Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Summary

Time-lapse bildebehandling brukes til å vurdere oppførselen primære preneoplastic mammary epitelceller avledet fra genmanipulerte mus modeller av risikoen for brystkreft for å avgjøre om det er sammenhenger mellom spesifikke atferdsmessige parametere og distinkte genetiske lesjoner.

Abstract

Time-lapse imaging kan brukes til å sammenligne oppførselen dyrkede primære preneoplastic mammary epitelceller utledet fra forskjellige genmanipulerte musemodeller av brystkreft. For eksempel kan tiden mellom celledelinger (celle levetid), apoptotiske celler tall, utviklingen av morfologiske endringer, og mekanismen av kolonien formasjon kvantifiseres og sammenlignes i celler som bærer spesifikke genetiske forandringer. Primære mammary epitel cellekulturer blir generert fra brystkjertlene uten håndgripelig svulst. Kjertler er nøye resected med klart skille fra tilstøtende muskel, blir lymfeknutene fjernet, og encellede suspensjoner av beriket mammary epitelceller genereres av hakking mammary vev etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon og filtrering. Encellede suspensjoner er belagt og plassert direkte under et mikroskop innenfor en inkubator kammer for live-cell imaging. Seksten 650 mikrometer x 700 mikrometer felt i en 4x4-konfigurasjon fra hver well av en 6-brønns plate er avbildes hvert 15 min i 5 dager. Time-lapse bilder er undersøkt direkte å måle mobilnettet atferd som kan inkludere mekanisme og hyppigheten av celle koloni formasjon innenfor de første 24 hr av plating cellene (aggregering versus celledeling), forekomst av apoptose, og innfasing av morfologiske endringer. Encellede sporing brukes til å generere celle skjebne kart for måling av individuelle celle levetid og etterforskning av celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analysert for å vurdere for betydelige forskjeller i oppførsel korrelert med spesifikke genetiske lesjoner.

Introduction

Genmanipulerte mus modeller er verktøy for å studere og forstå hvordan ulike genetiske lesjoner bidrar til risikoen for å utvikle brystkreft. For eksempel har genmanipulerte mus vist at kombinasjonen av tre faktorer: tap av full-lengde bryst 1 kreft, tidlig debut (BRCA1) genet i mammary epitelceller, tumor protein p53 (TP53) bakterie-linje haploinsufficiency og mammary epitelial celle målrettet opp-regulert Østrogen reseptor alfa (ERA) uttrykk resultater i utviklingen av mammary kreft i 100% av BRCA1 ^{floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transactivator (rtTA} mus ved 12 måneders alder i forhold til de lavere prosenter rapportert i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - mus uten ERA over-uttrykk (~ 50 - 60%) og BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} mus uten TP53 haploinsufficiency (<5%). ¹

Dynamisk time-lapse avbildning av oppførselen preneoplastic primære mammary epitelceller avslører forskjeller i celle atferd som er mindre lett verdsatt i statiske vevsdelene. Endringer i spredning og differensiering er observert i primære mammary celler fra menneskelige BRCA1 mutasjon bærere. ² Opprettelse av encellede suspensjoner av primære mammary epitelceller fra normal og genmanipulerte mus genereres gjennom enzymatisk disassociation av resected melkekjertlene. ³ Time-lapse Bildene er vist å vurdere mekanisme og timing av celle koloni utseende og forekomst av morfologiske endringer i celler, inkludert epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering av celle skjebne kartene blir kvantifisering av lengden av tiden mellom celledelinger (celle levetid), og bestemmelse av mønstre av celledeling tilrettelagt av bruk av encellede sporing. Timm'S Sporing Tool (TTT) er offentlig tilgjengelig programvare som brukes til å generere encellede skjebne kart. Sin nytteverdi i belyse mekanismer celle skjebne er etablert ^4,5 undersøke normale hematopoetisk stamcelle utvikling ^6-9 og generering av nerveceller. ¹⁰

