Summary
Aqui nós descrevemos um teste de preferência claro-escuro para Drosophila larva. Este ensaio fornece informações sobre regulação inata e circadiano da luz de sensoriamento e processamento photobehavior.
Abstract
Atos de luz como sinal ambiental para controlar o comportamento de animais em vários níveis. O sistema nervoso Drosophila larval é usado como um modelo único para responder a perguntas básicas sobre como informação de luz é processada e compartilhada entre os comportamentos rápidos e circadiano. Larvas Drosophila exibir um comportamento de evitação estereotipada quando expostos à luz. Para investigar comportamentos dependentes leves testes comparativamente simples de preferência claro-escuro podem ser aplicadas. Em vertebrados e artrópodes as vias neurais envolvidos na percepção e processamento de informações visuais se sobrepõem parcialmente com os de processamento de informações circadiano photic. A questão fascinante de como o sistema de detecção de luz e o sistema circadiano interagem para manter as saídas de comportamento coordenado permanece largamente inexplorado. Drosophila é um modelo de impacto biológico para abordar estas questões, devido a um pequeno número de neurónios no cérebro e na disponibilidade de ferramentas genéticas para manipul neuronalração. O ensaio de preferência claro-escuro apresentado permite a investigação de uma série de comportamentos visuais, incluindo controle circadiano da phototaxis.
Introduction
Aqui nós descrevemos um ensaio comportamental com base na preferência larval para escuro (ou luz). Larvas reagir com uma resposta fotonegativo forte e estereotipados durante os estágios de forrageio (L1 até o início L3) 1. O ensaio é destinado a avaliar o comportamento photophobic da larva e compara o claro ou escuro preferência de um grupo de larvas de mover-se livremente em uma placa de Petri revestidas com ágar. Este ensaio comportamental não só fornece informações sobre a sensibilidade, a integração temporal e plasticidade do sistema visual, proporciona ainda dicas sobre como sensibilidade à luz e ao seu processo é controlado pelo sistema circadiano.
A Drosophila olho larval (também denominado Órgão Bowlig; BO), é o principal órgão de percepção luminosa. Cada olho é composto de 12 fotorreceptores (PR), oito PRs expressar a rhodopsin6 verde-sensível (RH6) e quatro PRs expressar a rhodopsin5 blue-sensível (RH5) 2,3. Além de PRs, alsÔ classe IV neurônios multidendritic, que cobrem a parede do corpo larval, foram identificados para responder a intensidades de luz nocivos 4,5. Sabe-se também que os neurónios do pacemaker situados no centro do cérebro larval expressar a proteína sensível à luz criptocromo (Cry), que age como relógio sensor de luz azul intrínseca dentro do cérebro 6,7. Curiosamente photophobicity de animais de tipo selvagem mostra um componente circadiano em diferentes pontos de tempo durante o decurso do dia e da noite, quando um teste com este ensaio. Respostas a luz de forrageamento larva L3 mostrou photophobicity forte na madrugada e inferior photophobicity ao entardecer, quando testado para a preferência claro-escuro 7. Curiosamente só RH5-PRs são necessários para evitar a luz, enquanto RH6-PRs são dispensáveis. Ambos, RH5-PRs e RH6-PRs estão envolvidos em como acertar o relógio molecular pela luz 8. O caminho Cry deve ser coordenada com as outras vias de luz sensores de orquestrar uma saída de comportamento apropriado nodecorrer do dia. A acetilcolina em RP desempenha um papel essencial no comportamento de evasão luz, bem como o arrastamento do relógio molecular. Bloqueio de neurotransmissão acetilcolina dos PRs aos neurônios marcapasso circadiano reduz a resposta photophobic no ensaio de preferência light-escuridão 8. Utilizando o mesmo ensaio, os dois pares simétricos de neurónios foram recentemente identificados para exibir a preferência luz do terceiro instar de larvas de Drosophila 9. Esses dois pares de neurônios pode estar funcionando durante a fase larval final, quando os animais deixam a comida para encontrar provavelmente um site pupariation apropriado. No entanto, a questão de como as vias visuais interagir e controlar o comportamento visual de uma forma larval circadiano permanece praticamente sem resposta. O ensaio de preferência light permite comparações entre os momentos circadianos, voar linhas e estaduais circadiano sob diferentes qualidades de luz. O ensaio é barato e facilmente preparado e tem sido útil anteriormente in vários laboratórios para descrever e estudar a luz comportamento derivado da larva.
