Summary
यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा के लिए एक प्रकाश अंधेरे वरीयता परीक्षण का वर्णन है. यह परख प्रकाश संवेदन और प्रसंस्करण photobehavior की सहज और circadian विनियमन के बारे में जानकारी प्रदान करता है.
Abstract
विभिन्न स्तरों पर पशुओं के व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए पर्यावरण के संकेत के रूप में प्रकाश में कार्य करता है. ड्रोसोफिला लार्वा तंत्रिका तंत्र प्रकाश जानकारी संसाधित और तेजी से और circadian व्यवहार के बीच साझा किया जाता है कि किस पर बुनियादी सवालों के जवाब देने के लिए एक अनूठा मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. प्रकाश के संपर्क में जब ड्रोसोफिला लार्वा एक टकसाली परिहार व्यवहार प्रदर्शित करते हैं. तुलनात्मक रूप से सरल प्रकाश अंधेरे वरीयता परीक्षण लागू किया जा सकता प्रकाश निर्भर व्यवहार की जांच करने के लिए. रीढ़ और सन्धिपादों में दृश्य आदानों संवेदन और प्रसंस्करण में शामिल तंत्रिका रास्ते आंशिक रूप से उन प्रसंस्करण रोशनी का दैनिक जानकारी के साथ ओवरलैप. प्रकाश संवेदन प्रणाली और circadian प्रणाली व्यवहार outputs के समन्वित रखने के लिए बातचीत कैसे की आकर्षक प्रश्न काफी हद तक बेरोज़गार बना रहता है. ड्रोसोफिला दिमाग में न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या की वजह से इन सवालों के दृष्टिकोण के लिए एक प्रभावित जैविक मॉडल, और आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता है न्यूरोनल manipul के लिएसमझना. प्रस्तुत प्रकाश अंधेरे वरीयता परख phototaxis के circadian नियंत्रण सहित दृश्य व्यवहार की एक श्रृंखला की जांच की अनुमति देता है.
Introduction
यहाँ हम अंधेरे के लार्वा वरीयता (या प्रकाश) पर आधारित एक व्यवहार परख का वर्णन है. लार्वा चारा चरणों (प्रारंभिक L3 के लिए एल 1) 1 के दौरान एक मजबूत और stereotypic photonegative प्रतिक्रिया के साथ प्रतिक्रिया. परख लार्वा की photophobic व्यवहार का आकलन करने के उद्देश्य से है और लार्वा अगर साथ लेपित एक पेट्री डिश में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ के एक समूह की रोशनी या अंधेरे वरीयता लगता है. यह व्यवहार परख दृश्य प्रणाली की संवेदनशीलता, एकीकरण और लौकिक plasticity के बारे में जानकारी प्रदान करता है, न केवल यह आगे प्रकाश संवेदनशीलता और इसकी प्रक्रिया circadian प्रणाली द्वारा नियंत्रित है पर संकेत देता है.
