Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Summary

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Abstract

Imagen de lapso de tiempo se puede usar para comparar el comportamiento de cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas derivados de los diferentes modelos de ratón genéticamente modificadas de cáncer de mama. Por ejemplo, el tiempo entre las divisiones celulares (móviles vidas), números de células apoptóticas, la evolución de los cambios morfológicos, y el mecanismo de formación de colonias pueden ser cuantificados y comparados en las células que transportan determinadas lesiones genéticas. Cultivos primarios de células epiteliales mamarias se generan a partir de glándulas mamarias sin tumor palpable. Glándulas son cuidadosamente resecado con clara separación de músculo adyacente, se extraen ganglios linfáticos, y solo suspensiones de células enriquecidas de células epiteliales mamarias se generan por el tejido mamario de picar carne seguido por disociación enzimática y filtración. Solo suspensiones de células se colocan en placas y se coloca directamente bajo un microscopio en una cámara incubadora para vivo de células de imágenes. Dieciséis 650 micras x 700 micras campos en una configuración 4x4 de cada well de una placa de 6-así se crean imágenes cada 15 minutos durante 5 días. Lapso de tiempo imágenes son examinados directamente para medir los comportamientos celulares que pueden incluir mecanismo y frecuencia de formación de colonia de células dentro de las primeras 24 horas de placas las células (agregación frente a la proliferación celular), la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos. Una sola célula de seguimiento se utiliza para generar mapas de destino celular para la medición de tiempos de vida de células individuales y la investigación de los patrones de división celular. Los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente para evaluar las diferencias significativas en el comportamiento correlacionado con determinadas lesiones genéticas.

Introduction

Genéticamente modificados modelos de ratón son herramientas para estudiar y entender cómo diferentes lesiones genéticas que contribuyen al riesgo de desarrollar cáncer de mama. Por ejemplo, los ratones transgénicos han demostrado que la combinación de tres factores: la pérdida de la mama de longitud completa cáncer 1, inicio temprano (BRCA1) de genes en células epiteliales mamarias, la proteína p53 tumor (TP53) de la línea germinal haploinsuficiencia, y epiteliales mamarias célula diana hasta reguladas estrógeno receptor alfa (EEI) los resultados de expresión en el desarrollo del cáncer de mama en el 100% de los genes BRCA1 ^{floxed (f) Virus 11/f11/Mouse tumor mamario (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transactivador (rtTA} ratones a los 12 meses de edad en comparación con los porcentajes más bajos reportados en Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - ratones sin ERa sobre-expresión (~ 50 - 60%) y BRCA1 ratones ^{f11/f11/MMTV-Cre} sin Tp53 haploinsufdeficiencia (<5%). ¹

Dinámica de lapso de tiempo de imagen del comportamiento de preneoplásicas células epiteliales primarias mamarias revela diferencias en el comportamiento de las células que son menos fácilmente apreciadas en secciones de tejido estáticas. Las alteraciones en la proliferación y la diferenciación se observan en células primarias mamarias de humanos portadores de mutaciones BRCA1. ² Creación de una sola célula suspensiones de células primarias epiteliales mamarias normales y de ratones transgénicos se generan a través de la disociación enzimática de tejido extirpado la glándula mamaria. ³ Time-lapse imágenes se ven a evaluar mecanismo y el momento de aparición de células colonia y la incidencia de los cambios morfológicos en las células, incluyendo epitelio-mesenquimal transición (EMT) y la apoptosis. Generación de mapas de destino celular, la cuantificación de la longitud de tiempo entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células), y la determinación de los patrones de división celular se facilita por el uso de una sola célula de seguimiento. TimmHerramienta de Seguimiento 's (TTT) es un software a disposición del público para generar una sola célula de mapas de destino. Su utilidad en la elucidación de mecanismos de destino de la célula se ha establecido ^4,5 examinar el desarrollo normal de células madre hematopoyéticas ^6-9 y la generación de neuronas. ¹⁰