Protocol

1. Samlet Scheme

1. Generere primære kulturer av preneoplastic mammary epitelceller fra brystkjertlene ved genmodifisert og kontrollere villtype mus.
2. Capture live-celle bilder hver 15 min med Volocity image oppkjøpet programvare (versjon 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i inntil 5 dager.
3. Vis time-lapse bilder direkte å vurdere timing og mekanisme epitelcelleopprinnelse koloni dannelse, forekomst av apoptose, og innfasing av morfologiske endringer.
4. Konverter Volocity generert. TIFF stabler til. JPG-filer ved hjelp av MetaMorph Mikroskopi Automation & bildeanalyse programvare (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) og endre navn digitale bildefiler (THE 2.1.6 Endre navn, http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml ) for å aktivere kompatibilitet med Timm sporing Tool programvare (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Bruke TTT, generere celle skjebne kart for bestemmelse av tiden mellom celledelinger (celle levetid) og mønstre for celledeling (symmetrisk versus asymmetrisk).
6. Analysere kvantitative data fra trinn 3 og 5 ovenfor for å avgjøre om det er statistisk signifikante forskjeller mellom ulike genmodifisert mus modeller og / eller villtype kontroller.

2. Generasjon av Primary mammary Epiteliale cellekulturer

1. Forbered Komplett Media for isolering av enkle mammary epitelceller etter en variant av produsentens instruksjoner (EpiCult-B Mouse Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Kombiner 450 ml Epi-Cult-B medium, 50 ml epi-Cult B spredning supplement, 5% føtalt bovint serum (FBS), 50 ug / ml penicillin / streptomycin (PenStrep) og 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF).
2. Forbered Dissosiasjon Media ved å kombinere en del av en 10x collagenase / Hyaluronidase blanding med 9 deler Komplett Media fra 2.1.
3. Avlive mus og umiddelbart videre til obduksjon. Place musen på ryggen på en styrofoam obduksjon plattform og sikre alle fire lemmer så ventral hud er stram. Mette ventral hud og hår, herunder at overliggende beina, med 70% etanol. Expose # 2/3 (thorax) og # 4/5 (inguinal) brystkjertlene ved å lage en midtlinjesnitt gjennom huden (ikke inn i peritoneum) som er utvidet til et Y-snitt gjennom den mediale huden hver foran lem og en opp-ned Y snitt gjennom den mediale huden hver bakre lem.
4. Ved hjelp av stump disseksjon, skille huden fra underlyingperitoneum, trekke tilbake på begge sider av huden før det er stramt, og fest den til styrofoam obduksjon plattform ved hjelp pins. Starter fra yttersida, bruker butt disseksjon med fornuftig bruk av disseDette skjer saks til å isolere intakt inguinal og / eller thorax melkekjertler fra underliggende bindevev og muskler. Plasser ikke mer enn to brystkjertlene i en 10 cm steril petriskål og flytte til vevskultur panseret.
5. I vev kultur hette, undersøke kjertler for mammary lymfeknuter som er identifisert som små, godt avgrensede knuter med en gulaktig farge. Fjerne lymfeknuter fra den omkringliggende kjertel ved hjelp steril skalpell og tang. Finhakk mammary vev i ~ 1 mm ³ kuber ved hjelp av to sterile skalpeller, en i hver hånd.
6. Plass hakket mammary vev i 5 ml Dissosiasjon Media, bland ved forsiktig pipettering opp og ned 2-3 ganger ved hjelp av en 10 ml pipette og inkuberes over natten (opp til ~ 16 timer) i en 37 ° C inkubator med 5% CO ₂ i en 50 ml konisk tube med løsnet cap.
7. Neste morgen, forberede en kald blanding av 1 del Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) inneholdende 2% FBS og 4 deler bufret ammoniumkloridoppløsning å markedsføre rød blood cellelyse (HFAmCl) samt kaldt HBSS supplert med 2% FBS (HF). Forvarme Trypsin-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispase i Hanks Balanced Salt Solution endret, 1 mg / ml DNase I og Komplett Media.
8. Fjern konisk sentrifugerør med mammary vev fra inkubatoren og forsiktig pulsere vortex 2-3 sek to ganger. Sentrifuger røret på 450 x g i 5 min (romtemperatur eller 4 ° C), og kast supernatanten.
9. Resuspender pellet i et minimum på 10 ml HFAmCl og sentrifuger ved 450 x g i 5 min (romtemperatur eller 4 ° C), og kast supernatant.
10. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA i pellet og bland først med en 5 ml pipette og deretter med en P1000 micropipettor inntil trevlet (1-3 min). Tilsett 10 ml HF, sentrifuger ved 450 x g i 5 min (romtemperatur eller 4 ° C), og kast supernatant.
11. Tilsett 2 ml av 5 mg / ml og Dispase 200 ul av 1 mg / ml DNase I til pelleten og bland med en P1000 micropipettor i 1 min. Prøven bør være cloUdy men ikke trevlet. Hvis trevlet, tilsett 100 ul DNase I og bland igjen.
12. Tilsett 10 ml kald HF, press gjennom en 40 um celle silen og sentrifuger ved 450 x g i 5 min (romtemperatur eller 4 ° C), og kast supernatant.
13. Resuspender endelige pellet i Komplett Media. Kvantifisere det totale antall av celler (ved hjelp av en eller hemocytometer Coulter Counter). To melkekjertler gir ca 1 x 10 ⁶ til 1 x 10 ⁷ celler. Plate primære epitelceller i en flatbunnet 6-brønns plate ved en densitet på 1,5 x 10 ⁵ celler per brønn.

