Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Summary

Time-lapse billeddannelse til at vurdere adfærd primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra genetisk manipulerede musemodeller af risikoen for brystkræft for at bestemme, om der er sammenhænge mellem bestemte adfærdsmæssige parametre og forskellige genetiske læsioner.

Abstract

Time-lapse billeddannelse kan anvendes til at sammenligne adfærden af ​​dyrkede primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra forskellige genetisk manipulerede musemodeller for brystkræft. For eksempel kan tidsrummet mellem celledelinger (celle levetid), apoptotiske celleantal, udviklingen af ​​morfologiske ændringer, og mekanismerne for kolonidannelse kvantificeres og sammenlignes med celler, der bærer specifikke genetiske læsioner. Primære brystepitelceller cellekulturer genereres fra mælkekirtlerne uden palpable tumor. Kirtler er nøje resekteres med klar adskillelse fra tilstødende muskel, er lymfeknuder fjernet, og enkelt-cellesuspensioner af berigede mammae epitelceller genereres af hakning brystvæv efterfulgt af enzymatisk dissociation og filtrering. Enkelt-cellesuspensioner udplades og anbringes direkte under et mikroskop i en inkubator kammer til live-cell imaging. Seksten 650 um x 700 um felter i en 4x4 konfiguration fra hver well af en 6-brønds plade afbildes hvert 15. minut i 5 dage. Time-lapse billeder undersøges direkte at måle cellulære adfærd, der kan omfatte mekanismen og hyppigheden af ​​celle-kolonidannelse under de første 24 timer af udpladning af cellerne (sammenlægning versus celleproliferation), forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer. Encellede sporing anvendes til at generere celle skæbne kort til måling af enkelte celle levetid og undersøgelse af celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analyseret for at vurdere for store forskelle i adfærd korreleret med specifikke genetiske læsioner.

Introduction

Gensplejsede musemodeller er værktøjer til at undersøge og forstå, hvordan forskellige genetiske læsioner bidrager til risikoen for at udvikle brystkræft. For eksempel har genetisk modificerede mus vist, at kombinationen af tre faktorer: tab af fuldlængde brystkræft 1, tidlig begyndelse (BRCA1) gen i mammale epitelceller, tumor protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency, og brystepitelceller celle målrettet opreguleret østrogen receptor alpha (ERA) ekspression resulterer i udviklingen af brystcancer i 100% af BRCA1 ^{floxet (f) 11/f11/Mouse brysttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyclin transaktivator (rtTA} mus ved 12 måneders alderen i forhold til de lavere procentsatser rapporteret i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - mus uden ERA overekspression (~ 50 - 60%) og BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} mus uden TP53 haploinsuftet (<5%). ^en

Dynamisk time-lapse billeder af adfærd præneoplastiske primære brystepitelceller celler afslører forskelle i celle adfærd, der er mindre let værdsat i statiske vævssnit. Ændringer i proliferation og differentiering er observeret i primære mammae celler fra menneskelige BRCA1 mutation luftfartsselskaber. ² Oprettelse af enkelt-cellesuspensioner af primære brystepitelceller celler fra normal og gensplejsede mus genereres gennem enzymatisk disassociation af resekterede mælkekirtelvævet. ³ Time-lapse billeder er set at vurdere mekanisme og timingen af ​​celle-koloni udseende og forekomsten af ​​morfologiske ændringer i celler, herunder epitel-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering af celle skæbne kort, er kvantificering af længden af ​​tid mellem celledelinger (celle levetid), og bestemmelse af mønstre af celledeling lettes ved anvendelse af encellede tracking. Timm'S Tracking Tool (TTT) er offentligt tilgængelig software, der bruges til at generere encellede skæbne kort. Dens anvendelighed til belysning mekanismer celle skæbne er etableret ^4,5 undersøge normale hæmatopoietiske stamceller udvikling ^6-9 og dannelse af neuroner. ¹⁰