Protocol

1. Esquema General

1. Generar cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas de las glándulas mamarias de animales diseñados genéticamente y controlar ratones de tipo salvaje.
2. Captura de imágenes en vivo de células cada 15 minutos utilizando la imagen Volocity software de adquisición (versión 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) durante un máximo de 5 días.
3. Ver time-lapse imágenes directamente a evaluar el tiempo y el mecanismo de formación de colonias de células epiteliales, la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos.
4. Convertir Volocity generado. Pilas TIFF. Archivos JPG utilizando Automatización MetaMorph Microscopía y software de análisis de imágenes (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) y cambiar el nombre de los archivos de imágenes digitales (el cambio de nombre 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / Sistema / Administración de archivos / THE Rename.shtml- ) para permitir la compatibilidad con el software de la herramienta de seguimiento de Timm (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Uso de TTT, generar mapas de destino celular para la determinación de la hora entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células) y los patrones de división celular (simétrico frente asimétrica).
6. Analizar datos cuantitativos de los pasos 3 y 5 para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes modelos de ratones genéticamente modificados y / o controles de tipo salvaje.

2. Generación de cultivos primarios de células epiteliales mamarias

1. Preparar medios completos para el aislamiento de células epiteliales mamarias individuales después de una variación de las instrucciones del fabricante (EpiCult-B de ratón Medium Kit, StemCell Technologies, Vancouver, BC). Combinar 450 ml Epi-Cult-medio B, 50 ml Epi-Cult suplemento B proliferación, 5% suero bovino fetal (FBS), 50 mg / ml de Penicilina / Estreptomicina (PenStrep) y 10 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF).
2. Preparar Disociación de prensa mediante la combinación de 1 parte de un 10x colagenasa / hialuronidasa mezcla con 9 partes de medio completo de 2,1.
3. Eutanasiar ratón e inmediatamente proceder a la necropsia. Coloque el ratón sobre su espalda en una plataforma necropsia espuma de poliestireno y asegurar las cuatro extremidades para que la piel ventral es tensa. Saturar la piel ventral y el cabello, incluyendo el que cubre las extremidades, con un 70% de etanol. Exponer # 2/3 (torácica) y n º 4/5 (inguinal) glándulas mamarias haciendo una incisión en la línea media a través de la piel (no entre el peritoneo) que se extiende en un Y-incisión en la piel medial de cada extremidad delantera y un revés incisión en Y a través de la piel medial de cada extremidad trasera.
4. Con disección roma separa la piel del underlyingperitoneum, tire hacia atrás en ambos lados de la piel hasta que esté tensa, y fijarlo a la plataforma de la necropsia de espuma de poliestireno con alfileres. Comenzando por el lado exterior, utilice una disección roma con un uso juicioso de Dissection tijeras para aislar el inguinal intacta y / o torácicos glándulas mamarias de tejido conjuntivo subyacente y el músculo. Coloque no más de dos glándulas mamarias en un plato de 10 cm estéril de Petri y se mueven a la campana de cultivo de tejido.
5. En la campana de cultivo de tejidos, glándulas para examinar los ganglios linfáticos mamarios que se identifican como pequeños, bien circunscritos nódulos con un color amarillento. Extirpar los ganglios linfáticos de la glándula que rodea utilizando bisturí estéril y pinzas. Picar el tejido mamario en ~ 1 mm ³ cubos con dos escalpelos estériles, una en cada mano.
6. Place picado tejido mamario en 5 ml de medio de disociación, mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo 2-3 veces usando una pipeta de 10 ml, y se incuba durante la noche (hasta ~ 16 horas) en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ en un tubo cónico de 50 ml con tapón aflojado.
7. A la mañana siguiente, preparar una mezcla fría de solución salina equilibrada de 1 parte de Hanks (HBSS) que contenía FBS al 2% y 4 partes de solución de cloruro amónico tamponada para promover rojo bllisis celular ood (HFAmCl), así como HBSS frío complementado con FBS al 2% (HF). Pre-caliente Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispasa en solución salina equilibrada de Hank modificada, 1 mg / ml de DNasa I, y medios completos.
8. Quitar el tubo de centrífuga cónico con el tejido mamario de la incubadora y suavemente pulso vórtice 2-3 seg dos veces. Centrifugar el tubo a 450 × g durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C), y descartar el sobrenadante.
9. Resuspender el precipitado en un mínimo de 10 HFAmCl ml y centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante.
10. Añadir 3 ml de tripsina-EDTA al sedimento y mezclar primero con una pipeta de 5 ml y luego con una micropipeta P1000 hasta fibrosa (min 1-3). Añadir 10 ml de HF, centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante.
11. Añadir 2 ml de 5 mg / ml Dispasa y 200 l de 1 mg / ml de DNasa I de la pastilla y la mezcla con una micropipeta P1000 durante 1 min. La muestra debe ser cloudy pero no fibrosa. Si fibrosa, añadir 100 ml de DNasa I y mezclar de nuevo.
12. Añadir 10 ml de HF frío, la tensión a través de un filtro de células 40 micras y se centrifuga a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante.
13. Resuspender el sedimento final en medio completo. Cuantificar el número total de células (usando un hemocitómetro o contador Coulter). Dos glándulas mamarias producen aproximadamente 1 x 10 ⁶ a 1 x 10 ⁷ células. Primario de placa de las células epiteliales en un fondo plano 6-así placa a una densidad de 1,5 x 10 ⁵ células por pocillo.

3. Vivo de células de imágenes

1. Inmediatamente después de sembrar las células, se coloca la placa 6-así de forma segura en una platina de microscopio en un 5% de CO ₂ / saturado humidity/37 ° C de temperatura de la cámara de incubación. Ajuste el condensador para iluminación Kohler y el centro de los anillos de fase. Para los experimentos presentados aquí, un invertido Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema de microscopio en el modo de campo amplio de contraste de fase con una lente de objetivo de 10x se utilizó.
2. Abra el software de adquisición de imágenes, crear y nombrar una biblioteca para las imágenes con lapso de tiempo, y guardar en un lugar con suficiente espacio para archivos grandes. Los experimentos que aquí se presenta la imagen utilizada Volocity adquisición de software (versión 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Permitir que la placa se equilibre en el microscopio incubadora durante un mínimo de 15 min. Baje las lentes para evitar etapa de lente interferencia. En el marco del "Stage", seleccione "Calibrar escenario". Readquirir el plano focal conjunto, Z = cero en los puntos x, y, z pestaña y marca de imagen seleccionando "Añadir punto" en el "Stage" la partida. Coloque puntos en el medio de cada pocillo de la placa de 6 pocillos para la formación de imágenes como formación de imágenes de contraste de fase puede estar distorsionada cerca de la periferia de pocillos de plástico. Organizar puntos en un cuadrado en 4 x 4 campos (650 x 700 micras campos micras), cada uno con una pequeña parte (alrededor del 5%). Guardar los puntos seleccionados en "Stage ".
4. En "Stage", seleccione "Crear mapa foco" y siga las instrucciones para ajustar el enfoque de cada punto. Establezca el tiempo de adquisición de imágenes para capturar 4 imágenes por hora (cada 15 minutos). Esto se puede ajustar dependiendo de los requisitos del experimento específico. Guarde el mapa foco en "Stage".
5. Haga clic en la herramienta del lado derecho "Adquisición de imágenes de" bar y guardar los ajustes de imagen. Pulse el botón de grabación para comenzar la creación de imágenes. Después de 1 hora, comprobar el enfoque de las imágenes para ver si es necesario realizar ajustes.
6. Monitorear y continuar imágenes en vivo durante 5 días, y termina cuando las células se vuelven confluentes.

4. Visualización directa de imágenes de lapso de tiempo para evaluar la oportunidad y Mecanismo de Formación Inicial epitelial colonia de células, la incidencia de la apoptosis y la eliminación gradual de los cambios morfológicos

