Summary
一个半自动化的微型电流体的方法诱导点播运动
Abstract
线虫是一种多用途的生物医学研究的模式生物,因为其养护与疾病相关的基因和途径以及其易于栽培。几个C.线虫病模型已被报道,包括神经退行性疾病,如帕金森氏病(PD),这涉及多巴胺能(DA)神经元的变性。两种转基因和神经毒性的化学物质已被用于诱导DA神经退行性疾病和随之而来的运动在蠕虫的缺陷,允许调查的基础的神经退行性疾病和神经保护作用的基因和化合物2,3的屏幕。
在低等真核生物如C屏幕线虫提供高效和经济的手段来影响神经信号化合物的鉴定和基因。传统的屏幕通常手动进行,并取得通过目测,因此,它们是时间的利弊uming和容易出现人为错误。此外,大多数细胞水平分析的焦点,而忽略运动,这是一个特别重要的参数为运动障碍。
我们已经开发了一种新的微流体筛选系统( 图1),控制和量化C.使用微通道内的电场刺激线虫的运动。我们已经表明,一个直流(DC)字段鲁棒可以诱导按需向阴极运动(“electrotaxis”)4。倒车领域的极性,导致蠕虫迅速扭转方向。我们还表明,多巴胺和其他感觉神经元中的缺陷,改变游泳响应5。因此,在神经元的信号的异常可以使用作为一个读出的运动来确定。采用了一系列的参数,如游泳速度快,身体弯曲次数及拨回时间可以精确量化的运动响应。
4。这些发现使我们能够设计一个新的微流体装置,被动蠕虫排序按年龄和表型6。
我们还测试蠕虫脉冲直流和交流电(AC)的电场响应。各种占空比的脉冲直流领域的有效生成两个C. electrotaxis 线虫和其表弟C. briggsae 7。在另一项实验中,对称的AC字段从1 Hz到3千赫的频率范围固定的通道8内的蠕虫。
执行的微流体环境中的电场使快速和自动地执行的electrotaxis检测。这种方法有望促进高通量遗传因素和化学屏幕影响神经细胞的功能和活力。
Protocol
1。主模具制造的光刻
- 沐浴3英寸硅晶片,在丙酮中30秒,然后用甲醇,持续30秒。 DH 2 0水冲洗5分钟。
- 用氮气吹尘枪,晶圆表面干燥。晶片在140℃的热板上加热2分钟。
- 等离子氧化在硅晶片的表面上(1分钟,50瓦)。
- 旋涂晶圆的表面有3毫升SU-8 40秒100的光致抗蚀剂(1750转)。
- 的热板上预烘焙涂布的晶片在65℃下进行10分钟,然后坡道温度95℃2分钟。保持此设置为1小时。
- 将含有所需的信道设计的光掩模。揭露抵抗550-600兆焦耳/厘米2的紫外光(350-400纳米)。光掩膜的设计可以在AutoCAD上的透明度和打印用的高分辨率印刷。
- 晶片的热板上烘烤后,在65℃1分钟,95℃下10分钟,升温吨他前的温度。
- 晶圆浸泡在SU-8显影液10-15分钟。开发完成后用异丙醇冲洗检查。如果出现白色沉淀物,继续发展。 图2A所示的母模。
2。软光刻技术微通道的制备
- PDMS固化剂用3.5毫升,混合35毫升的聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体基地。
- 将制作母模(图案朝上)和一个空白硅片到培养皿内衬铝箔。
- 进入到第二盘的模具师傅菜和15毫升,倒入20毫升PDMS预聚物。用一次性木制涂药轻轻按下消除气泡下方的晶圆。
- 既包括菜肴和预留一天治愈。另外,对于固化速度更快,使用的真空脱气装置从PDMS去除气泡,然后离开,在80℃的热板上的菜2小时。
- 移除箔和从晶片剥离的PDMS。
- 使用哈里斯统一核(2.5毫米),以冲头的流体的通道两端的接入端口。切通道和空白PDMS成同样大小的条。
- 加载通道,空白的硅橡胶条和玻璃载片(75×25毫米2)成等离子体氧化剂,有可能设在洁净室中。暴露于氧等离子体,持续40秒,在40 W功率。
- 棒的通道片和玻璃载片空白带的相对两侧。预留2小时来完成粘合。
- 将组件上的热板上在120℃下将塑料管(内径1/32“,外直径为3/32”),每一个至少6英寸长,冲压水库使用PDMS的预聚物。贴上流体的塑料连接器连接到一个或两个管子允许注射器附件,或使用市售配件。
- 允许的PDMS固定管治愈。插入3“长度的22轨距绝缘的铜线到EACħ水库,入口管和通道之间,并与PDMS的预聚物的安全。 图2B中所示的成品。
3。 Electrotaxis实验
- 将微流路连接的监视器( 图1)的安装的摄像机的显微镜上的阶段(优选为XY-可动)。
- 连接电源或放大器的输出线连接到微通道的电极。一个简单的直流稳压电源是足够的,如果是理想的,但只有一个DC信号的放大器连接到一个函数发生器的脉冲直流信号和交流信号,以及允许应用程序。
- 将微通道的输出管一次性注射器。淹没口的入口管M9的生理缓冲液中,并轻轻地向往液体通过施加在注射器内形成负压(手动或使用注射泵)进入通道。当入口和出口管都充满了M9,断开的注射器fROM管。双侧输卵管级到相同的高度,以防止水压驱动的流动。
- 施加直流电压的信道和,确保电阻(R = V / I)大约是0.6MΩ(50毫米长,0.3毫米宽,0.1毫米深的微流路)。
- 如果满意通道的完整性,按照上面的步骤,从稀释悬浮液进入通道加载蠕虫。
- 拔下注射器和水压操作流程,通过调整管的相对高度。使用此方法蠕虫放置在中心的通道,然后在同一高度,奠定两个管平。
- 设置适当的电压电源:4-12 V / cm的L3级动物,4-10 V / cm的L4S和2-4 V / cm的青壮年。激活的电信号,并允许蜗杆以适应字段的预曝光1分钟。该蠕虫病毒开始向阴极移动。当一分钟后,可以使用相机开始记录。
- 对于交流和脉冲字直流实验的最大响应电场,可以采用从上述频率和占空比的信号进行调制,然后随意7,8。