ड्रोसोफिला लार्वा आँख (भी कहा जाता Bowlig अंग, बो), प्रकाश धारणा के लिए मुख्य अंग है. हर आंख 12 फोटोरिसेप्टर (पीआर) से बना है, आठ पीआरएस पीआरएस नीली संवेदनशील rhodopsin5 (rh5) 2,3 व्यक्त हरी संवेदनशील rhodopsin6 (rh6) और चार व्यक्त करते हैं. पीआरएस, ए एल एस के अलावालार्वा शरीर दीवार को कवर जो ओ चतुर्थ श्रेणी multidendritic न्यूरॉन्स, हानिकारक प्रकाश तीव्रता 4,5 करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए पहचान की गई है. यह भी केंद्रीय लार्वा के मस्तिष्क में स्थित पेसमेकर न्यूरॉन्स मस्तिष्क 6,7 भीतर घड़ी आंतरिक नीले प्रकाश संवेदक के रूप में कार्य करता है कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन cryptochrome (क्राई) व्यक्त कि जाना जाता है. इस परख के साथ जब परीक्षण दिलचस्प जंगली जानवरों की photophobicity दिन और रात के दौरान अलग अलग समय बिंदुओं पर एक circadian घटक दिखाता है. प्रकाश अंधेरे वरीयता 7 के लिए परीक्षण जब चारा L3 लार्वा की रोशनी के लिए प्रतिक्रियाओं गोधूलि बेला में भोर में मजबूत photophobicity और कम photophobicity दिखाया. Rh6-पीआरएस नगण्य हैं, जबकि दिलचस्प केवल Rh5-पीआरएस, प्रकाश परिहार के लिए आवश्यक हैं. , Rh5-पीआरएस और Rh6-पीआरएस दोनों प्रकाश 8 से आणविक घड़ी रीसेट करने में शामिल रहे हैं. रो मार्ग में एक उचित व्यवहार उत्पादन आर्केस्ट्रा अन्य प्रकाश संवेदी रास्ते के साथ समन्वित किया जाना चाहिएदिन के कोर्स. पीआरएस में acetylcholine प्रकाश परिहार व्यवहार के साथ ही आणविक घड़ी की entrainment में एक आवश्यक भूमिका निभाता है. पीआरएस से दैनिक पेसमेकर न्यूरॉन्स को acetylcholine neurotransmission अवरुद्ध प्रकाश अंधकार वरीयता परख 8 में photophobic प्रतिक्रिया कम कर देता है. एक ही परख रोजगार, न्यूरॉन्स की दो सममित जोड़े ने हाल ही में ड्रोसोफिला 9 के तीसरे लार्वा instar के प्रकाश वरीयता स्विच करने के लिए पहचान की गई है. जानवरों संभवतः एक उपयुक्त pupariation साइट खोजने के लिए खाना छोड़ जब न्यूरॉन्स के इन दो जोड़े, देर लार्वा चरणों के दौरान कार्य किया जा सकता है. हालांकि, दृश्य रास्ते बातचीत और एक circadian ढंग से लार्वा दृश्य व्यवहार पर नियंत्रण के सवाल काफी हद तक अनुत्तरित बना हुआ है. प्रकाश वरीयता परख circadian समय अंक के बीच तुलना, विभिन्न प्रकाश गुणों के तहत लाइनों और circadian राज्य के लिए उड़ान भरने की अनुमति देता है. परख आसानी से तैयार है और सस्ती है और मैं पहले से उपयोगी हो गया हैएन कई प्रयोगशालाओं का वर्णन है और लार्वा में प्रकाश व्युत्पन्न व्यवहार का अध्ययन करने के लिए.
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Protocol
1. लार्वा पालन
- डिग्री सेल्सियस मकई भोजन माध्यम पर प्रकाश और टाइमर के साथ सुसज्जित एक मक्खी इनक्यूबेटर में एक 12 घंटा प्रकाश 12 घंटा अंधेरे चक्र के तहत 25 में जन संस्कृति में उपभेदों या आनुवंशिक पार उड़ रखें.
- एक तरल पदार्थ पेस्ट (एच 2 ओ आसुत 3-4 मिलीलीटर के साथ पतला सरपरस्त खमीर के 10 ग्राम) के रूप में पानी में सरपरस्त खमीर पतला. मकई भोजन खाने के लिए एक छोटी सी बूंद जोड़ें और शीशियों को कवर किया. खमीर पेस्ट करने के लिए चिपके वयस्क मक्खियों से बचने के लिए कम से कम एक घंटे के लिए सूखी चलो. भोजन की सतह पर पानी में पतला खमीर की एक छोटी सी बूंद लाना oviposition वृद्धि कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से बेकर खमीर पेस्ट, 20% एसिटिक एसिड (AcOH) (सिग्मा Aldrich, स्विट्जरलैंड A6283-100ml) का उपयोग किया जा सकता है. इस के लिए, मकई भोजन भोजन सतह पर समाधान और प्रसार पर एक क्यू टिप टिप डुबकी.