1. Visualización directa de imágenes con lapso de tiempo se puede realizar utilizando cualquier software de visualización de vídeo compatible (por ejemplo, http:/ / Www.real.com/ realplayer u otro software freeware o disponible comercialmente). Las imágenes pueden verse en. Formato TIFF en este paso o después de la conversión a archivos JPG. (Ver paso 5).
2. Para determinar mecanismo de formación de colonias inicial, comenzar con una pila de una sola imagen que representa un sitio de formación de imágenes en la placa. En las tramas iniciales, las células será flotante. Siga imágenes seriadas para determinar cuando la célula epitelial primero se adhiere a la placa. En este paso, las células epiteliales pueden ser identificadas y diferenciadas de fibroblastos por su morfología más cuboidal. Siga esta célula epitelial solo a través de imágenes en serie y seguir su destino a través de las siguientes 24 horas. Registrar si se convierte rodeada por otras células epiteliales o se somete a la división celular o la apoptosis. Si rodeada por las células epiteliales, el mecanismo de formación de colonias se puede determinar directamente mediante la visualización de si las células circundantes se derivan de células flotantes que luego se agregan con la célula inicial adherente (s) ode división de la célula adherente inicial. Registrar el número de colonias formadas por agregación de células frente a la división celular durante la primera 24 hr.
3. Para determinar el número de células adherentes que inicialmente se someten a apoptosis durante un período de tiempo específico, siga imágenes en serie para la aparición de características clásicas de la apoptosis en desarrollo en una célula que ha sido adherente ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), y el número de células apoptóticas detectadas durante toda la duración de la formación de imágenes o dentro de marcos de tiempo específicos registrados.
4. Con el tiempo, las células epiteliales en cultivo alterar su morfología a partir de una forma cuboide inicial a un aspecto más alargado consistente con EMT. Siga imágenes seriadas para determinar el día / hora después de la siembra, cuando esto ocurre.

5. Modificación del archivo de imagen

1. Cambiar el nombre de las carpetas de imágenes y archivos de acuerdo con los requisitos de software Timm herramienta de seguimiento Utilice un programa gratuito como THE Rename 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) para cambiar el nombre de archivos en grupos. Crear una carpeta que contiene todas las carpetas y archivos de la experiencia y el nombre de la carpeta (por ejemplo,
2. Cree una subcarpeta para cada punto / posición en la que se tomaron imágenes de la cultura. Nombra las subcarpetas: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. El número de posición debe tener 3 dígitos. Ejemplo: 072511RN_p001. Poner todos los archivos de imagen de esa posición individual en la subcarpeta.
3. Añadir el punto de tiempo (utilizando 5 dígitos) y el número de canal (ya que sólo hay un canal de campo brillante, utilice "0") al final de cada nombre de archivo en este formato:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Generar un archivo de registro para cada puesto, en primer lugar descargar el programa TTTlogfileconverter gratuitamente del sitio de TTT. Inicie el programa TTTlogfileconverter y seleccione la carpeta experimento. Entrada de un intervalo de imagen (en segundos). Para obtener una imagen tomada cada 15 minutos, entre 900 seg. A continuación, pulse el botón verde de registro encubierto archivos.

6. Generación de mapas destino celular de las células individuales mediante TTT

1. Crear una carpeta llamada TTTexport y una subcarpeta llamada TTTfiles donde todos los datos de seguimiento de móviles serán almacenados siguiendo las instrucciones del software TTT
2. Inicie el programa TTT, seleccione las iniciales del usuario y haga clic en "Continuar".
3. Pulse el botón "Set NAS", seleccionar el usuario creado "TTTexport" carpeta y haga clic en Aceptar. En el navegador, seleccione una carpeta experimento, seleccione una carpeta de posición y pulse "Load posición" botón.
4. Establecer factor de ocular a "10x". Cargar el número de imágenes requeridas (carga de todas las imágenes se recomienda por primera vez).
5. En la ventana de la celda editor, seleccione "colonia Nuevo" en el menú Archivo. En la ventana de Película, pulse la "célula Track" o F2 para comenzar a rastrear un celular.
6. Identificar una célula en la Movie ventana y el uso del ratón para colocar el cursor sobre la celda. Un círculo con el número de la celda debe aparecer después de F2 se ha hecho clic. Use la tecla "0" en el teclado numérico del teclado para rastrear la ubicación de la celda y pasar a la siguiente foto. Mover el cursor para seguir la colocación de cada celda a través de cada cuadro. Para eliminar una pista y volver a la imagen anterior pulse "Supr" en el teclado numérico. Para mover fotogramas a término sin el seguimiento de la prensa célula "3", y para mover hacia atrás sin el seguimiento presione "1" en el teclado numérico.
7. Para marcar una división celular clic en la "división" en la ventana Movie. Con motivo de la muerte celular clic en la "muerte celular" en la ventana Movie. Una vez que se ha producido una división, las células hijas pueden ser rastreados en el mapa de celdas misma suerte al hacer clic derecho sobre el símbolo del círculo de la célula hija designado en la ventana del editor de la célula para iniciar el modo de seguimiento de forma automática.
8. Pulse F10 para guardar el árbol. Cada árbol se guardará en la tapa de salida designadoer (TTTExport). Para iniciar un mapa del destino celular nuevo, seleccione "colonia Nuevo" del menú "Archivo" y luego "Abrir" del menú en la ventana del editor Cell.
9. Tabular los datos de la celda de por vida después de la recolección de "Celda de datos" pestaña en la ventana de editor Cell.

