר סוגי תאים מסוימים.

משמעותה של טכניקה זו ביחס לשיטות קיימות

תוספת של הדמית זמן לשגות וניתוחים של התנהגות תא לאורך זמן לתרבית תאים מסורתיים וטכניקות תיוג מספקת נתונים כמותיים מתאים בודדים לאורך זמן ולא רק דינמיקה של אוכלוסיות שלמה. טכניקה זו מאפשרת לתאים בודדים שנצפו ברציפות, בניגוד לשיטות מסורתיות המאפשרות תצפית רק בנקודתי זמן בדידות. Moreover, שיטות מסורתיות דורשות את התאים שיפריעו על ידי לקיחה אותם בתוך ומחוץ לחממה כדי לצפות בם תחת מיקרוסקופ ואילו הגישה מתוארת כאן מאפשר לתאים להיות שנצפו מבלי שהועבר. לבסוף, הדמיה זמן לשגות מספקת תיעוד מתמשך של התאים תחת תצפית שניתן להחזיר לניתוח נוסף. השימוש בTTT כדי לעקוב אחר התנהגות תא בודדה מאפשר ניתוח חד משמעי של מספר פרמטרים ואינו דורש שימוש בתווית ניאון למקם את התאים הספציפיים תחת השגחה. הטכניקה מגלה הבדלים בהתנהגות תא אפיתל חלב שקשה למדוד בסעיפי רקמות סטטיות של בלוטת חלב. מדידות חיים סלולריים לכמת את מספר השעות בין אירועי mitotic. מדידה זו מספקת נתונים ספציפיים על מספר בפועל של שעות בין חלוקות תא המציינים את אורכו של מחזור התא בשעות. חוקר יכול להשתמש בנתונים אלה כדי לקבוע כיצדשינויים ספציפיים גנטיים או אורך תרבות תנאי השפעה במחזור תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לBofan וו והנוצרי Raithel לקבלת סיוע טכני ומיכאל ריגר להקדמתו להדמיה חייה תאים. נתמך על ידי NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), דויטשר Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), משרד ההגנה W81XWH-11-1-0074 (REN), תכנית WCU (World Class אוניברסיטה) באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה ממומנת על ידי משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (ציוד מתקן גדר מכרסם), וNIH NCI 5P30CA051008 (מיקרוסקופי ומשאבי הדמיה ובעלי חיים משותפים).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse StemCell Technologies 05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse StemCell Technologies 05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) StemCell Technologies 02633
Collagenase/Hyaluronidase StemCell Technologies 07912
Disposable Scapels Feather 2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution StemCell Technologies 37150
Ammonium Chloride StemCell Technologies 07800
Tryspin-EDTA StemCell Technologies 07901
Dispase StemCell Technologies 07913
DNase I StemCell Technologies 07900
40 μm cell strainer StemCell Technologies 27305
FBS StemCell Technologies 06100
PenStrep Gibco 15140

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
  2. Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
  3. Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).
  4. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
  5. Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
  6. Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
  7. Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
  8. Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
  9. Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
  10. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).

Tags

סרטן ביולוגיה גיליון 72 רפואה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית אנטומיה פיזיולוגיה אונקולוגיה בלוטות חלב בעלי חיים תאי אפיתל עכברים התאמה גנטי תרבות הראשונית של תא הדמית זמן לשגות גילוי מוקדם של סרטן מודלים גנטית התרבות העיקרית של תאים תאי האפיתל חלב preneoplastic עכברים מהונדסים גנטי זמן לשגות הדמיה BRCA1 מודל חיה
הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakles, R. E., Millman, S. L.,… More

Nakles, R. E., Millman, S. L., Cabrera, M. C., Johnson, P., Mueller, S., Hoppe, P. S., Schroeder, T., Furth, P. A. Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (72), e50198, doi:10.3791/50198 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter