Summary
在这里，我们描述了果蝇幼虫光暗偏好测试。此法提供了先天和昼夜节律调节的光传感和处理感光特性的信息。
Abstract
光作为环境信号来控制各级动物行为。 果蝇幼虫的神经系统是作为一个独特的模型，回答基本问题，如何快速昼夜行为之间的光信息处理和共享。 果蝇幼虫显示刻板的避税行为，当暴露在光线下。探讨可比简单的明暗偏好测试可应用于光依赖行为。参与传感和处理视觉输入的神经通路在脊椎动物和节肢动物部分重叠与处理光的昼夜信息。迷人的光传感系统和昼夜系统如何互动，以保持输出协调行为的问题，仍然在很大程度上未被果蝇是影响生物模型来处理这些问题，由于在大脑中的神经元数量少，遗传工具的可用性。神经manipul的BULLETIN。呈现明暗偏好测定允许视觉行为包括昼夜的控制趋光性了一系列的调查。
Introduction
在这里，我们描述了一个基于行为的检测暗（或光）幼虫偏好。幼虫的反应与一个强大和刻板避光反应在觅食阶段（L1至L3月初）1。幼虫避光行为的测定法的目的是评估和比较亮或暗的幼虫自由移动，在涂有琼脂的陪替氏培养皿中的一组的偏好。这种行为的检测不仅提供信息的敏感性，一体化和时间的视觉系统可塑性，它进一步提供了光敏感性及其过程控制的昼夜系统的提示。
果蝇幼虫眼（也被称为Bowlig的器官; BO），光感的主要器官。每只眼睛是由12个光感受器（PR），8 PRS表达绿色，：敏感rhodopsin6（RH6）和四个永久居民表达了对蓝色敏感rhodopsin5（RH5）2,3。此外PRS，ALSØIV级的multidendritic神经元，涵盖幼虫体壁，已经确定以应对4,5有害光线强度。它也被称为位于中央的幼虫脑起搏器的神经元表达光敏蛋白隐花色素（喊），作为时钟固有的蓝色光传感器大脑内的6,7。有趣的野生型动物photophobicity显示一昼夜成分在不同时间点的过程中，白天和夜间的时候，用这个方法测试。对L3幼虫觅食表现出较强的photophobicity在黎明和photophobicity的黄昏时进行测试时光黑暗的偏好7。有趣的是，只有RH5-PRS都需要避免轻，而RH6-PRS是可有可无的。两者RH5-PR和RH6-PRS参与重置分子钟光8。惊魂途径，必须协调与其他光感的途径，以协调在一个适当的行为输出一天的过程中。乙酰胆碱在PRS光回避行为，以及夹带的分子时钟起着至关重要的作用。从PRS昼夜起搏器神经元阻断神经递质乙酰胆碱减少光黑暗偏好测定8避光反应。采用相同的检测，两个对称的神经元对最近发现的第三龄幼虫果蝇 9开灯偏好。这两对神经元功能在后期幼体阶段，当动物留下的食物大概是找到一个合适的的pupariation网站。然而，视觉通路如何相互作用，一昼夜地控制幼虫的视觉行为的问题在很大程度上仍然未回答。光偏好测定允许昼夜时间点之间的比较，飞线和昼夜状态下不同光质。该法是很容易准备，价格低廉，一直是有用的，我以前Ñ几个实验室的描述和研究光派生行为在幼虫。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。苗种培育
- 保持飞菌株或大众文化的遗传杂交玉米粉培养基上，在25°C下12小时轻12小时黑暗周期中一只苍蝇孵化器配备有光线和定时器。
- 稀释在水中，形成衬垫酵母的流体浆料（10克的背衬酵母稀释用3-4毫升蒸馏水H 2 O）。加一小滴玉米粉食品和覆盖小瓶。让至少一个小时的干燥，以避免成虫坚持酵母膏。将酵母水稀释一小滴表面上的食物可提高产卵。或者可以使用面包酵母膏，20％乙酸（醋酸）（Sigma Aldrich公司，瑞士A6283-100ML）。对于这一点，蘸棉条的尖端的解决方案和玉米粉食品表面上蔓延。
- 将成年苍蝇（至少四天左右，但不是年龄大于10天）在玉米粉食品小瓶。为了获得足够的幼虫重复偏好，投入足够的成年人到每个小瓶试了几次，并允许统计比较。对于遗传杂交，我们通常使用最小的20位女性和5-10男性每小瓶，但一些线路需要更多的女性获得足够的幼虫的后代。