3. Live-celle Imaging

1. Umiddelbart etter plating cellene, plasserer den 6-brønners plate sikkert på et mikroskop scenen innen 5% CO ₂ / mettet humidity/37 ° C temperatur inkubasjon kammer. Juster kondensator for Kohler belysning og sentrum fase ringer. For forsøkene som presenteres her, en omvendt Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalmikroskop system i Widefield fasekontrast modus med en 10x objektiv ble brukt.
2. Åpen bilde oppkjøpet programvare, opprette og navngi et bibliotek for time-lapse bilder og lagre til et sted med nok plass til store filer. Forsøkene som presenteres her utnyttet Volocity image oppkjøpet programvare (versjon 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. La maskinen ekvilibrere i mikroskopet inkubator for minimum 15 min. Senk linser for å unngå scene-objektiv forstyrrelser. Under "Stage" overskrift, velg "Kalibrer Stage." Reacquire fokalplanet, set Z = null under x, y, z-kategorien og mark bildebehandling poeng ved å velge "Legg til punktet" under "Stage" overskriften. Stedsnavn poeng i midten av hver brønn av seks-brønners plate for bildebehandling som fasekontrast avbildning kan være forvrengt ved periferien av plast brønner. Ordne poeng i en firkant i 4 x 4 felt (650 mikrometer x 700 mikrometer felt), hver med en liten overlapping (ca 5%). Lagre de valgte punktene under "Stage. "
4. Under "Stage" velg "Make fokus map" og følg instruksjonene for å sette fokus på hvert punkt. Still image oppkjøpet timing å fange fire bilder per time (hvert 15 min). Dette kan justeres avhengig av kravene for den spesielle eksperimentet. Lagre fokus kartet under "Stage".
5. Høyreklikk på høyre side verktøylinjen "Image Acquisition" og lagre bildeinnstillinger. Trykk på opptaksknappen for å starte bildebehandling. Etter 1 time, sjekk fokus på bildene for å se om noen justering er nødvendig.
6. Overvåke og fortsette direkte avbildning i 5 dager, og endte når cellene blir konfluent.