7. Los análisis estadísticos

1. Utilizar cualquiera de Student t-test (si se comparan dos genotipos) o ANOVA (si se compara> dos genotipos) para determinar si las diferencias en los datos paramétricos, tales como el número de colonias de células iniciales, tiempos de vida celulares o horas hasta la aparición de EMT entre genotipos diferentes son estadísticamente significativo. Frecuencia de apoptosis puede ser comparado como el número / número total de células chapados utilizando la t de Student o prueba de ANOVA o con Mann-Whitney o Kruskal-Wallis cuando se derivan como un porcentaje de células adherentes.
2. Realizar pruebas de potencia utilizando datos de los análisis de experimentos iniciales para determinar cuántas repeticiones experimental necesario para realizar mapas y destino celular generada a partir de cada réplica para s adecuadapoder tatistical usando software libre disponible (por ejemplo http://statpages.org/ ). En los experimentos presentados aquí, cultivos celulares derivados de tres ratones por genotipo fueron suficientes para determinar si había diferencias estadísticamente significativas en la formación de células colonia y tiempos de vida de células específicas cuando se hicieron modificaciones genéticas.

Representative Results

Las células epiteliales y fibroblastos se pueden distinguir por la morfología celular. Las células epiteliales tienen una forma cuboide (Figura 1A-B) y forman colonias de células (Figura 1A). Los fibroblastos, un tipo de células del estroma, tienen una morfología alargada (Figura 1C).

Las células se redondean y flotando en el inicio de la formación de imágenes (Figura 2A-D). Después de la unión a la placa plana y se volvieron demostrado una apariencia de tipo cuboidal (2E Figura, H). A los 4 días de cultivo de la mayoría de las células epiteliales alargadas en una morfología EMT-like (Figura 2I-L). Este cambio se produce con la misma cronología en todos los genotipos estudiados. Algunas de las imágenes digitales eran borrosas porque la iluminación Kohler y alineación anillo de fase no se ha establecido correctamente (Figura 2 D, H, L).

Las células flotantes se convirtieron en colonos individuo definido de células epitelialeses por 24 hr después de la siembra (Figura 3A, B). Análisis de la imagen de serie reveló que estas colonias fueron generados por la agregación de células en lugar de la división celular. Aunque la interrupción de los genes BRCA1 por sí misma no altera el número de colonias formadas, además de Tp53 haploinsuficiencia redujo significativamente el número de colonias formadas y adición de ERα sobre-expresión aumentó significativamente el número de colonias formadas (Figura 3C).

Es fundamental para el seguimiento de las imágenes digitales adquiridas y ajustar el mapa de foco frecuentemente durante las primeras 24 horas como células unen a la placa y luego al menos dos veces al día para asegurar que las células permanecen en el enfoque y culturas no se contaminen. Exactitud de los análisis se ve comprometida si las células con imagen no están en foco (Figura 4).