- 允许成人产卵12小时，并将他们转移到新的小瓶。成人可以转移在早晨和傍晚。我们通常将成人七到十天，如果需要采取新的成年人。
- 保持鸡蛋在孵化器每12小时的集合，让增长的幼虫在25°C，12小时光照，12小时黑暗周期和60％的湿度。为了测试为昼夜组件视觉行为举动幼虫持续黑暗（DD）鸡蛋收集后48小时（相当于两光暗周期）。对于这一点，使用一个单独的孵化器不轻，但保持所有其他条件，如温度和湿度相同。要确保传输的小瓶DD孵化器开关前的黑暗阶段。搬家前的小瓶anothER孵化器把小瓶在一个纸箱或小瓶包装用铝箔，以防止光线在传输过程中暴露（包装纸箱或包装有许多工作要做，在“灯相”前孵化器之间的位移）。防止动物，这一点，任何光线照射后，直到实验开始。
- 经过4天（从产蛋84至108小时）收集：早期喂养幼虫（L3）的时间点进行测试（见4。轻偏好测试点。4.4）。
2。测试设置
- 在一个黑暗的房间，恒定的温度和湿度条件下进行实验。
- 为了保持两个象限培养皿在黑暗中，盖好盖子，用黑胶带和铝箔。为了做到这一点，记下盖周围的中心。 90°，它们之间的分离，也标志着四点在边境的盖子。 ，使其更容易，绘制分在四个象限上的长度为10厘米20厘米见方的一张纸或一台计算机的帮助。切铝箔和黑色带（ 图1A）的 10厘米的正方形。包括两个相对象限胶合广场铝箔，第一层和黑胶带覆盖，要小心，还包括边境的盖子。
在过去的两个略有不同的形式，这样的检测。我们在这里使用的“四分之一板”实验，在培养皿分为四个相等季度10。在替代的“半片”检测培养皿分一半（半暴露于光，在黑暗中一半）1,7,8。直到今天，两个检测之间没有显着的差异已经出版。 - 胶用于标记盖在桌子上的光源下，如一个象限表。马克象限的交点为中心的陪替氏培养皿的周围。使用这些标记作为参考试验板放置的光源下，总是在相同的位置。
- 安装灯，无论是一个简单的白色灯泡（菲利普斯，5W Softtone）或以上的铁支架（Fisher Scientific公司，S47808）的帮助下，在培养皿的LED灯（LED灯，80012白，欧司朗）。调整的方式，均匀照亮整个测试板的高度。我们强烈建议使用LED灯具，因为它们比传统的灯泡发出更具体的波长。此外，发光二极管发出的热量更少。
- 光度计（环境仪表PCE EM882）的帮助下，调整光照强度。为了达到所需的350-760勒克斯的光照强度，移动灯或向下的需要。灯泡插入一个可调节的电源，让更多的灵活性，而不移动的灯（ 图1B）来改变强度。
3。板准备
- 200ml的2.5％琼脂（Sigma-Aldrich公司，瑞士A5093-500G），用双蒸水（Millipore公司）。
- 将培养皿放在桌子上（直径90毫米;格雷纳生物之一，奥地利，4550 Kremsmeinster联系）行允许浇热琼脂糖。
- 琼脂糖微波炉煮，直到解决方案是完全透明和流体。确保液体溶液中不含有气泡。注意：运输仔细的表，因为该解决方案可以非常热！
- 琼脂糖到培养皿中倒入热水，直到整个表面均匀地覆盖有一薄层的溶液，两或三毫米就足够了。要迅速防止琼脂糖凝固涂装前所有板块。让板降温。板在室温下储存，并使用它们只在同一天的准备。
4。轻偏好测试
- 在实验室的红色光条件下的工作，以防止光线的影响，，由于果蝇是在测试之前不能够感应到红色的波长的光。使用红色灯泡（菲利普斯，PFE712E * 8）安装一盏灯，照亮吨他的工作场所。
- 通过所有的实验中温度保持在25°C。如果需要的话，通过控制室内温度的加热器或冷却装置。
- 采取一些食物持续黑暗下的为期两天的周期（从第1节）饲养的小瓶。由于幼虫通常挖的食品的表面上，采取的最上层（约5毫米深）的帮助下，用抹刀（Fisher Scientific公司，14-373-25A）。传播食品培养皿中盖的外侧，加清水适量，用锅铲轻轻混匀。