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Protocol
1. Larvicultura
- Mantenha voar estirpes ou cruzamentos genéticos na cultura de massa a 25 ° C em meio a farinha de milho em uma hora de luz 12 ciclo de 12 horas de escuro em uma mosca incubadora equipado com luz e timer.
- Diluir Backer levedura em água para formar uma pasta fluida (10 g de levedura Backer diluída com 3-4 ml de H2O destilada). Adicione uma pequena queda para o milho refeição e cobrir os frascos. Deixar secar durante pelo menos uma hora, para evitar moscas adultas adere à pasta de levedura. Colocar uma pequena gota de levedura diluída em água sobre a superfície do alimento pode melhorar a oviposição. Alternativamente pasta de levedura de panificação, ácido acético a 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suiça A6283-100ml) pode ser usado. Para isso, molhar a ponta de um Q-tip na solução e espalhe sobre a superfície da refeição de milho.
- Coloque moscas adultas (pelo menos quatro dias de idade, mas não mais do que 10 dias), em farelo de frascos de alimentos. Coloque adultos suficientes para cada frasco, a fim de obter larvas suficiente para repetir a preferênciatestar várias vezes e permitir a comparação estatística. Para cruzamentos genéticos, que normalmente usam um mínimo de 20 fêmeas e machos 5-10 por frasco, mas algumas linhas precisam de mais fêmeas para obter uma prole larval suficiente.
- Permitem que os adultos põem ovos para 12 horas e transferi-los para novos frascos. Os adultos podem ser transferidas, de manhã e à noite. Costumamos transferir adultos por sete a dez dias e se necessário tomar novas adultos.
- Manter as colecções de ovo tomadas cada 12 horas na incubadora e deixar crescer as larvas a 25 ° C, 12 horas de ciclo claro-escuro de 12 horas e 60% de humidade. Para testar componentes circadianos de movimento larvas visuais comportamento à escuridão constante (DD) 48 horas após a coleta de ovos (correspondente a dois ciclos claro-escuro). Para isso, use uma incubadora separado, sem luz, mas manter todas as outras condições, tais como temperatura e umidade idênticos. Certifique-se de transferir os frascos para o DD incubadora pouco antes da mudança para a fase escura. Antes de mover os frascos another incubadora colocar os frascos em uma caixa de papelão ou embrulhar os frascos com papel alumínio para evitar a exposição à luz durante a transferência (embalagem em caixa de papelão ou embalagem tem que ser feito durante o "apagar as luzes da fase" antes da mudança entre incubadoras). Impedir que os animais de qualquer exposição à luz após este ponto e até experimentos início.
- Após 4 dias (84-108 hr de postura de ovos) recolher cedo L3 (larvas de alimentação) nos pontos de tempo para serem testados (ver 4. Luz preferência teste, ponto. 4.4.).
2. Test Setup
- Realizar experiências em um quarto escuro, com temperatura constante e umidade.
- Para manter dois quadrantes da placa de Petri em trevas, cobrir a tampa com fita preta e folha de alumínio. A fim de fazer isso, marcar o centro da circunferência da tampa. Mark também quatro pontos na borda da tampa, com 90 ° de separação entre eles. Para torná-lo mais fácil, desenhar um quadrado 20 centímetros dividido em quatro quadrantes, de 10 cm de comprimento em umfolha de papel ou com a ajuda de um computador. Corte de 10 centímetros quadrados de papel de alumínio e uma fita preta (Figura 1A). Cubra dois quadrantes opostos colando um quadrado de papel alumínio, como primeira camada e fita preta cobrindo-o, tenha cuidado para também cobrir a borda da tampa.
No passado foram usadas duas formas ligeiramente diferentes desta ensaios. Nós, aqui utilizar o ensaio "quarter-placa", em que a placa de Petri é dividido em quatro partes iguais de 10. Em alternativa o ensaio de "meia-placa", a placa de Petri é dividido metade (metade exposto à luz, em meia escuro) 1,7,8. Até hoje não há diferenças significativas entre os dois testes foi publicada. - Cola uma folha de quadrante, como a utilizada para a marcação das tampas direito sob a fonte de luz sobre a mesa. Marque a circunferência de uma placa de Petri centrada na intersecção quadrantes. Use as marcas de referência para colocar a placa de teste sempre na mesma posição, sob a fonte de luz.