Protocol

1. Samlet Scheme

1. Generere primære kulturer af præneoplastiske mammae epitelceller fra mælkekirtler i gensplejsede og styre vildtypemus.
2. Optager direkte-celle billeder hvert 15. minut ved hjælp Volocity billedoptagelse software (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i op til 5 dage.
3. Se time-lapse billeder direkte at vurdere timing og mekanisme af epitelcelle kolonidannelse, forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer.
4. Konverter genereret Volocity. TIFF stakke til. JPG-filer ved hjælp af MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) og omdøbe digitale billedfiler (Omdøb 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml ) at sikre kompatibilitet med Timm s Tracking Tool software (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Ved hjælp af TTT, celle skæbne kort til bestemmelse af tiden mellem celledelinger (celle levetid) og mønstre af celledeling (symmetrisk versus asymmetrisk) generere.
6. Analysere kvantitative data fra trin 3 og 5 ovenfor for at bestemme, om der er statistisk signifikante forskelle mellem forskellige genetisk manipulerede musemodeller og / eller vildtype-kontroller.

2. Generering af primære brystepitelceller Cell Cultures

1. Forbered komplette medier til isolering af enkelte brystepitelceller celler efter en variation af producentens anvisninger (EpiCult-B Mouse Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Kombiner 450 ml Epi-Cult-B medium, 50 ml Epi-Cult B proliferation supplement, 5% føtalt bovint serum (FBS), 50 ug / ml penicillin / streptomycin (PenStrep) og 10 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF).
2. Forbered Dissociation medie ved at kombinere en del af et 10x collagenase / hyaluronidase blanding med 9 dele fuldstændigt medium fra 2.1.
3. Aflive mus og straks videre til obduktion. Placer musen på ryggen på en styrofoam obduktion platform og sikre alle fire lemmer så ventrale hud er stram. Mætte ventral hud og hår, herunder overliggende lemmerne, med 70% ethanol. Expose # 2/3 (thorax) og # 4/5 (inguinale) mælkekirtler ved at lave en midtlinjeincision gennem huden (ikke kommer ind i bughinden), der er forlænget ind i et Y-snit gennem den mediale huden af ​​hver af de forreste ben og en omvendt Y-snit gennem den mediale huden af ​​hvert bageste lemmer.
4. Ved hjælp af stump dissektion, huden adskille fra underlyingperitoneum, trække sig tilbage på begge sider af huden, indtil den er stram, og fastgør det til styrofoam obduktion platformen ved hjælp stifter. Begyndende fra den ydre side, anvendes stump dissektion med fornuftig anvendelse af theseIndsatsen saks for at isolere det intakte inguinale og / eller thorax mælkekirtler fra underliggende bindevæv og muskler. Anbring ikke mere end to mælkekirtler i en 10 cm steril petriskål og flytte til vævskultur hætte.
5. I vævskultur hætte, undersøge kirtler for mammale lymfeknuder, der er identificeret som små, godt omskrevne knuder med en gullig farve. Fjern lymfeknuder fra det omgivende kirtel med steril skalpel og pincetter. Hakkekød brystvæv i ~ 1 mm ³ terninger med to sterile skalpeller, en i hver hånd.
6. Sted hakket brystvæv i 5 ml Dissociation Media, blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned 2-3 gange under anvendelse af en 10 ml pipette, og inkuber natten over (op til ~ 16 timer) i en 37 ° C inkubator med _5% CO2 i en 50 ml konisk rør med løsnet hætte.
7. Den næste morgen, fremstille en kold blanding af 1 del Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende 2% FBS og 4 dele pufret ammoniumchlorid-opløsning til at fremme røde blood cellelyse (HFAmCl) samt kold HBSS suppleret med 2% FBS (HF). Pre-varm Trypsin-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispase i Hanks Balanced Salt Solution Modificeret, 1 mg / ml DNase I, og komplet medium.
8. Fjern konisk centrifugerør med brystvæv fra inkubatoren og forsigtigt pulsere vortex 2-3 sek to gange. Centrifuger røret ved 450 x g i 5 min (stuetemperatur eller 4 ° C), og supernatanten fjernes.
9. Pellet resuspenderes i minimum 10 ml HFAmCl, og der centrifugeres ved 450 x g i 5 min (stuetemperatur eller 4 ° C) og kasser supernatanten.
10. Tilsæt 3 ml trypsin-EDTA til pelleten, og bland først med en 5 ml pipette og derpå med en P1000 mikropipette, indtil trævlet (1-3 min). Der tilsættes 10 ml HF, centrifugeres ved 450 x g i 5 min (stuetemperatur eller 4 ° C) og kasser supernatanten.
11. Tilsættes 2 ml 5 mg / ml Dispase og 200 gl 1 mg / ml DNase I til pelleten, og bland med en P1000 mikropipette i 1 min. Prøve bør cloudy men ikke trævlet. Hvis trævlet, tilsættes 100 ul DNase I og bland igen.
12. Der tilsættes 10 ml koldt HF, stamme gennem en 40 um si celle, og der centrifugeres ved 450 x g i 5 min (stuetemperatur eller 4 ° C) og kasser supernatanten.
13. Resuspender den endelige pellet i komplette medier. Bestemme den samlede antal celler (med et hæmocytometer eller Coulter Counter). To brystkirtler opnåelse af omtrent 1 x 10 ⁶ til 1 x 10 ⁷ celler. Plate primære epitelceller i en fladbundet 6-brønds plade med en tæthed på 1,5 x 10 ⁵ celler pr.