- 收集从食物喂养L3幼虫。由于重量轻，将被测试优先选择，只有早期/喂养L3幼虫是至关重要的，因为负趋光性是有保证的。晚/漂泊L3的幼虫或大的幼虫的食物上爬行，想必已经交换了他们的感光特性。可以确认的，因为他们的前气门是开放的，向外侧伸出一个手指状的形式饲喂L3幼虫（负趋光）。后气门s有三个开口，四组大支链的头发。唾液腺延伸到第二腹节11。分段幼虫在显微镜下是方便，而没有白色光应使用。一个红色的灯是必要的，如果分期立体显微镜下，实验前需要照亮幼虫。
- 自来水中简要幼虫洗净，，收集早期喂养三龄幼虫（仍然在红灯）。幼虫转移到试验板之前，用湿的画笔幼虫，并小心地吸收过量的水，用纸巾或滤纸。不要过分干燥的幼虫，因为它可能会损害动物，并影响其行为。
- 使用湿画笔仔细的幼虫转移到板。放置在板中心的一组约30只幼虫。覆盖板的盖子已经准备好与象限板的光源下，准备实验（见秒重刑2）。
- 白色灯打开，并开始计时。让幼虫上自由移动盘5分钟，然后迅速取下盖子，在黑暗和光象限计数的幼虫数。用记号笔标记每个幼虫的位置，可以缓解计数。或者拍摄一张照片的板块，并计算后验。幼虫光偏好不清楚，在墙壁上爬行状幼体或钻入琼脂应被视为中性偏好，刚好被列入总数的幼虫光偏好指数的计算方法。
- 计数后，幼虫和丢弃板更换一个新的测试板接下来的实验中。收集用过的盘子，在高压釜中的塑料袋后的处理和处置。
- 一旦您已执行了足够数量的实验可以测试一个新的基因型。 10-15试验每个基因型是足以进行分析。
5。数据分析Ş
- 为了方便将数据传送到Excel中的数据表（微软）或者原产（原产实验室）的计算机上进行进一步的统计分析。排列在一列中的动物在黑暗中，在第二列的动物的数量的光象限和第三板（包括“中性”的幼虫）的动物的总数量。
- 计算使用下列公式计算每个实验的黑暗的偏好指数（县）：
PREF（黑暗）=（在黑暗的幼虫 - 幼虫数光）/总数幼虫的 - 比较统计学上的一组数据组的适当分析。在这里，我们使用Wilcoxon检验统计学比较两组。方差测试一个Tukey多重比较事后检验是可以做到的，如果满足正态分布假设在歧管组比较。
- 使图表清楚地表明线和沿天为一周期的时间点之间的比较。 WE使用Origin软件（原产实验室）测试统计学意义，并产生相应的图表，但任何其他统计软件可以帮助。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
继上述协议，我们测试了两种不同的昼夜倍CT0和CT12明暗偏好早期幼虫第三体育场野生型广东-S飞。成人12小时光照，12小时黑暗饲养，并留下12小时产卵。幼虫生长的前两天，在相同的光线暗的政权。因为我们想在测试昼夜调制恒定的条件下（自由运行的生物钟），幼虫，然后转移到不断的黑暗未来三天，直到进行测试（ 图3A）。
这里，我们用350勒克司，因为它已被证明，这是最佳的光强度检测果蝇幼虫的光响应的差异，沿昼夜周期相比，其他强度（70和600勒克司）7。光灵敏度的差异，因此，在光反应时观察比较CT0 CT12。在果蝇中，CT0重合s与黎明之间的半周期CT0-CT12被认为是主观的一天，从CT12 CT24主观晚上12。光光敏性较高的短暂过渡后，从黑暗走向光明，近77％的幼虫喜欢在黑暗中相比，几乎69％的暗喜好在早期的主观夜（ 图3B）。这也反映了黑暗偏好指数（PREF（黑暗））计算上述公式，每个实验。平均所有重复，我们获得了优势指数为0.52 CT0和0.36 CT12。采用Wilcoxon检验（产地）两个时间点之间差异的统计显着性（P = 0.0229）。
图1（A）标记培养皿盖子象限。在培养皿盖的帮助，可以打上象限的帆布作为印刷象限。铝箔后方的第一层可以粘在板的外表面，并用黑胶带覆盖在两个相对的象限为暗（B）的亮-暗的要求测试管脚设置为（C）的Petri菜覆盖着暗象限充满2.5％琼脂，准备用于实验。 点击这里查看大图 。
图2。光暗偏好测试，例如一碟后幼虫在测试板（开始），5分钟后（完）。通常情况下，我们使用了每个实验组30只动物。