- मकई भोजन भोजन शीशियों में (पुराने से दस दिनों में कम से कम चार दिन पुरानी है, लेकिन नहीं) वयस्क मक्खियों रखो. वरीयता को दोहराने के लिए पर्याप्त लार्वा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक शीशी में काफी वयस्कों रखोकई बार परीक्षण और सांख्यिकीय तुलना की अनुमति. आनुवंशिक पार के लिए, हम आम तौर पर 20 महिलाओं और शीशी प्रति 5-10 पुरुषों की एक न्यूनतम का उपयोग करें, लेकिन कुछ लाइनें एक पर्याप्त लार्वा संतानों को प्राप्त करने के लिए अधिक महिलाओं की आवश्यकता होती है.
- 12 घंटे के लिए अंडे देते हैं और नए शीशियों के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए वयस्कों की अनुमति दें. वयस्कों सुबह और शाम में स्थानांतरित किया जा सकता. हम आम तौर पर सात से दस दिनों के लिए वयस्कों के हस्तांतरण और यदि जरूरी हुआ तो नई वयस्कों ले.
- इनक्यूबेटर में हर 12 घंटे लिया अंडा संग्रह रखने के लिए और 25 में लार्वा डिग्री सेल्सियस, 12 घंटा प्रकाश 12 घंटा अंधेरे चक्र और 60% आर्द्रता बढ़ने. अंडा संग्रह के बाद लगातार अंधेरे के दृश्य व्यवहार कदम लार्वा (डीडी) 48 घंटे (दो प्रकाश अंधेरे चक्र के लिए इसी) के circadian घटकों के लिए परीक्षण करने के लिए. इस के लिए, रोशनी के बिना एक अलग इनक्यूबेटर उपयोग करें, लेकिन इस तरह के तापमान और समान नमी के रूप में अन्य सभी शर्तों रखना. सिर्फ अंधेरे चरण में परिवर्तन के पहले डीडी इनक्यूबेटर शीशियों हस्तांतरण सुनिश्चित करें. Anoth को शीशियों जाने से पहलेएर इनक्यूबेटर एक गत्ता बॉक्स में शीशियों डाल या स्थानांतरण के दौरान प्रकाश जोखिम (गत्ते का डिब्बा या रैपिंग में पैकिंग इन्क्यूबेटरों के बीच में शिफ्ट करने से पहले "रोशनी पर" चरण के दौरान किया जा सकता है) को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीशियों लपेटो. इस बिंदु के बाद और प्रयोगों के शुरू तक किसी भी प्रकाश जोखिम से पशुओं को रोकने के.
- 4 दिनों के बाद (बिछाने अंडे 84-108 घंटा) (4 देखें. लाइट वरीयता परीक्षण, बिंदु. 4.4.) का परीक्षण किया जा करने के लिए समय बिंदुओं पर जल्दी L3 (खिला लार्वा) एकत्र.
2. टेस्ट सेटअप
- लगातार तापमान और आर्द्रता की स्थिति के साथ एक अंधेरे कमरे में प्रयोग करते हैं.
- अंधेरे में पेट्री डिश के दो quadrants रखने के लिए, काला टेप और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ढक्कन को कवर किया. ऐसा करने के लिए, ढक्कन परिधि के केन्द्र के निशान. इसके अलावा उनके बीच अलगाव के 90 डिग्री से ढकने की सीमा में चार अंक के निशान. इसे आसान बनाने के लिए, एक पर 10 सेमी लंबाई के चार quadrants में विभाजित एक 20 सेमी वर्ग आकर्षितकागज की या एक कंप्यूटर की मदद से चादर. एल्यूमीनियम पन्नी और काले टेप (चित्रा 1 ए) के 10 सेमी वर्ग काटें. इसे कवर करने पहली परत और काले टेप के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी के एक वर्ग gluing द्वारा दो विपरीत चतुर्भागों, कवर, को भी ढकने की सीमा को कवर करने के लिए सावधान रहना होगा.
अतीत में इस assays के दो थोड़ा अलग रूपों में इस्तेमाल किया गया. हम यहाँ पेट्री डिश 10 चार बराबर तिमाहियों में विभाजित किया गया है, जिसमें "क्वार्टर प्लेट" परख, का उपयोग करें. वैकल्पिक "आधा थाली" परख में पेट्री डिश विभाजित है आधा (आधा प्रकाश, अंधेरे में आधे से अवगत कराया) 1,7,8. आज तक दो assays के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद प्रकाशित किया गया है. - गोंद ऐसे अधिकार मेज पर प्रकाश स्रोत के तहत lids के अंकन के लिए प्रयोग किया जाता है एक के रूप में एक वृत्त का चतुर्थ भाग चादर. चतुर्भागों चौराहे पर केंद्रित एक पेट्री डिश की परिधि में चिह्नित करें. संदर्भ प्रकाश स्रोत के तहत एक ही स्थिति में हमेशा परीक्षण थाली करने के लिए जगह के रूप में निशान का प्रयोग करें.