3. Live-cell imaging

1. Umiddelbart efter udpladning af cellerne, anbringes 6-brønds plade forsvarligt på objektbordet i et _5% CO2 / mættet humidity/37 ° C temperatur rugekammeret. Juster kondensator til Kohler belysning og center i fase ringe. Til eksperimenterne præsenteret her, et inverteret Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Konfokalmikroskopsystem i widefield fasekontrast tilstand med et 10x objektiv blev anvendt.
2. Åbn billede erhvervelse software, oprette og navngive et bibliotek for time-lapse billeder, og gemme til en placering med tilstrækkelig plads til store filer. Eksperimenterne præsenteret her udnyttet Volocity billede erhvervelse software (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Lad pladen ækvilibrere i mikroskopet inkubator i mindst 15 min. Sænk linserne for at undgå stage-linse indblanding. Under "Stage" position, skal du vælge "Kalibrer Stage." Generhverve brændplanet, sæt Z = nul under x, y, z fanen og mark imaging points ved at vælge "Tilføj punkt" under "Stage" overskrift. Sted punkter i midten af ​​hver brønd i 6-brønds plade til billeddannelse som fasekontrast billeddannelse kan være forvrænget nær periferien af ​​plastbrønde. Arranger point i en firkant i 4 x 4 felter (650 um x 700 um felter), hver med et lille overlap (ca. 5%). Gem de udvalgte punkter under "Stage. "
4. Under "Stage" vælge "Gør fokus kort", og følg anvisningerne for at indstille fokus på hvert punkt. Indstil billede erhvervelse timing at fange 4 billeder i timen (hver 15 min). Dette kan justeres afhængigt af kravene til den specifikke eksperiment. Gem fokus kortet under "Stage".
5. Højreklik på den højre side værktøj bar "Image Acquisition" og gem de billeddiagnostiske indstillinger. Tryk på optage-knappen for at starte billeddannelse. Efter 1 time kontrollere fokusering af billederne for at se, om nogen justering er nødvendig.
6. Overvåg og fortsætte direkte billedvisning i 5 dage, og stopper, når cellerne bliver sammenflydende.