En el experimento representativo que aquí se presenta, de una cuestión fundamental fue determinar si los cambios en el nivel de expresións de genes conocidos por afectar el riesgo de cáncer de mama (BRCA1, TP53, y los receptores de estrógenos 1 (ESR1) ¹⁾ modifica el número de horas entre divisiones celulares (tiempo de vida de células) o impactado los patrones de división (simétrico frente asimétrica) en no canceroso primaria de las células epiteliales mamarias. Para lograr esto, los mapas individuales destino celular (árboles) se generaron utilizando TTT. Ejemplos representativos de mapas de destino celular para cada uno de los cuatro genotipos ensayados se ilustra (Figura 5A-D). Los cuatro genotipos de las células de la prueba eran de tipo salvaje (sin manipulación genética) (Figura 5A), la pérdida de longitud completa Brca1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (Figura 5B), la pérdida de longitud completa Brca1 en combinación con Tp53 haploinsuficiencia (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (Figura 5C), y la pérdida de longitud completa Brca1 en combinación con Tp53 haploinsufficitransparencia y la ganancia de ESR1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (Figura 5D). Generación de mapas de destino celular se detiene cuando las células se volvieron confluentes (~ generaciones 3-4) desde el seguimiento inequívoco de células individuales ya no fue posible después de eso. Generación 0 (tiempo de la primera división celular) no se incluyó en los análisis de los tiempos de vida móvil, pues la duración de la generación 0 fue más largo y más variables que las generaciones posteriores. Generaciones 1, 2, 3 y 4 fueron agrupados para el análisis final porque no hubo diferencias significativas en la vida media de la célula o el error estándar de la media (SEM) entre estas generaciones. Las comparaciones de los tiempos de vida media de células entre los diferentes genotipos (Figura 5E) reveló que la pérdida de longitud completa Brca1 redujo el número de horas entre las divisiones celulares de 21,3 ± 1,6 h (de tipo salvaje) a 16,5 ± 1,0 h (Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Notablemente, aunque la pérdida de un alelo Tp53 además de la pérdida de longitud completa Brca1 se asocia con un aumento significativo en desarrollo1 cáncer mamario, vida media celda se mantuvo sin cambios (16,3 ± 1,2 h) en comparación con los ratones que carecen sólo Brca1. Curiosamente ganancia de ESR1 en BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} ratones restaura toda la vida celular duración de cerca de niveles de tipo salvaje (19,3 ± 2,1 horas), aunque estos ratones tienen la mayor incidencia de desarrollo de cáncer mamario de todos los modelos estudiados here.1 Estos resultados indican que la pérdida de longitud completa Brca1 no era invariablemente asociado con una vida celular se acorta, en lugar este fue modificada por sobre-expresado ERα. Posibles siguiente paso experimentos que utilizan esta tecnología podría ser dosis-respuesta experimentos utilizando diferentes estrógenos, otros factores de crecimiento o terapéuticos candidatos para medir su impacto en la vida celular en el backgro genético diferenteunds. En contraste con los efectos sobre la duración de vida de la célula, ninguna de las alteraciones genéticas aquí estudiados patrones alterados de la división celular.

Figura 1. Apariencia de una colonia de células epiteliales (A), células epiteliales (B), y de fibroblastos (C) de formación de imágenes de lapso de tiempo. Células epiteliales parecen más cuboidal mientras que los fibroblastos aparecen más alargada. Bares Tamaño = 50 micras.

Figura 2. Seriadas representativas de lapso de tiempo imágenes de tiempo 0, 2 y 4 días demuestran los cambios en la morfología celular con el tiempo y diferencias en la apariencia con y sin Kohler iluminación. En el tiempo 0 las células sembradas están flotando (AD puntas de flecha), por dos días en cultivo que son adherentes y pueden presentar una morfología de tipo cuboidal (flechas gruesas E, H) y por cuatro días en cultivo se alargan y demostrar una EMT-como la morfología (IL flechas delgadas). Kohler iluminación está presente en los paneles AC, EG, y el CI. Los paneles D, H y L ilustrar imágenes sin iluminación Kohler. Las imágenes mostradas son desde el punto de imagen mismo tiempo. Tamaño bares = 200 m. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. El número de colonias de células epiteliales en 1 día variado por el genotipo. (A) redondeado células flotantes en el comienzo de la imagen de lapso de tiempo. (B) Dos colonias representativas de células epiteliales (flechas). (C) Los números de los epitelioscolonias de células L / trama formada en 24 hr variado por el genotipo. Los gráficos de barras muestran la media y el error estándar de la media. * P <0,05, ANOVA. Bares Tamaño = 200 micras. Las células aisladas de las glándulas mamarias sin tumor palpable de 10 - a 12 meses de edad Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), ^f11/f11 BRCA1 ^{/ MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), y de tipo salvaje-(n = 3) ratones fueron imágenes para los estudios. Cinco experimentos de imagen independientes compuestas de diferentes combinaciones de los ratones de tipo salvaje y de ingeniería genética se realizaron. Medios contenía rojo de fenol. No estrógeno se añadió. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4. Fuera de foco imágenes no puede ser precisoLy analizado. Antes de formación de imágenes de la placa, la placa debe sentarse en la incubadora de formación de imágenes durante 15 min para equilibrar. Durante el primer día de la proyección de imagen, el enfoque debe ser revisado y ajustado cada pocas horas. Después de que se debe comprobar dos veces al día, pero en general se mantiene más estable. La flecha indica una colonia fuera de foco de células epiteliales.