4. Direkte visning av Time-lapse bilder å vurdere Timing og Mechanism of Initial epitelcelleopprinnelse Colony Formation, Forekomst av Apoptose, og Innfasing av morfologiske endringer

1. Direkte visning av time-lapse bilder kan utføre ved hjelp av en kompatibel videovisning programvare (for eksempel http:/ / Www.real.com/ RealPlayer eller andre freeware eller kommersielt tilgjengelig programvare). Bilder kan ses i. TIFF-format på dette trinnet eller etter konvertering til. JPG-filer (se trinn 5).
2. Å bestemme mekanismen for første kolonien formasjon, starter med en enkelt-bildestakk representerer en avbildning nettsted på plate. I første rammer, vil cellene bli flytende. Følg serielle bilder til å bestemme når den første epitelceller fester seg til platen. På dette trinnet kan epitelceller identifiseres og skilles fra fibroblaster av deres mer kubisk morfologi. Følg denne enkle epitelcelleopprinnelse gjennom serielle bilder og følge sin skjebne i den påfølgende 24-timers. Spille hvis det blir omgitt av flere epitelceller eller gjennomgår celledeling eller apoptose. Hvis omgitt av epitelceller, kan mekanismen for kolonien dannelse bestemmes direkte ved å se om de omkringliggende celler avledet fra flytende celler som deretter aggregat med den innledende klebende celle (r) ellerfra en divisjon av den innledende heftende celle. Registrere antall kolonier dannet ved celle aggregering versus celledeling under første 24 hr.
3. Å fastslå antall utgangspunktet tilhenger celler som gjennomgår apoptose over en bestemt tidsperiode, følger serielle bilder for utseendet på klassiske elementer apoptose utviklingsland i en celle som har vært tilhenger ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), og antallet av apoptotiske celler identifisert under hele varigheten av avbildning eller innenfor bestemte tidsrammer fart.
4. Over tid epitelceller i kultur endre deres morfologi fra en innledende kubisk form til en mer langstrakt utseende i samsvar med EMT. Følg serielle bilder å bestemme dag / time etter plating når dette skjer.

5. Image File Modification

1. Navn på bildet mapper og filer i henhold til kravene til Timm sporing Tool programvare Bruk et freeware program som Gi nytt navn 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) endre navn på filer i grupper. Lag en mappe som inneholder alle mapper og filer av eksperimentet og gi mappen et navn (f.eks
2. Opprett en undermappe for hvert punkt / posisjon der kulturen ble fotografert. Navngi undermapper: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Posisjonsnummeret bør ha tre sifre. Eksempel: 072511RN_p001. Sette alle bildefiler av at enkelte posisjon i undermappen.
3. Legg til endepunktet (med 5 siffer) og kanalnummer (siden det bare er én lyse feltet kanal, bruker du "0") på slutten av hver fil navn i dette formatet:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Generere en loggfil for hver stilling ved først å laste ned gratis program TTTlogfileconverter fra TTT nettstedet. Start TTTlogfileconverter programmet og velg forsøket mappen. Input et bilde intervall (i sekunder). For et bilde tatt hver 15 min, skriver 900 sek. Deretter trykker du på den grønne skjult loggfiler knappen.

6. Generasjon av Cell Fate Kart over enkeltceller ved hjelp av TTT

1. Create en mappe som heter TTTexport og en undermappe kalt TTTfiles der alle celle sporing data vil bli lagret etter TTT programvare instruksjoner
2. Start TTT programmet, velger brukeren initialer, og klikk "Fortsett".
3. Trykk på "Set NAS", velg brukeren opprettet "TTTexport"-mappen, og klikk OK. I nettleseren velger et eksperiment mappe, velger en posisjon mappe, og trykk deretter på "Load stilling"-knappen.
4. Still okulær faktor til "10x". Laste antall bilder som kreves (lasting alle bildene er anbefalt for første gang).
5. I celle redaktør vinduet, velg "New koloni" under Fil-menyen. I Movie Window, trykk på "Track celle" eller F2 for å begynne å spore en celle.
6. Identifisere en celle i MiMovie vinduet og bruke musen til å plassere markøren over cellen. En sirkel med antall cellen skal vises etter at F2 har blitt klikket på. Bruk "0"-tasten på talltastaturet på tastaturet for å spore plasseringen av cellen og gå videre til neste bilde. Flytte markøren til følge plassering av hver celle gjennom hver ramme. Slik sletter du et spor og gå tilbake til forrige bilde trykk "Del" på det numeriske tastaturet. Til å gå videre rammer uten sporing cellen trykk "3", og til å flytte bakover uten sporing trykker "1" på det numeriske tastaturet.
7. For å markere en celledeling klikker du på "Division"-knappen i Movie vinduet. For å markere celledød klikker du på "Cell døden"-knappen i Movie Window. Når en divisjon har oppstått, kan datterceller spores i samme celle skjebne kartet ved å høyreklikke på sirkelen symbol på den utpekte datteren celle i Cell editor vinduet for å starte sporing-modus.
8. Trykk F10 for å lagre treet. Hvert tre vil spare i den angitte utgang foldER (TTTExport). Å starte en ny celle skjebne kart, velg "New koloni" under "File" og deretter "Open"-menyen i Cell editor vinduet.
9. Tabulere celle levetid data etter å samle fra "Cell data"-kategorien i Cell editor vinduet.