- 实验结束时,从通道中移除所有液体(和蠕虫),用dH 2 O漂洗,将本装置的热板上,在125℃下干燥。
- 运动器官提取数据从录制的视频使用NIH ImageJ的( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )的或定制的基于MATLAB的蠕虫跟踪软件。
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Representative Results
有代表性的野生型的年轻成年线虫的的electrotaxis和它的位置和速度输出蠕虫跟踪软件视频补充视频1和图3所示。运动分析软件本身不识别方向的场极性和极性反转的时间,而是必须获得这个信息从源视频。这可以通过使用在视频或音频或视频提示,写下的实验条件和操作。
从野生型(N2)和转基因动物中的一组(NL5901)electrotaxis高速数据将显示在图4。 NL5901动物进行人α-突触核蛋白基因UNC-54(肌球蛋白重链基因)启动子的控制之下。表达α-突触核蛋白体壁肌肉总量9,我们的结果表明,它会导致异常电trotactic响应。 NL5901蠕虫的速度明显慢于野生型。要绘制图形,我们计算了个别蠕虫速度和使用Minitab统计软件( http://www.minitab.com )在一个盒子里情节绘制的结果。除了速度,运动的其他参数,如车削的响应(响应于电场的极性变化来完成逆转的时间)与身体的弯曲次数(每秒的正弦波的平均数),也可以分析其他地方所描述5。
的electrotaxis协议同步的人口与漂白剂溶液(次氯酸钠和4N氢氧化钠在2:3体积比)10,它可以通过以下方式获得治疗效果最好。这里提交的所有数据同步的人群排除年龄和阶段依赖性变化。虽然我们已经使用了青壮年(69小时后L1摄氏20度),也可以测试其它阶段(L2起)。
图1。微筛选平台线虫electrotaxis实验示意图 点击此处查看大图 。
图2。母模(A)和完全组装PDMS微通道装置(B)。
图3。位置与时间的关系(A)和(B)的瞬时速度输出的定制蜗杆跟踪程序。酸奶CE视频是补充下面的视频1。该程序计算速度曲线的位置 - 时间曲线,但无视尖峰时计算平均速度。
图4。野生型对照的N2和转基因NL5901蠕虫。Electrotaxis速度 NL5901蠕虫明显慢于控制P> 0.0001。使用非参数Mann-Whitney检验确定意义。 N2和n = 23,N = 10 NL5901。
补充视频1。Electrotactic年轻的成年线虫的行为在微流体通道。视频开始与阴极的右侧。外观的玻璃吸管表示即将到来的极性反转;随后去除移液器信号瞬间逆转。 点击这里查看电影。
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Discussion
趁着加贝尔和他的同事和建设的介电电泳操纵工作的庄和他的同事11,12首次描述的行为现象,我们基于微electrotaxis检测提供了一个简单,强大而灵敏的方法来探测蠕虫使用运动神经元活动一个输出端。运动参数的分析,可以定量比较不同基因型之间。微通道制造和施加电场的精确度提供一个可控的环境和沟通的途径与蜗杆的运动控制。不同的电信号波形具有不同的行为在蜗轮的反射,并已被用于刺激和抑制运动。
本微流体装置的单声道的设计要求在一个时间只有一个单一的蠕虫进行评分。对于这一点,必须充分稀释蠕虫溶液与M9前缓冲试图加载蠕虫进入通道。重要的是要指出的是,可以是复杂的信道操作的存在气泡和其他影响的静水压力的凹凸。这可能被淘汰,冲洗通道M9和操作的入口和出口管的标高。
这里所描述的测定法可进一步提高。多通道微流控芯片可以加快蠕虫病毒筛查,虽然会需要集成其他控制机制,如蠕虫料,定位和跟踪。进一步自动化的electrotaxis协议,尤其是计算机控制的流程管理,提高工作效率。这些增强功能是在我们的实验室目前正在开发。
提取的运动数据从electrotaxis视频最初是手动执行的,使用ImageJ,这是一个缓慢而繁琐的过程。为了提高效率和消除ħ乌曼错误,我们已经开始使用蠕虫的跟踪程序,用于在加州大学13研究所开发从原来的基于MATLAB软件包。目前该软件处理单蠕虫病毒视频。最新的版本是适合广泛的实验,包括化学处理的蠕虫和神经元和肌肉突变。它的局限性之一是自发逆转,观察到在某些神经细胞突变体( 例如,OSM-5)5,不能正确解释。这种蠕虫必须手动进行分析。
尽管有局限性,微流控electrotaxis可以被应用在无数的环境中,包括药物发现蠕虫检测与运动相关的疾病模型。考虑到其顺从并行,electrotaxis特别适合于高通量筛选应用。也可以研究遗传和年龄依赖性分析的electrotactic行为和神经元变性的系统。此外,蠕虫可以进行排序按年龄或表型形成同步的样品或确定新的突变体正向遗传学屏幕6,14。
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Disclosures
微electrotaxis检测技术已申请专利,在美国的美国和加拿大。
Acknowledgments
笔者想感谢自然科学和工程研究理事会,加拿大,加拿大研究主席,加拿大卫生研究院,安大略省研究与创新部通过他们的早期研究者奖计划提供财政支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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