4. Direkte visning af Time-lapse billeder til Vurdere Timing og Mekanisme Initial epitelcelle kolonidannelse, Forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer

1. Direkte visning af time-lapse billeder kan udføre ved hjælp af en kompatibel video visning software (f.eks http:/ / Www.real.com/ RealPlayer eller andre freeware eller kommercielt tilgængelige software). Billederne kan ses i. TIFF-format på dette trin eller efter konvertering til. JPG-filer (se trin 5).
2. At bestemme mekanismen af ​​den initiale kolonidannelse, begynder med en enkelt-billedstak repræsenterer en imaging sted på pladen. I indledende rammer, vil cellerne være flydende. Følg serielle billeder at bestemme, hvornår den første epitelcelle klæber til pladen. På dette trin kan epitelceller identificeres og skelnes fra fibroblasterne ved deres mere kubisk morfologi. Følg denne enkelt epitelcelle gennem serielle billeder og følge sin skæbne over den efterfølgende 24 timer. Optag hvis det bliver omgivet af andre epitelceller eller undergår celledeling eller apoptose. Hvis omgivet af epitelceller, kan mekanismen for kolonidannelse bestemmes direkte ved at se, om de omgivende celler er afledt fra de flydende celler, som derefter aggregat med den oprindelige adhærente celle (r) ellerved deling af den oprindelige adhærerende celle. Registrere antallet af kolonier dannet af celleaggregering versus celledeling i de første 24 timer.
3. For at bestemme antallet af oprindeligt adhærente celler, der undergår apoptose i løbet af en bestemt tidsperiode, skal du følge serielle billeder for udseende af klassiske egenskaber ved apoptose udvikler sig i en celle, der har været tilhænger ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), og antallet af apoptotiske celler er identificeret under hele varigheden af den billeddannende eller inden for bestemte tidsrammer registreres.
4. Med tiden ændrer epitelceller i kultur deres morfologi fra en første kubisk form til en mere aflang udseende i overensstemmelse med EMT. Følg serielle billeder at bestemme dag / time efter udpladning, når dette sker.

5. Image File Ændring

1. Omdøb billedet mapper og filer i henhold til kravene til Timm s Tracking Tool software Brug et freeware program som Omdøb 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) til at omdøbe filer i grupper. Opret en mappe, der indeholder alle mapper og filer af forsøget, og kald mappen (f.eks
2. Opret en undermappe for hvert punkt / position, hvor kulturen blev afbildet. Navngiv undermapperne: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Stillingen nummer skal have 3 cifre. Eksempel: 072511RN_p001. Sæt alle billedfiler i denne individuelle stilling i undermappen.
3. Tilsæt tidspunkterne (med 5 cifre) og kanalnummer (da der kun er én lyse felt kanal, skal du bruge "0") i slutningen af ​​hver fil navn i dette format:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Generere en logfil for hver position ved først at downloade det gratis program TTTlogfileconverter fra den TTT hjemmeside. Start TTTlogfileconverter programmet og vælg eksperimentet mappe. Input et billede interval (i sekunder). For et billede taget hver 15 min, skal du indtaste 900 sek. Tryk derefter på den grønne skjult log-filer knappen.

6. Generering af Cell Fate Maps af enkeltceller Brug TTT

1. Create en mappe kaldet TTTexport og en undermappe kaldet TTTfiles hvor alle cellesporing data vil blive lagret efter TTT softwareinstruktionerne
2. Start TTT program, skal du vælge brugernes initialer, og klik på "Fortsæt".
3. Tryk på "Set NAS", vælge den bruger skabte "TTTexport" mappe, og klik OK. I browseren, skal du vælge et eksperiment mappe ved at vælge en position mappe, og tryk derefter på "Load position" knappen.
4. Indstil okulær faktor "10x". Indlæs det ønskede antal billeder (lastning alle billeder anbefales til første gang).
5. I celle editor vindue, vælg "Ny koloni" under menuen Filer. I Filmvinduet skal du trykke på "Track celle" eller F2 for at begynde at spore en celle.
6. Identificere en celle i Movie vindue og bruge musen til at placere markøren over cellen. En cirkel med antallet af cellen skal vises efter F2 er blevet klikket. Brug "0"-tasten på det numeriske tastatur på tastaturet for at spore placeringen af ​​cellen og videre til næste billede. Flytte markøren til følge placeringen af ​​hver celle gennem hver ramme. Hvis du vil slette et spor og vende tilbage til det forrige billede tryk "Del" på det numeriske tastatur. At komme videre rammer uden at spore celle trykke på "3" og for at gå tilbage uden sporing trykke "1" på det numeriske tastatur.
7. For at markere en celledeling ved at klikke på "Division" knappen i Filmvinduet. For at markere celledød klikke på "Celledød" knappen i Filmvinduet. Når en division har fundet sted, kan datter celler kan spores i den samme celle skæbne kort ved at højreklikke på cirklen symbolet på den udpegede datter celle i Cell editor vinduet for at begynde at spore tilstand automatisk.
8. Tryk på F10 for at gemme træet. Hvert træ vil spare i den udpegede output foldis (TTTExport). Hvis du vil starte en ny celle skæbne kort, skal du vælge "Ny koloni" under "File" og derefter "Open"-menuen i Cell editor vinduet.
9. Tabulate celle levetid data efter indsamling fra "Cell data" fanen i Cell editor vinduet.