7. Statistiske analyser

1. Bruk enten Student t-test (hvis sammenligne to genotypene) eller ANOVA (hvis sammenligne> to genotypene) for å finne ut om forskjeller i parametriske data som antall innledende celle kolonier, celle liv eller timer før utseendet EMT mellom ulike genotyper er statistisk signifikant. Apoptotisk frekvens kan sammenlignes som / totalt antall celler ved hjelp av gullbelagte Student t-test eller ANOVA eller med Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis når avledet som en prosentandel av adherente celler.
2. Utfør strøm tester ved hjelp av data fra analyser av innledende forsøk for å finne ut hvor mange eksperimentelle replikeres må utføres og celle skjebne kart genereres fra hver gjengivelse for tilstrekkelig statistical strøm ved hjelp av tilgjengelig freeware (f.eks http://statpages.org/ ). I forsøkene som er presentert her, var cellekulturer avledet fra tre mus pr genotype tilstrekkelig til å fastslå om det var statistisk signifikante forskjeller i celle kolonien dannelse og celle levetid når spesifikke genetiske modifikasjoner ble gjort.

Representative Results

Epiteliale og fibroblast celler kan være preget av celle morfologi. Epitelceller har en kubisk form (figur 1A-B) og danner celle kolonier (figur 1A). Fibroblaster, en type stromal celle, har en langstrakt morfologi (figur 1C).

Celler ble avrundet og flyter på utbruddet av imaging (figur 2A-D). Etter tilknytning til platen ble de flat og viste en kubisk-attraksjon utseende (figur 2E, H). Av 4 dager med kultur flertallet av epitelceller avlang EMT-lignende morfologi (figur 2I-L). Denne endringen skjedde med den samme kronologi i alle genotyper studert. Noen digitale bilder var uskarpt fordi Kohler belysning og fase ring justering ikke ble korrekt innstilt (figur 2D, H, L).

Den flytende cellene utviklet seg til avtalte individuelle epitelcelleopprinnelse colonies med 24 timer etter plating (Figur 3A, B). Seriell bildeanalyse avslørte at disse kolonier ble generert av cellen aggregering fremfor celledeling. Mens forstyrrelse av BRCA1 av seg selv ikke endre antall kolonier dannet, tillegg av TP53 haploinsufficiency betydelig redusert antall kolonier dannet og tillegg av ERα over-uttrykk betydelig økt antall kolonier dannet (Figur 3C).

Det er kritisk å overvåke de digitale bildene ervervet og justere fokus kart ofte under den første 24-timers som celler fester til platen og deretter minst to ganger daglig for å sikre at cellene forblir i fokus og kulturer er ikke forurenset. Nøyaktighet av analyser er kompromittert dersom sistnevnte tok bilder celler er ikke er i fokus (figur 4).