tp_upload/50237/50237fig3.jpg“ALT =”图3“FO：内容宽度=”5.5英寸“FO-SRC =”/ files/ftp_upload/50237/50237fig3highres.jpg“/>
图3（A）轻制度遵循测试喂养L3幼虫光偏好。（B）占暗优先股两个时间点进行测试（CT0和CT12）。幼虫百分比首选黑暗与光明的每个重复和全部重复计算平均值。在边界挖琼脂板或幼虫被认为是中性的。（C）黑暗偏好指数计算相同的时间点。统计组间差异显着，以魏氏和秩和检验（P <0.05）。 （N = 18（540幼虫），每个时间点）。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
光偏好测试幼虫的先天优势，感光特性。该法是很容易的建立，允许多次重复，以较低的成本和光传感和处理提供了有价值的信息。实验范式允许多少人喜欢浅色或深色的相对快速定量。这种偏好可以显示作为原油的百分比，或者偏好指数（县）。 PREF被表示为动物的差异，优选的光，优选黑暗除以动物的总的动物。
光偏好测试中的一个关键点是实验的时间。在这里，我们测试了五分钟，但它可能，其他基因型或其他光质差异下使用这个实验持续时间不是很清楚。对于某种刺激（味觉），我们已经认识到，用20分钟的停留时间较长的实验，传递清洁preferen，CES变异较小。测试不同的实验持续时间可能是公平的，尤其是当使用运动或灵敏度的影响和幼虫需要更长的时间去探索测试板的基因型。在这种情况下，应同样调整时间控制和实验基因型。
该法还允许通过昼夜周期检测的一天时间点之间的差异如下图所示，在以前的报告中7,13。光光的刺激反应强烈受生物钟，想必调制光感受器的敏感性。幼虫光响应减少在当天的前两个小时，在剩下的十几个小时的轻相趋于稳定。为了比较不同组在一天的过程中，关键的是使等效或相同的时间点的每个组的昼夜周期的实验。另外，这也是很重要的，以避免变化，可以影响幼虫的行为，如热波动或光输入先前的实验，如果在黑暗中工作。对于这一点，重要的是要在相同的温度和湿度比用于实验的后位幼虫和饲养动物在黑暗中，在需要的时候，要小心。
最近描述至少有三个途径有助于光感应在果蝇幼虫5,14：1） 视紫红质依赖系统介幼虫眼; 2）的multidendritic神经元IV类，传播沿幼虫的身体和3）时钟的内在蓝色光传感器表达惊魂。贡献不同的光感的视觉行为的途径可以解决这里描述的偏好测试。可以使用具有特定的强度和波长的不同来源的照明，以测试不同的光质。这种可能性可以依赖于光感测系统中的单个元素的灵敏度的详细信息D如何处理这种光投入。如需更详细的关于光刺激试验，该法可以很容易地修改，以测试不同光质。光强度的增加和减少，以及测试不同的光的波长可以与特定波长（许多可能性是可以在市场上）通过使用自制的LED灯。这种灯与电源控制提供了一个很好的强度范围。这些可能性用于操纵光质提供了广泛的光偏好测试变量进行测试。
此外， 果蝇幼虫能联想到的惩罚或奖励，无论是光明或黑暗，修改他们的母语的感光特性15。对于这一点，描述的协议适应的检测显示的多功能性。综上所述，明暗偏好测试是一个有价值的工具，有助于更好地了解快速来自光刺 激和元素果蝇幼虫光敏感系统和生物钟的昼夜节律行为都参与了这一过程。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢我们的同事在弗里堡大学生物系，富有成效的讨论。我们感谢布卢明顿联合中心提供飞股票。财政支持这项工作是由瑞士国家科学基金会（PP00P3_123339）和威卢克斯基金会SGS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G.
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