7. Statistiske analyser

1. Brug enten Students t-test (hvis man sammenligner to genotyper) eller ANOVA (hvis man sammenligner> to genotyper) for at afgøre, om forskelle i parameterdata såsom antallet af indledende cellekolonier, cell levetider eller timer, indtil fremkomsten af ​​EMT mellem forskellige genotyper er statistisk signifikant. Apoptotisk frekvens kan sammenlignes med det / totalt antal udpladede celler under anvendelse af Students t-test eller ANOVA eller Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis når afledt som en procentdel af adhærente celler.
2. Udfør magt prøver ved hjælp af data fra analyser af indledende forsøg for at bestemme, hvor mange forsøgsgentagelser skal udføres, og celle skæbne maps genereres fra hver replikat for tilstrækkelig sTATISTISK magt ved hjælp af tilgængelig freeware (f.eks http://statpages.org/ ). I eksperimenterne præsenteret her, var cellekulturer afledt fra tre mus pr genotype tilstrækkelig til at bestemme, om der var statistisk signifikante forskelle i celle-kolonidannelse og celle liv, hvor specifikke genetiske ændringer blev foretaget.

Representative Results

Epithel og fibroblast-celler kan skelnes ved cellemorfologi. Epitelceller har en kubisk form (figur 1A-B) og danner cellekolonier (figur 1A). Fibroblaster, en type stromal celle, har en aflang morfologi (figur 1C).

Celler blev afrundet og flydende ved begyndelsen af billeddannelse (fig. 2A-D). Efter binding til pladen blev de flade og demonstrerede et kubisk-typen udseende (figur 2E, H). Med 4 dages dyrkning de fleste epitelceller langstrakt i en EMT-lignende morfologi (figur 2I-L). Denne ændring skete med den samme kronologi i alle undersøgte genotyper. Nogle digitale billeder var sløret fordi Kohler belysning og fase ring tilpasning ikke blev indstillet korrekt (figur 2D, H, L).

De flydende celler udviklede sig til definerede individuelle epitelcelle colonies ved 24 timer efter udpladning (fig. 3A, B). Serial billedanalyse afslørede, at disse kolonier blev dannet ved celleaggregering i stedet for celledeling. Samtidig afbrydelse af BRCA1 i sig selv ikke ændrede antallet af dannede kolonier, tilsætning af TP53 haploinsufficiency reducerede signifikant antallet af dannede kolonier og tilsætning af ERα overekspression betydelig stigning i antallet af dannede kolonier (figur 3C).

Det er kritisk at overvåge de digitale erhvervede billeder og justere fokus kortet ofte under de første 24 timer som celler fastgøres den til pladen og derefter mindst to gange dagligt for at sikre, at cellerne forbliver i fokus og kulturer ikke forurenes. Nøjagtighed af analyserne er kompromitteret, hvis afbildede celler ikke er i fokus (Figur 4).