I det representative eksperiment presentert her, var et avgjørende spørsmål for å avgjøre om endringer i uttrykket nivås av gener som påvirker mammary kreftrisiko (BRCA1, TP53, og østrogen reseptor 1 (Esr1) ¹⁾ endret antall timer mellom celledelinger (celle levetid) eller påvirket mønstre av divisjonen (symmetrisk versus asymmetrisk) i ikke-cancerous primære mammary epitelceller. For å oppnå dette, ble enkelte celle skjebne kart (trær) generert ved hjelp av TTT. Eksempler på representative celle skjebne kart for hver av de fire testede genotyper er illustrert (figur 5A-D). De fire genotyper av cellene testet var villtype (ingen genetisk manipulasjon) (figur 5A), tap av full-lengde BRCA1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (fig. 5B), tap i fullengdes BRCA1 i kombinasjon med TP53 haploinsufficiency (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (figur 5C), og tap av full-lengde BRCA1 i kombinasjon med TP53 haploinsufficitivisering og gevinst på Esr1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (figur 5D). Generasjon av celle skjebne kartene ble stoppet når cellene ble konfluent (~ 3-4 generasjoner) siden utvetydig sporing av enkeltceller ikke lenger var mulig etter det. Generasjon 0 (tid til første celledeling) ble ikke inkludert i analysene av cellen liv fordi varigheten av generasjon 0 var lengre og mer variabel enn etterfølgende generasjoner. Generasjoner 1, 2, 3, og 4 ble gruppert sammen for de endelige analysene fordi det var ingen signifikante forskjeller i gjennomsnittlig celle liv eller standardfeilen av middelverdien (SEM) mellom disse generasjoner. Sammenligninger av gjennomsnittlig celle levetid mellom de ulike genotyper (figur 5E) viste at tap av full-lengde BRCA1 redusert antall timer mellom celledelinger fra 21,3 ± 1,6 timer (villtype) til 16,5 ± 1,0 time (BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Ingentably, selv tap av en TP53 allel i tillegg til tap av full-lengde BRCA1 er assosiert med en signifikant økning i mammary kreft development1, mener celle levetid var uendret (16,3 ± 1,2 t) sammenlignet med mus som manglet BRCA1 bare. Interessant få av Esr1 i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} mus restaurert celle levetid varighet til nær villtype nivåer (19,3 ± 2,1 timer), selv om disse musene har høyeste forekomsten av mammary kreft utvikling av alle modellene studert here.1 Disse funnene indikerer at tap av full-lengde BRCA1 var ikke alltid forbundet med en forkortet celle levetid, i stedet dette ble endret av over-uttrykk ERα. Mulige neste trinn eksperimenter benytter denne teknologien kan være dose-respons forsøk med ulike østrogener, andre vekstfaktorer, eller kandidat terapi for å måle deres innvirkning på celle levetid i de ulike genetiske backgrounds. I motsetning til virkningen på celle levetid varighet, studerte ingen av de genetiske forandringer her endret celledelingsrate mønstre.

Figur 1. Utseende av en epitelial celle koloni (A), epitelceller (B), og fibroblast (C) fra time-lapse imaging. Epitelceller vises mer kubisk mens fibroblaster vises mer langstrakt. Størrelse barer = 50 mikrometer.