. Figura 5 mapas generados a partir de células suerte de una sola célula de seguimiento con TTT para (A) de tipo salvaje, (B) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} y (D) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} ratones. Las células que no pueden ser seguidos debido a la pérdida de marco o en una capa de células confluentes se indican con un signo de interrogación. Cuando no hay un signo de interrogaciónindicado, el seguimiento se terminó deliberadamente debido a la confluencia celular y la incapacidad de seguir inequívocamente unicelular destino. (E) La media de vida de células varió según el genotipo. Los gráficos de barras muestran la media y el error estándar de los tiempos de vida media de células (tiempo entre divisiones celulares) a través de generaciones 1-4 para cada genotipo. Mean vidas células fueron significativamente más corta en las células epiteliales mamarias derivados de BRCA1 BRCA1 y ^{f11/f11/MMTV-Cre f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} en comparación con ratones de tipo salvaje. * P <0,05, ANOVA. Las células aisladas de las glándulas mamarias sin tumor palpable de 10 - a 12 meses de edad Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), ^f11/f11 BRCA1 ^{/ MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), y de tipo salvaje-(n = 3) ratones fueron imágenes para los estudios. Cinco experimentos de imagen independientes compuestas de diferentes combinaciones de tipo salvaje y genéticamente engineered ratones se realizaron. Medios contenía rojo de fenol. No estrógeno se añadió. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Los pasos críticos

Es importante asegurarse de que las glándulas mamarias se cosechan a partir de ratones de la misma edad de controlar por edad relacionados con la variabilidad en el comportamiento de células epiteliales mamarias. Cuando en placas las células, el mismo número de células se deben sembraron en cada pocillo para cada experimento. Las células deben ser relativamente escasa cuando enchapado, de modo que las culturas no se hacen confluentes demasiado rápido por lo que es posible seguir múltiples células individuales a través de imágenes en serie. Es esencial que la placa de ser equilibrada en la incubadora antes de formación de imágenes debido a que el enfoque de cambio después de la placa se equilibra. Una vez que ha comenzado imagen, el enfoque debe revisarse con frecuencia y ajustar según sea necesario, sobre todo en las primeras 24 horas. Es importante tener la temperatura de la incubadora regulada y pre-calentado. El número de personas que entran y salen de la sala debe limitarse tanto como sea posible. Se recomienda la práctica de todos los aspectos de setting hasta el experimento de antemano para asegurar la reproducibilidad y control de calidad. Al igual que con todos los experimentos de cultivo celular, la esterilidad es un problema importante y siga las prácticas de cultivo de células estériles se debe utilizar en todo momento.

Almacenamiento y manipulación de los archivos de imagen de gran tamaño requiere una cantidad sustancial de espacio de memoria. Una unidad de red compartida o discos duros portátiles pueden ser utilizados. Una vez que los archivos se convierten, es importante asegurarse de que las imágenes son consistentemente nombrado correctamente y se colocan en las carpetas correspondientes. Frecuente guarda de datos digitales deben realizarse durante todo el proceso.

Limitaciones

Este método utiliza un sistema de cultivo de 2-D que no permite el análisis de las diferencias de comportamiento que pueden ser evidentes en un sistema de cultivo de 3-D. La duración de los tiempos de vida de células sólo pueden ser reproducible medido después de la primera división celular observada como el número de horas de la primera división celular después de initchapado ial de las células es variable.