I repræsentativt eksperiment præsenteret her, var en kritisk spørgsmål at bestemme, om ændringer i ekspressionsniveauets af gener vides at påvirke brystcancer risiko (BRCA1, TP53, og østrogen-receptor 1 (ESR1) ¹⁾ ændret antallet af timer mellem celledelinger (celle levetid) eller påvirket de mønstre af division (symmetrisk versus asymmetrisk) i ikke-kræft primære mammae epitelceller. For at opnå dette blev individuelle celle skæbne kort (træer), der genereres ved hjælp af TTT. Eksempler på repræsentative celle skæbne kort for hver af de fire testede genotyper er vist (figur 5A-D). De fire genotyper af de testede celler var vildtype (ikke genetisk manipulation) (figur 5A), tab af fuld længde BRCA1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (figur 5B), tab af fuld længde BRCA1 i kombination med TP53 haploinsufficiency (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (figur 5C), og tab af fuld længde BRCA1 i kombination med TP53 haploinsufficitighed og forstærkning af ESR1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (figur 5D). Generering af celle skæbne maps blev stoppet, når celler blev sammenflydende (~ 3-4 generationer), da entydig sporing af enkelte celler ikke længere var muligt efter at. Generation 0 (tid til første celledeling) blev ikke medtaget i analyserne af celle livstider, fordi varigheden af generation 0 var længere og mere variable end de efterfølgende generationer. Generationer 1, 2, 3 og 4 blev samlet for de endelige analyser, fordi der ikke var nogen signifikante forskelle i gennemsnitlige celle levetid eller standardfejlen af ​​middelværdien (SEM) mellem disse generationer. Sammenligninger af gennemsnitlige celle levetid mellem de forskellige genotyper (figur 5E) viste, at tab af fuld længde BRCA1 reduceret antallet af timer mellem celledelinger fra 21,3 ± 1,6 timer (vildtype) til 16,5 ± 1,0 time (BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Nejtably, skønt tab af en TP53 allel foruden tab af fuld længde BRCA1 er forbundet med en betydelig stigning i brystcancer udvikling1, betyder celle levetid var uændret (16,3 ± 1,2 timer) sammenlignet med mus mangler BRCA1 alene. Interessant vinde på ESR1 i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} mus genoprettet celle levetid varigheder til tæt vildtypeniveauer (19,3 ± 2,1 timer), omend disse mus har højeste forekomst af brystcancer udvikling af alle de modeller undersøgt here.1 Disse resultater viste, at tab af fuld længde BRCA1 var ikke altid forbundet med en forkortet celle levetid, i stedet blev dette ændret ved overudtrykt ERα. Mulige næste trin eksperimenter anvender denne teknologi kunne være dosis-respons-forsøg med forskellige østrogener, andre vækstfaktorer eller kandidatlande terapeutiske at måle deres indvirkning på celle levetid i forskellige genetiske backgroog investeringsforeninger. I modsætning til virkningerne på celle levetid varighed, studerede ingen af ​​de genetiske ændringer her ændrede celledeling mønstre.

Figur 1. Udseendet af en epitelcelle koloni (A), epitelceller (B), og fibroblast (C) fra time-lapse billeddannelse. Epitelceller synes mere kubisk mens fibroblaster synes mere aflang. Målestokbjælkerne = 50 um.

Figur 2. Repræsentative serielle time-lapse billeder fra tid 0, 2 og 4 dage viser ændringer i cellulær morfologi over tid og forskelle i udseende med og uden Kohlis belysning. På tidspunkt 0 de udpladede celler er flydende (pilespidser AD), af to dage i kultur de er klæbende og kan udvise et kubisk-type morfologi (tykke pile E, H) og af fire dage i kultur, de langstrakte og demonstrere et EMT-lignende morfologi (tynde pile IL). Kohler belysning er til stede i paneler AC, EG, og IK. Paneler D, H og L illustrerer billeder uden Kohler belysning. Viste billeder er fra den samme imaging point over tid. Målestokbjælkerne = 200 um. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Antallet af epitel-cellekolonier efter 1 dag varieres ved genotype. (A) Afrundet flydende celler ved begyndelsen af time-lapse billeddannelse. (B) To repræsentative epiteliale cellekolonier (pile). (C) Antal epithell cellekolonier / ramme dannet ved 24 timer varieres ved genotype. Søjlediagrammer viser middelværdien og standardfejlen af ​​middelværdien. * P <0,05, ANOVA. Målestokbjælkerne = 200 um. Celler isoleret fra mælkekirtlerne uden palpable tumor fra 10 - til 12-måneder gamle BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), og vildtype (n = 3) mus blev afbildet for undersøgelserne. Fem uafhængige billeddannende eksperimenter sammensat af forskellige kombinationer af vildtype-og gensplejsede mus blev udført. Medier indeholdt phenolrødt. Ingen østrogen blev tilsat. Klik her for at se større figur .