Figur 2. Representative serielle tidsstyrte bilder fra tid 0, 2 og 4 dager viser endringer i cellulær morfologi over tid og forskjeller i utseende med og uten Kohleh belysning. Ved tid 0 belagt celler er flytende (pilspisser AD), med to dager i kulturen de er tilhenger og kan fremvise en kubisk-type morfologi (tykke piler E, H) og med fire dager i kulturen de langstrakte og demonstrere en EMT-lignende morfologi (tynn piler IL). Kohler belysning er tilstede i paneler AC, EG, og IK. Paneler D, H og L illustrere bilder uten Kohler belysning. Bildene er fra samme avbildning punktet over tid. Størrelse barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Tall av epitelcelleopprinnelse kolonier på en dag varierte fra genotype. (A) Avrundet flytende celler i begynnelsen av time-lapse imaging. (B) To representative epitelceller kolonier (piler). (C) ANTALL epithelial celle kolonier / ramme dannet på 24-timers varierte med genotype. Søylediagrammer illustrerer middelverdien og standard feil av gjennomsnittet. * P <0,05, ANOVA. Størrelse barer = 200 mikrometer. Celler isolert fra brystkjertlene uten håndgripelig svulst fra 10 - til 12-måneder gamle BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), og villtype (n = 3) mus ble fotografert for studiene. Fem uavhengige bildebehandling eksperimenter sammensatt av forskjellige kombinasjoner av villtype og genmanipulerte mus ble utført. Media inneholdt fenolrødt. Ingen østrogen ble lagt til. Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Ut av fokus bilder kan ikke være nøyaktigly analysert. Før bildebehandling platen, bør platen sitte i bildebehandling inkubator i 15 minutter å komme i likevekt. Under den første dagen av bildeprodukter, bør fokuset være kontrollert og justert noen få timer. Etter at det bør sjekkes ganger daglig, men generelt forblir mer stabil. Pil viser en ut-av-fokus epitelcelleopprinnelse koloni.

. Figur 5 Cell skjebne kart generert fra encellede sporing ved hjelp av TTT for (A) vill-type, (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} og (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} mus. Celler som ikke kan spores på grunn av tap av rammen eller inn i en konfluent cellelag indikeres med et spørsmålstegn. Når ingen spørsmålstegnangitt, sporing var bevisst endte grunn til celle samløpet og manglende evne til utvetydig følge encellede skjebne. (E) Mean celle levetid variert med genotype. Søylediagrammer illustrerer gjennomsnittlig og standard feil av gjennomsnittlige celle levetid (tiden mellom celledelinger) over generasjoner 1-4 for hver genotype. Middelverdien celle levetid var betydelig kortere i mammary epitelceller avledet fra BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} og BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} i forhold til villtype mus. * P <0,05, ANOVA. Celler isolert fra brystkjertlene uten håndgripelig svulst fra 10 - til 12-måneder gamle BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), og villtype (n = 3) mus ble fotografert for studiene. Fem uavhengige bildebehandling eksperimenter sammensatt av forskjellige kombinasjoner av villtype og genetisk engineered mus ble utført. Media inneholdt fenolrødt. Ingen østrogen ble lagt til. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Kritiske trinn

Det er viktig å sikre at brystkjertlene høstes fra mus av samme alder å kontrollere for aldersrelatert variasjon i mammary epitelcelleopprinnelse atferd. Når plating cellene, bør samme antall celler bli belagt i hver brønn for hver eksperiment. Celler bør være relativt sparsom når plating slik at kulturer ikke blir sammenflytende altfor raskt gjør det mulig å følge flere individuelle celler gjennom serielle bilder. Det er viktig at platen være ekvilibrert i kuvøse før avbildning fordi fokus vil endre seg etter platen ble ekvilibrert. Når bildebehandling har begynt, bør fokus kontrolleres ofte og justeres etter behov, spesielt innen de første 24 timer. Det er viktig å ha temperaturen av inkubatoren regulert og forvarmet. Antallet mennesker som går inn og ut av rommet bør begrenses så mye som mulig. Vi anbefaler å trene alle aspekter av setting opp eksperimentet forhånd for å sikre reproduserbarhet og kvalitetskontroll. Som med alle cellekultur eksperimenter, er sterilitet en viktig sak og standard sterile cellekultur praksis bør brukes til enhver tid.

Lagre og manipulere store bildefiler krever en betydelig mengde minne. En delt nettverksstasjon eller bærbare harddisker kan brukes. Når filene først er konvertert, er det viktig å sørge for at bildene er konsekvent navngitt riktig og plasseres i tilsvarende mapper. Hyppig sparer av digitale data skal utføres gjennom hele prosessen.

Begrensninger

Denne metoden benytter en 2-D kultursystem som ikke tillater for analyse av atferdsmessige forskjeller som kan bli synlig i en 3-D-kultur-system. Varighet av celle levetid kan bare reproduserbart målt etter første observerte celledeling som antall timer til første celledeling etter initial Plating av cellene er variabel.