- Instale umlâmpada, ou uma simples lâmpada de luz branca (Phillips, Softtone 5W) ou uma lâmpada de LED (lâmpadas LED, 80012 Branco, Osram) acima da placa de Petri com a ajuda de um carrinho suporte de ferro (Fisher Scientific, S47808). Ajustar a altura de uma forma que toda a chapa de teste é iluminado de forma homogénea. Recomendamos o uso de lâmpadas LED, uma vez que emitem comprimentos de onda mais específicas do que as lâmpadas convencionais. Além disso, LEDs emitem menos calor.
- Ajustar a intensidade da luz com a ajuda de um fotômetro (Ambiente Medidor PCE EM882). Para alcançar a intensidade da luz necessária de 350-760 lux, mover a lâmpada para cima ou para baixo, conforme necessário. Ligar a lâmpada de uma fonte de alimentação ajustável dá mais flexibilidade para mudar as intensidades, sem mover a lâmpada (Figura 1B).
3. Placas de Preparação
- Adicione 200 ml de 2,5% de agar (Sigma-Aldrich, Suiça A5093-500G), com água bi-destilada (Millipore).
- Coloque placas de Petri sobre uma mesa (90 mm de diâmetro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Áustria) em linhas para permitir derramar quente agarose.
- Ferver a agarose em um forno de microondas até que a solução é completamente transparente e de fluido. Certifique-se de que a solução líquida não contém bolhas. ATENÇÃO: Transporte cuidadosamente a tabela já que a solução pode ser muito quente!
- Verter a quente de agarose em placas de Petri até que toda a superfície seja homogeneamente coberto com uma fina camada da solução, cerca de dois ou três milímetros são suficientes. Seja rápido para evitar agarose solidificar antes de todas as placas de revestimento. Deixe as placas esfriar. Armazenar as placas à temperatura ambiente, e utilizá-los apenas no mesmo dia da preparação.
4. Luz teste de preferência
- O trabalho sob condições de luz vermelha na sala de ensaio para evitar a influência de luz antes do ensaio, uma vez Drosophila não é capaz de detectar a luz de comprimentos de onda vermelhos. Use uma lâmpada vermelha (Phillips, PFE712E * 8) montado em uma lâmpada para iluminar tele Place to Work.
- Manter a temperatura por meio de todas as experiências a 25 ° C. Temperatura ambiente de controle por meio de um dispositivo de aquecimento ou arrefecimento, se necessário.
- Tome um pouco de comida dos frascos criados para ciclos de dois dias sob constante escuridão (na seção 1). Uma vez que as larvas são geralmente de escavação na superfície da comida, tomar a camada superior (cerca de 5 mm de profundidade) com a ajuda de uma espátula (Fisher Scientific, 14-373-25A). Espalhar a comida no lado exterior de uma tampa da caixa de Petri, adicionar um pouco de água e misturar cuidadosamente com uma espátula.
- Colete alimentando larvas L3 do alimento. Como preferência luz vai ser testado, escolhendo apenas no início / alimentação das larvas L3 é crucial, pois o phototaxis negativa está garantida. Tarde / vagando larvas L3 ou grande larva rastejando sobre a comida provavelmente já mudaram seu photobehavior. Alimentando larvas L3 (fototáxico negativo) pode ser reconhecida porque seus espiráculos anteriores estão abertas e se projetava para o exterior de forma finger-like. O espiráculo posteriors têm três aberturas de cada um, e quatro grupos de grandes pêlos ramificados. As glândulas salivares estender-se ao segundo segmento abdominal 11. Estadiamento larva sob um microscópio é conveniente, ao passo que a luz branca não devem ser usados. Uma lâmpada de luz vermelha é necessária para iluminar as larvas se encenar sob microscópio estereoscópico antes dos experimentos é necessária.
- Lave as larvas brevemente em água corrente e recolher cedo alimentando larvas de terceiro instar (ainda na luz vermelha). Antes de transferir as larvas na placa de teste, tomar as larvas com um pincel molhado e absorver cuidadosamente o excesso de água com uma toalha de papel ou papel-filtro. Não seque as larvas também excessivamente, pois pode prejudicar o animal e influenciar o seu comportamento.