Figur 4. Out-of-fokus billeder kan ikke være nøjagtigly analyseret. Før billeddannelse pladen, bør pladen sidde i den billeddannende inkubator i 15 minutter for at ækvilibrere. Under den første dag i billedbehandling, bør fokus kontrolleres og justeres hvert par timer. Efter at den bør kontrolleres to gange dagligt, men generelt forbliver mere stabil. Pil angiver en ude-af-fokus epitelcelle koloni.

. Figur 5 Cell skæbne maps frembragt fra encellede sporing ved hjælp TTT for (A) vildtype, (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} og (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} mus. Celler, der ikke kan spores på grund af tab af rammen eller i en sammenflydende cellelag er angivet med et spørgsmålstegn. Når der ikke spørgsmålstegnindikeret, sporing var bevidst endte på grund af celle konfluens og manglende evne til utvetydigt følge encellede skæbne. (E) Mean celle levetid varierede med genotype. Søjlediagrammer viser middelværdien og standardfejlen af ​​de gennemsnitlige celle levetid (tiden mellem celledelinger) over generationer 1-4 for hver genotype. Mean celle levetid var signifikant kortere i mammale epitelceller afledt fra BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} og BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} i sammenligning med vildtype-mus. * P <0,05, ANOVA. Celler isoleret fra mælkekirtlerne uden palpable tumor fra 10 - til 12-måneder gamle BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), og vildtype (n = 3) mus blev afbildet for undersøgelserne. Fem uafhængige billeddannende eksperimenter sammensat af forskellige kombinationer af vildtype og genetisk engineered mus blev udført. Medier indeholdt phenolrødt. Ingen østrogen blev tilsat. Klik her for at se større figur .

Discussion

Kritiske trin

Det er vigtigt at sikre, at mælkekirtlerne høstes fra mus på samme alder at kontrollere for aldersrelateret variabilitet i brystkirtler epitelcelle adfærd. Når udpladning af cellerne, burde det samme antal celler udpladet i hver brønd i hvert eksperiment. Celler bør være relativt sparsom ved udpladning således at kulturerne ikke bliver sammenflydende for hurtigt gør det muligt at følge flere individuelle celler gennem serielle billeder. Det er afgørende, at pladen ækvilibreres i inkubatoren før billeddannelse fordi fokus ændres, når pladen ækvilibreres. Når imaging er begyndt, bør fokus kontrolleres hyppigt og justeres efter behov, især inden for de første 24 timer. Det er vigtigt at have temperaturen af ​​inkubatoren reguleret og forvarmet. Antallet af mennesker, der går ind og ud af rummet bør begrænses så meget som muligt. Vi anbefaler at praktisere alle aspekter af Indsg eksperimentet forhånd for at sikre reproducerbarhed og kvalitetskontrol. Som med alle celledyrkningsforsøg, er sterilitet et vigtigt emne og standard sterile cellekultur praksis bør anvendes på alle tidspunkter.

Lagring og manipulere store billedfiler kræver en væsentlig mængde hukommelse. En delt netværksdrev eller bærbare harddiske kan anvendes. Når filer først er konverteret, er det vigtigt at sikre, at billederne er konsekvent navngivet korrekt og anbringes i tilsvarende mapper. Hyppig gemmer af digitale data bør udføres under hele processen.

Begrænsninger

Denne fremgangsmåde anvender et 2D-kultursystem, der ikke tillader analyse af adfærdsmæssige forskelle, der kunne afdækkes i en 3D-dyrkningssystem. Varigheder af celle levetid kan kun reproducerbart måles efter første observerede celledeling som antallet af timer til første celledeling efter initial udpladning af cellerne er variabel.