Posibles modificaciones

Dependiendo de los requisitos del experimento, con lapso de tiempo se pueden tomar imágenes más o menos frecuentemente. Por ejemplo, si transitorios estructuras celulares son a cuantificar, un intervalo de 5 segundos puede ser más apropiado. Otros procedimientos para generar cultivos primarios de células epiteliales mamarias pueden ser utilizados. Cualquier equipo de formación de imágenes puede ser utilizado para crear la imagen de lapso de tiempo, el tiempo que es capaz de satisfacer los requisitos del experimento. Sistemas alternativos para una sola célula de seguimiento puede ser empleado. Para el procedimiento descrito aquí, una norma de fondo plano de plástico 6-así placa era adecuado. Platos de plástico se puede utilizar para todas las lentes de trabajo largas de aire a distancia como la 10x 4x, y 20x. Es importante elegir regiones cercanas al centro de las placas de plástico al realizar formación de imágenes de contraste de fase ya que el plástico está curvada cerca de los bordes en la mayoría de los platos y distorsiona la luz.Cubreobjetos de vidrio de espesor pocillos de fondo que se requeriría para lentes de distancia normal de trabajo de inmersión (aceite, agua, glicerol, etc), que son típicamente a mayor aumento.

Solución de problemas

Cuando las células se colocan en placas, medios de comunicación debe ser suficiente para mantener el crecimiento de las células durante 5 días para disminuir la necesidad de la manipulación de la placa en el escenario, sin embargo, si es necesario, los medios de comunicación puede ser añadido. Se recomienda que la evaporación se mantiene al mínimo. La evaporación debe ser gestionada por la colocación de tres-cuatro platos de agua desionizada estéril dentro de la incubadora y rellenarlos cuando sea necesario. Es posible llenar los pocillos no utilizados de la 6-así placa con agua desionizada estéril.

Si las imágenes no se cargan en el programa TTT, compruebe y asegúrese de que los archivos y carpetas se organizan y nombrado correctamente. A continuación, compruebe si el archivo de registro se encuentra en la carpeta correcta (vea el paso 5.5).

Futureaplicación o dirección técnica después de dominar

El mismo procedimiento general que se podría utilizar para analizar el comportamiento de otros tipos de células primarias humanas, incluyendo células epiteliales mamarias, así como células de cáncer de mama. Por ejemplo, genotípica comportamiento específico y / o respuesta a tratamientos candidatos pueden ser analizados. Alternativamente, las imágenes de fluorescencia de células activadas (FAC) según las poblaciones de células podría ser realizado o marcadores fluorescentes añadido a vigilar los tipos de células específicos.

Importancia de esta técnica con respecto a los métodos existentes

La adición de time-lapse y análisis del comportamiento de células en el tiempo al cultivo celular y las técnicas tradicionales de etiquetado proporciona datos cuantitativos de las células individuales en el tiempo y no sólo la dinámica de toda la población. Esta técnica permite que las células individuales que se observaron continuamente, a diferencia de los métodos tradicionales que permiten la observación sólo en puntos de tiempo discretos. Moreover, los métodos tradicionales requieren las células para ser perturbado por tomarlos en y fuera de la incubadora para ver bajo un microscopio, mientras que el método aquí descrito permite que las células se observa sin ser transferida. Finalmente, el tiempo-lapse de imágenes proporciona un registro permanente de las células bajo observación de que puedan ser devueltas para su ulterior análisis. El uso de TTT para rastrear el comportamiento de células individuales permite un análisis inequívoco de múltiples parámetros y no requiere el uso de un marcador fluorescente para localizar las células específicas en observación. La técnica revela diferencias en el comportamiento de células epiteliales mamarias que son difíciles de medir en secciones de tejido estáticas de la glándula mamaria. Mediciones celulares por vida cuantificar el número de horas entre los eventos mitóticos. Esta medición proporciona datos específicos sobre el número real de horas entre divisiones celulares que indican la longitud del ciclo celular en horas. Un investigador puede utilizar estos datos para determinar cómoespecíficas de modificaciones genéticas o cultura impacto condiciones duración del ciclo celular.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140