- एक स्थापित करेंदीपक, या तो एक साधारण सफेद प्रकाश बल्ब (फिलिप्स, Softtone 5W) या एक लोहे के समर्थन स्टैंड (फिशर साइंटिफिक, S47808) की मदद से पेट्री डिश के ऊपर एक एलईडी दीपक (एलईडी लैंप, 80012 सफेद, ओसराम). पूरे परीक्षण थाली homogenously प्रबुद्ध है कि एक तरह से ऊंचाई समायोजित करें. वे पारंपरिक प्रकाश बल्ब की तुलना में अधिक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य फेंकना के बाद से हम दृढ़ता से एलईडी लैंप के उपयोग की सलाह देते हैं. इसके अलावा एल ई डी कम गर्मी फेंकना.
- एक प्रकाशमापी (पर्यावरण मीटर PCE EM882) की मदद से प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें. आवश्यकता के रूप में 350-760 लक्स की रोशनी की तीव्रता को प्राप्त करने के लिए, ऊपर दीपक चाल या नीचे. एक समायोज्य बिजली की आपूर्ति करने के लिए दीपक Plugging दीपक (चित्रा 1 बी) के बिना चल तीव्रता को बदलने के लिए और अधिक लचीलापन देता है.
3. प्लेट्स तैयारी
- दोहरा आसुत जल (Millipore) के साथ 2.5% अगर की 200 मिलीलीटर (सिग्मा Aldrich, स्विट्जरलैंड A5093-500G) बनाओ.
- एक तालिका (90 मिमी व्यास पर पेट्री डिश रखें;Greiner जैव एक जीएमबीएच, पंक्तियों में 4550 Kremsmeinster, ऑस्ट्रिया) गर्म agarose डालने के लिये अनुमति देने के लिए.
- समाधान पूरी तरह से पारदर्शी और तरल पदार्थ है जब तक एक माइक्रोवेव में agarose उबाल लें. तरल समाधान बुलबुले को शामिल नहीं करता है सुनिश्चित करें. चेतावनी: ध्यान से मेज पर परिवहन समाधान बहुत गर्म हो सकता है, के बाद से!
- पूरी सतह homogenously समाधान की एक पतली परत के साथ कवर किया जाता है जब तक पेट्री डिश में गर्म agarose डालो, के बारे में दो या तीन मिलीमीटर पर्याप्त हैं. कोटिंग सभी प्लेटों से पहले solidifying agarose को रोकने के लिए जल्दी करो. प्लेटों को शांत करते हैं. कमरे के तापमान पर प्लेटें स्टोर और केवल तैयारी के एक ही दिन पर उन्हें का उपयोग करें.
4. लाइट पसंद टेस्ट
- ड्रोसोफिला के बाद परीक्षण प्रकाश का लाल तरंग दैर्ध्य समझ में सक्षम नहीं है इससे पहले प्रकाश प्रभाव को रोकने के लिए प्रयोग कमरे में लाल बत्ती की शर्तों के तहत काम करते हैं. टी रोशन करने के लिए एक चिराग में रखा एक लाल प्रकाश बल्ब (फिलिप्स, PFE712E * 8) का उपयोग करेंवह काम करने के लिए जगह है.
- 25 में सभी प्रयोगों के माध्यम से तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस एक हीटर या ठंडा डिवाइस के माध्यम से नियंत्रण कक्ष तापमान की आवश्यकता होती है.