Mulige modifikationer

Afhængigt af kravene til eksperimentet, kan time-lapse billeder tages mere eller mindre hyppigt. For eksempel, hvis transiente cellulære strukturer skal kvantificeres, kan en 5 sek interval være mere passende. Andre procedurer til at generere primære brystepitelceller cellekulturer kan anvendes. Enhver billeddannende udstyr kan anvendes til at oprette time-lapse billeddannelse, så længe den er i stand til at opfylde kravene i forsøget. Alternative systemer til enkeltcelle-sporing kan anvendes. For fremgangsmåden beskrevet her, et standard plast flad bund 6-brønds plade var tilstrækkelig. Plastic retter kan bruges til alle lange afstand luften linser såsom 4x, 10x, og 20x. Det er vigtigt at vælge regioner nær midten af ​​de plastskåle ved udførelse af fasekontrast billeddannelse, da plasten er krum nær kanterne i de fleste retter og forvrider lyset.Dækglas tykkelse glas bund brønde ville være påkrævet for normal arbejdstid afstand nedsænkning linser (olie, vand, glycerol, osv.), som typisk er i stærkere forstørrelse.

Fejlfinding

Når celler udplades, bør alle være tilstrækkelig til at opretholde cellevækst i 5 dage for at mindske behovet for at manipulere pladen på scenen, men om nødvendigt kan mediet tilsættes. Det anbefales, at fordampningen skal holdes på et minimum. Fordampning bør forvaltes ved at placere 03:57 retter af sterilt deioniseret vand inde i inkubatoren og genpåfyldning dem, når det er nødvendigt. Det er muligt at fylde de uudnyttede brønde i 6-brønds plade med sterilt deioniseret vand.

Hvis billeder ikke de lægges i TTT-programmet, skal du først kontrollere og sørg for de filer og mapper er placeret og navngivet korrekt. Dernæst kontrollere, om logfilen er i den rigtige mappe (se trin 5,5).

Future program eller retning efter mastering teknik

Den samme generelle fremgangsmåde kan anvendes til at analysere adfærden af ​​andre celletyper, herunder humane primære mammae epitelceller og brystcancerceller. For eksempel kan genotypiske-specifikke adfærd og / eller reaktion på kandidat-behandlinger skal analyseres. Alternativt afbildning af fluorescens-aktiveret celle (FAC) sorteret cellepopulationer kan udføres eller fluorescerende mærker tilføjet til overvågning af specifikke celletyper.

Betydningen af ​​denne teknik i forhold til eksisterende metoder

Tilsætning af time-lapse imaging og analyser af celle adfærd over tid til traditionel cellekultur og mærkningsteknikker giver kvantitative data fra enkelte celler over tid i stedet for kun hele populationsdynamik. Denne teknik muliggør enkelte celler, der skal overholdes kontinuerligt i modsætning til traditionelle fremgangsmåder, der tillader observation kun ved diskrete tidspunkter. Mesuden, traditionelle metoder kræver, at cellerne forstyrres ved at tage dem ind og ud af inkubatoren for at se dem under et mikroskop henviser til den fremgangsmåde, der er beskrevet her tillader cellerne, der skal observeres uden at blive overført. Endelig time-lapse imaging giver en varig rekord af cellerne under observation, der kan returneres til for yderligere analyser. Anvendelsen af ​​TTT at spore individuel celle adfærd tillader en utvetydig analyse af flere parametre og kræver ikke anvendelse af et fluorescerende mærke for at lokalisere de specifikke celler under observation. Teknikken afslører forskelle i brystkirtler epitelcelle adfærd, der er vanskelige at måle i statiske vævssnit af mælkekirtlen. Cell levetid målinger kvantificere antallet af timer mellem mitotiske begivenheder. Denne måling giver specifikke data på det faktiske antal timer mellem celledelinger, der angiver længden af ​​cellecyklus i timer. En forsker kan bruge disse data til at bestemme, hvordanspecifikke genetiske ændringer eller kultur betingelser virkning cellecyklus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140