Mulige endringer

Avhengig av kravene i eksperimentet, kan time-lapse bilder bli tatt mer eller mindre hyppig. For eksempel, hvis forbigående cellulære strukturer skal kvantifiseres, kan en 5 sek intervall være mer hensiktsmessig. Andre prosedyrer for å generere primære mammary epithelial cellekulturer kan benyttes. Hvilkensomhelst avbildning utstyr kan benyttes til å opprette det tidsstyrte imaging, så lenge det er i stand til å oppfylle kravene i eksperimentet. Alternative systemer for encellede sporing kan anvendes. For fremgangsmåten beskrevet her, en standard plast flat bunn 6-brønns plate var tilstrekkelig. Plast retter kan brukes til alle lang arbeidsavstand luft linser som 4x, 10x, og 20x. Det er viktig å velge strøk nær midten av de plast retter ved utføring fasekontrast avbildning ettersom plasten er buet nær kantene i de fleste retter og forvrenger lyset.Dekkglass tykkelse glassbunn brønner ville være nødvendig for normal arbeidsavstand nedsenking linser (olje, vann, glyserol, etc.), som er typisk ved høyere forstørrelse.

Feilsøking

Når cellene er belagt, bør mediet være tilstrekkelig til å opprettholde cellevekst i 5 dager for å redusere behovet for å manipulere platen på scenen, men hvis det er nødvendig, kan mediet bli tilsatt. Det anbefales at fordampning holdes til et minimum. Fordampning bør forvaltes ved å plassere 03:57 retter av sterilt avionisert vann inni inkubatoren og påfylling dem når det er nødvendig. Det er mulig å fylle de ubrukte brønnene i 6-brønns plate med sterilt avionisert vann.

Hvis bilder ikke legger inn i TTT-programmet, må du først kontrollere og sørge for at filene og mappene er ordnet og navngitt riktig. Neste, sjekk om loggfilen er i riktig mappe (se trinn 5.5).

Future program eller retning etter å mestre teknikken

Den samme generelle fremgangsmåte kan brukes til å analysere oppførselen til andre celletyper, inkludert humane primære mammary epitelceller samt brystkreftceller. For eksempel, kan genotypisk-spesifikk atferd og / eller respons for kandidat behandlinger skal analyseres. Alternativt, avbildning av fluorescens-aktivert celle (FAC) sortert cellepopulasjoner kunne utføres eller fluorescerende etiketter lagt til å overvåke bestemte celletyper.

Betydningen av denne teknikken med hensyn til eksisterende metoder

Tilsetting av time-lapse bildebehandling og analyser av celle atferd over tid til tradisjonell cellekultur og merkingsteknikker gir kvantitative data fra enkeltceller over tid snarere enn bare hele populasjonsdynamikk. Denne teknikken gjør enkeltceller å bli observert kontinuerlig, i motsetning til tradisjonelle metoder som tillater observasjon bare ved diskrete tidspunkter. Moreover, tradisjonelle metoder krever cellene å bli forstyrret ved å ta dem i og ut av inkubatoren for å vise dem under et mikroskop mens tilnærmingen beskrevet her som gjør at cellene observeres uten å overføres. Til slutt gir time-lapse bildebehandling en varig registrering av cellene under observasjon som kan returneres til for videre analyser. Bruken av TTT å spore individuell celle atferd tillater en utvetydig analyse av flere parametere, og krever ikke bruk av en fluorescerende markør å lokalisere bestemte celler under observasjon. Teknikken avslører forskjeller i mammary epitelcelleopprinnelse atferd som er vanskelig å måle i statiske vevssnitt av melkekjertler. Cell levetid målinger kvantifisere antall timer mellom mitotiske hendelser. Denne målingen gir spesifikke data for det faktiske antall timer mellom celledelinger indikerer lengden av cellesyklusen i timer. En forsker kan bruke disse dataene til å bestemme hvordanspesifikke genetiske endringer eller kultur forhold påvirker cellesyklus lengde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140