- लगातार अंधेरे के तहत दो दिवसीय चक्र (खंड 1 से) के लिए पाला शीशियों से कुछ खाना ले लो. लार्वा आम तौर पर भोजन की सतह पर खुदाई कर रहे हैं, एक रंग (फिशर साइंटिफिक, 14-373-25A) की मदद से ऊपरवाला परत (लगभग 5 मिमी गहरी) ले. एक पेट्री डिश ढक्कन के बाहरी तरफ भोजन बिखरा हुआ है, थोड़ा पानी जोड़ने और रंग के साथ धीरे मिश्रण.
- भोजन से L3 लार्वा खिला लीजिए. प्रकाश वरीयता परीक्षण किया जाएगा, के रूप में नकारात्मक phototaxis का आश्वासन दिया है के बाद से ही L3 लार्वा खिला / जल्दी महत्वपूर्ण है चुनने. भटक / देर से भोजन पर रेंगने L3 लार्वा या बड़ा लार्वा शायद पहले से ही उनके photobehavior बंद कर दिया. उनके पूर्वकाल spiracles खुले हैं और एक उंगली की तरह के रूप में बाहर करने के लिए protruded क्योंकि दूध पिलाने L3 लार्वा (नकारात्मक phototactic) मान्यता प्राप्त किया जा सकता है. पीछे झरोखातीन खुलने प्रत्येक, और बड़ी शाखाओं बाल के चार समूहों है. लार ग्रंथियों दूसरी पेट खंड 11 के लिए करता हूं. कोई सफेद रोशनी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जबकि एक खुर्दबीन के नीचे लार्वा मचान सुविधाजनक है. एक लाल बत्ती दीपक प्रयोगों की आवश्यकता है इससे पहले त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत मंचन अगर लार्वा रोशन करने के लिए आवश्यक है.
- नल के पानी में संक्षेप में लार्वा धोएं और जल्दी खिला तीसरे instar लार्वा (अभी भी लाल बत्ती में) एकत्र. परीक्षण थाली तक लार्वा स्थानांतरित करने से पहले, एक गीला तूलिका के साथ लार्वा लेने के लिए और एक कागज तौलिया या फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त पानी सावधानी से अवशोषित. यह जानवर को नुकसान पहुँचा और उसके व्यवहार को प्रभावित कर सकता है के बाद भी जरूरत से ज्यादा लार्वा सूखी नहीं है.
- गीला तूलिका का प्रयोग सावधानी से प्लेट को लार्वा हस्तांतरण. प्लेट के केंद्र में लगभग 30 लार्वा के एक समूह रखें. ढक्कन के पहले ही चतुर्भागों साथ तैयार के साथ कवर प्लेट और (सेक देखना प्रयोग के लिए तैयार प्रकाश स्रोत के तहत थाली सेटमोर्चे 2).
- सफेद रोशनी दीपक पर मुड़ें और टाइमर शुरू. लार्वा 5 मिनट के लिए थाली पर आसानी से ले चलो, तो जल्दी से ढक्कन हटाने के लिए और अंधेरे में और प्रकाश quadrants में लार्वा की संख्या गिनती. एक मार्कर के साथ प्रत्येक लार्वा की स्थिति चिह्नित गिनती कम कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से थाली की एक तस्वीर लेने के लिए और एक अनुभवजन्य गिनती. लार्वा दीवारों पर रेंगने या अगर में burrowing तरह स्पष्ट नहीं प्रकाश वरीयता दिखा लार्वा तटस्थ वरीयता के रूप में माना जाना चाहिए और सिर्फ प्रकाश वरीयता सूचकांक की गणना की जाती है जब लार्वा की कुल संख्या में शामिल किया.
- गिनती के बाद, लार्वा के साथ थाली त्यागने और अगले प्रयोग के लिए एक नए परीक्षण की थाली के साथ बदलें. बाद में हैंडलिंग और निपटान के लिए एक आटोक्लेव प्लास्टिक की थैली में इस्तेमाल किया प्लेटें लीजिए.
- एक बार जब आप एक नया जीनोटाइप परीक्षण किया जा सकता प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में प्रदर्शन किया है. जीनोटाइप प्रति 10-15 परीक्षण के विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं.
5. डेटा विश्लेषणएस
- सुविधा के लिए एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट) या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर मूल (मूल लैब) के रूप में एक डेटा पत्रक के लिए डेटा स्थानांतरण. एक स्तंभ में एक दूसरे स्तंभ प्रकाश quadrants में पशुओं की संख्या में और प्लेट ("तटस्थ" लार्वा सहित) में पशुओं की कुल तीसरी में अंधेरे में पशुओं की संख्या, व्यवस्थित करें.
- निम्न सूत्र का उपयोग कर एक प्रयोग के लिए अंधेरे के लिए वरीयता सूचकांक (PREF) की गणना:
PREF (अंधकार) = (अंधेरे में लार्वा की संख्या - लार्वा की संख्या प्रकाश में) / लार्वा की कुल संख्या - समूहों के लिए एक उचित विश्लेषण के साथ सांख्यिकीय डेटा का एक सेट की तुलना करें. यहाँ, हम सांख्यिकीय दो समूहों की तुलना करने के लिए एक Wilcoxon परीक्षण का उपयोग करें. एक Tukey के कई तुलना के साथ एक एनोवा परीक्षण पद अस्थायी सामान्य वितरण धारणा कई गुना समूह तुलना में पूरी हो जाती है तो परीक्षण किया जा सकता है.
- दिन चक्र के साथ लाइनों और समय अंक के बीच स्पष्ट रूप से तुलना की है कि शो रेखांकन करें. डब्ल्यूई उपयोग मूल सॉफ्टवेयर (मूल लैब) सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण करने और उचित रेखांकन उत्पन्न, लेकिन किसी भी अन्य सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर सहायक हो सकता है.
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Representative Results
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के बाद, हम जंगली प्रकार कैंटन एस के प्रारंभिक तीसरे लार्वा स्टेडियम में प्रकाश अंधेरे वरीयता दो अलग circadian बार CT0 और CT12 पर मक्खियों का परीक्षण किया. वयस्कों के 12 घंटे प्रकाश 12 घंटा अंधेरे पाला और 12 घंटे के लिए अंडे देना छोड़ दिया गया. लार्वा ही प्रकाश अंधेरे व्यवस्था के तहत पहले दो दिन बढ़ता है. हम लगातार स्थिति (circadian घड़ी से चल रहे नि: शुल्क) के तहत दैनिक मॉडुलन परीक्षण करना चाहते थे चूंकि परीक्षण (चित्रा 3) का प्रदर्शन किया गया था, जब तक लार्वा तो अगले तीन दिनों के लिए लगातार अंधेरे में हस्तांतरित किया गया.
यह इस अन्य तीव्रता (70 और 600 लक्स) 7 की तुलना में circadian चक्र के साथ ड्रोसोफिला लार्वा की रोशनी प्रतिक्रिया के अंतर का पता लगाने के लिए इष्टतम प्रकाश की तीव्रता है कि दिखाया गया है के बाद से यहाँ, हम 350 लक्स इस्तेमाल किया. CT12 साथ CT0 तुलना करते समय प्रकाश जवाब में प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता में अंतर है, और इसलिए मनाया जाता है. ड्रोसोफिला में, CT0 मेल खानाएस सुबह के साथ, CT0-CT12 के बीच आधा चक्र व्यक्तिपरक दिन माना जाता है और CT12 से CT24 व्यक्तिपरक रात 12 से है. लाइट photosensitivity अंधकार से लार्वा का लगभग 77% जल्दी व्यक्तिपरक रात (3B चित्रा) में अंधेरा वरीयता का लगभग 69% के साथ तुलना में अंधेरा पसंद करते हैं जब प्रकाश, के लिए संक्रमण के बाद संक्षेप में अधिक है. यह भी एक प्रयोग के लिए ऊपर प्रस्तुत सूत्र के साथ गणना अंधेरे वरीयता सूचकांक (PREF (अंधकार)) से परिलक्षित होता है. सभी पुनरावृत्ति औसतन हम CT12 के लिए CT0 के लिए और 0.36 से 0.52 की एक प्राथमिकता सूचकांक प्राप्त किया. Wilcoxon परीक्षण (मूल) दो समय अंक के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का उपयोग करना (पी = 0.0229) दिखाया गया है.
चित्रा 1. (ए) पेट्री डिश lids में चतुर्भागों चिह्नित. Quadrants मदद से पेट्री डिश ढक्कन में चिह्नित किया जा सकता है कैनवास के रूप में इस्तेमाल छपी एक वृत्त का चतुर्थ भाग के. पीछे एल्यूमीनियम पन्नी की पहली परत प्लेट की बाहरी सतह पर चिपके जा सकता है और अंधेरे के लिए दो विपरीत quadrants में काले टेप के साथ कवर किया. (बी) योजनाबद्ध प्रकाश अंधेरे वरीयता परीक्षण के लिए निर्धारित किया है. (ग) एक पेट्री पकवान अंधेरे चतुर्भागों के साथ कवर किया और 2.5% अगर साथ भरा, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. प्रकाश अंधेरे वरीयता परीक्षण, सही परीक्षण प्लेट (स्टार्ट) पर लार्वा की स्थापना के बाद और 5 मिनट (अंत) के बाद एक पकवान का उदाहरण. आमतौर पर, हम एक प्रयोग के लिए 30 पशुओं का एक समूह का उपयोग करें.
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चित्रा 3. (ए) लाइट शासन L3 लार्वा खिलाने में प्रकाश वरीयता परीक्षण करने के लिए पीछा किया. (बी) के दोनों समय के लिए अंधेरे वरीयता का प्रतिशत (CT0 और CT12) का परीक्षण बताते हैं. पसंदीदा अंधकार और प्रकाश प्रत्येक पुनरावृत्ति और सभी repetitions के लिए गिने जाते हैं कि लार्वा का प्रतिशत औसत. अगर पर थाली या खुदाई की सीमाओं में लार्वा तटस्थ के रूप में माना जाता है. (सी) डार्क वरीयता सूचकांक एक ही समय अंक के लिए गणना की. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर सांख्यिकीय Wilcoxon राशि रैंक परीक्षण (पी <0.05) द्वारा दिखाया गया है. (एन बार बिंदु प्रति = 18 (540 लार्वा)). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
वर्णित प्रकाश वरीयता परीक्षण लार्वा सहज photobehavior का फायदा उठाते हैं. परख, स्थापित करने के लिए आसान है कम कीमत पर कई repetitions की अनुमति देता है और प्रकाश संवेदन और प्रसंस्करण के बारे में बहुमूल्य जानकारी बचाता है. प्रयोगात्मक प्रतिमान व्यक्तियों हल्के या गहरे पसंद करते कितने का अपेक्षाकृत जल्दी मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. इस तरह की वरीयता कच्चे प्रतिशत के रूप में या वैकल्पिक रूप से पसंद सूचकांक (PREF) के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है. PREF जानवरों के अंतर के रूप में व्यक्त किया है वरीय अंधेरे पशुओं की कुल द्वारा विभाजित कि वरीय प्रकाश और जानवरों कि.
प्रकाश वरीयता परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु प्रयोगों की अवधि है. यहाँ, हम पांच मिनट का परीक्षण किया है, लेकिन यह अन्य जीनोटाइप या अन्य प्रकाश गुण मतभेद के तहत इस प्रयोग की अवधि का उपयोग करते हुए इतना स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कि संभव है. कुछ उत्तेजनाओं के लिए (स्वाद) हम लंबे समय तक प्रयोग, अवधि के 20 मिनट के साथ, क्लीनर preferen देने महसूस किया है किछोटे परिवर्तनशीलता के साथ CES. हरकत या संवेदनशीलता प्रभावित और लार्वा परीक्षण प्लेट लगाने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है, जहां जीनोटाइप का उपयोग करते समय विभिन्न प्रयोगात्मक durations के परीक्षण विशेष रूप से उचित हो सकता है. उस मामले में, समय समान रूप से नियंत्रण और प्रयोगात्मक जीनोटाइप के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
परख भी यहाँ और पिछली रिपोर्टों 7,13 के रूप में दिखाया circadian चक्र के माध्यम से दिन के समय अंक के बीच मतभेद का पता लगाने की अनुमति देता है. रोशनी का उत्तेजनाओं को हल्की प्रतिक्रियाओं जोरदार संभवतः photoreceptors के नियमन संवेदनशीलता से, circadian घड़ी द्वारा नियंत्रित किया जाता है. लार्वा प्रतिक्रियाओं दिन के पहले दो घंटे के दौरान कमी प्रकाश और प्रकाश चरण के शेष दस घंटे के दौरान स्थिर हो जाते हैं. दिन के कोर्स में विभिन्न समूहों की तुलना करने के लिए, यह प्रत्येक समूह के लिए circadian चक्र के बराबर या समान समय बिंदुओं पर प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कि परिवर्तन से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण हैथर्मल उतार चढ़ाव या प्रयोगों के लिए पिछले प्रकाश आदानों अंधेरे में काम कर के रूप में यदि लार्वा व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं. इस के लिए, यह प्रयोग के लिए इस्तेमाल लोगों से ही तापमान और आर्द्रता में लार्वा पीछे और जब जरूरत अंधेरे में जानवरों को रखने से सावधान रहना महत्वपूर्ण है.
लार्वा शरीर और 3 के साथ फैल 2) multidendritic न्यूरॉन्स चतुर्थ श्रेणी), घड़ी आंतरिक नीले प्रकाश सेंसर,) 1 लार्वा आंख द्वारा मध्यस्थता rhodopsin निर्भर प्रणाली: कम से कम तीन हाल ही में वर्णित रास्ते ड्रोसोफिला लार्वा 5,14 में संवेदन प्रकाश में योगदान रो व्यक्त. दृश्य व्यवहार के लिए अलग प्रकाश संवेदी रास्ते का योगदान यहाँ वर्णित वरीयता परीक्षण द्वारा संबोधित किया जा सकता है. विशिष्ट तीव्रता और तरंग दैर्ध्य के साथ रोशनी के विभिन्न स्रोतों से अलग प्रकाश गुणों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह संभावना प्रकाश संवेदन प्रणाली की व्यक्तिगत तत्व की संवेदनशीलता एक के बारे में विवरण पर निर्भर कर सकते हैंघ प्रकाश आदानों कार्रवाई कर रहे हैं कैसे. प्रकाश उत्तेजना के बारे में एक अधिक विस्तृत प्रयोग के लिए, परख आसानी से अलग प्रकाश गुणों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. बढ़ रही है और प्रकाश की तीव्रता कम हो रही है, साथ ही अलग तरह के प्रकाश तरंगदैर्य परीक्षण विशिष्ट तरंगदैर्ध्य (कई संभावनाओं के बाजार में उपलब्ध हैं) के साथ स्वयं बनाया एलईडी लैंप का उपयोग करके संभव है. बिजली की आपूर्ति के साथ इस तरह के दीपक के नियंत्रण तीव्रता का एक अच्छा सीमा प्रदान करता है. प्रकाश गुण जोड़ तोड़ के लिए इन संभावनाओं प्रकाश वरीयता परीक्षण के साथ परीक्षण किया जा करने के लिए चर की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करते हैं.
इसके अलावा, ड्रोसोफिला लार्वा उनके पैतृक photobehavior 15 को संशोधित करने, रोशनी या अंधेरे के साथ या तो दण्ड या पुरस्कार से संबद्ध कर सकते हैं. इसके लिए वर्णित प्रोटोकॉल के एक अनुकूलन परख की बहुमुखी प्रतिभा दिखा कार्यरत था. सारांश में, प्रकाश अंधेरे वरीयता परीक्षण तेजी से एक बेहतर समझ के साथ योगदान एक मूल्यवान साधन हैऔर प्रकाश उत्तेजनाओं और जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रणाली और ड्रोसोफिला लार्वा की circadian घड़ी के तत्वों से व्युत्पन्न दैनिक व्यवहार इस प्रक्रिया में शामिल रहे हैं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए फ़्राइबर्ग के जीव विज्ञान, विश्वविद्यालय के विभाग में हमारे सहयोगियों को धन्यवाद देता हूं. हम मक्खी शेयरों उपलब्ध कराने के लिए ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र धन्यवाद. इस काम के आर्थिक रूप से स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (PP00P3_123339) और एसजीएस को Velux फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G.
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