- Usando o pincel molhado transferir cuidadosamente as larvas de placas. Coloque um grupo de cerca de 30 larvas no centro do prato. Cobrir a placa com a tampa já preparada com os quadrantes e colocou o prato com a fonte de luz pronto para a experiência (ver secção 2).
- Ligue a lâmpada de luz branca e iniciar o temporizador. Deixe a larva mover-se livremente sobre a placa durante 5 minutos, em seguida, rapidamente remover a tampa e contar o número de larvas no escuro e nos quadrantes de luz. Marcação da posição de cada larva com um marcador pode facilitar a contagem. Alternativamente tirar uma foto da placa e contar a posteriori. Larvas de luz de uma preferência clara, como larvas rastejar nas paredes ou enterrando-ágar devem ser considerados como preferências neutro e apenas ser incluídos no número total de larvas, quando o índice de preferência luz é calculado.
- Após a contagem, rejeitar a placa com larvas e substitua por uma nova placa de teste para o seguinte experimento. Colete placas usadas em um saco plástico autoclave para o tratamento e despejo posterior.
- Depois de ter realizado um número suficiente de experimentos de um novo genótipo podem ser testados. 10-15 ensaios por genótipo são suficientes para análise.
5. Dados Analysis
- Por conveniência transferir os dados para uma folha de dados como o Excel (Microsoft) ou de origem (origem Lab) em um computador para análise estatística. Dispor em uma coluna o número de animais no escuro, numa segunda coluna o número de animais nos quadrantes de luz e no terceiro o total de animais na placa (incluindo larvas "neutro").
- Calcular o índice de preferência (PREF) para a escuridão para cada experiência com a seguinte fórmula:
PREF (escuridão) = (número de larvas no escuro - número de larvas na luz) / número total de larvas - Comparar estatisticamente um conjunto de dados com uma análise apropriada para grupos. Aqui, usamos um teste de Wilcoxon para comparar estatisticamente dois grupos. Um teste de ANOVA com-comparação múltipla de Tukey post hoc teste pode ser feito, se o pressuposto de distribuição normal é cumprida em uma comparação grupo distribuidor.
- Adicione gráficos que mostram claramente as comparações entre as linhas e pontos de tempo ao longo do ciclo de dia. We uso do software Origin (Origin Lab) para testar a significância estatística e gerar gráficos apropriados, mas qualquer outro software de estatística pode ser útil.
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Representative Results
Seguindo o protocolo descrito acima, foi testada preferência claro-escuro no terceiro estádio larvar precoce do tipo selvagem Canton-S opera em dois tempos diferentes e circadianos CT0 CT12. Os adultos foram criados 12 horas de luz de 12 horas escuro e deixou de botar ovos de 12 horas. As larvas crescem os primeiros dois dias no mesmo regime de luz-escuro. Uma vez que nós quisemos testar modulação circadiano em condições constantes (de funcionamento livre do relógio circadiano), as larvas foram então transferidas para o escuro constante durante os próximos três dias até o teste foi realizado (Figura 3A).
Aqui, utilizou-se 350 lux, uma vez que foi mostrado que esta é a intensidade de luz óptima para detectar diferenças de resposta à luz da Drosophila larva ao longo do ciclo circadiano, em comparação com outras intensidades (70 e 600 lux) 7. As diferenças na sensibilidade à luz e, portanto, em resposta a luz é observada quando se compara com CT0 CT12. Em Drosophila, CT0 coincidirs com o amanhecer, o meio ciclo entre CT0-CT12 é considerado o dia subjetivo e do CT12 CT24 para a noite subjetiva 12. Fotossensibilidade luz é maior brevemente após a transição das trevas à luz, quando quase 77% das larvas preferem a escuridão em comparação com quase 69% de preferência escuro na noite subjetiva precoce (Figura 3B). Isso também se reflete no índice de preferência escuro (PREF (escuridão)) calculada com a fórmula apresentada acima, para cada experimento. Média de todas as repetições, obtivemos um índice de preferência de 0,52 para CT0 e de 0,36 para o CT12. Utilizando o teste de Wilcoxon (Origin) uma diferença estatística significativa entre os dois momentos é mostrado (p = 0,0229).
Figura 1. (A) Marcação quadrantes Petri tampas prato. Os quadrantes pode ser marcado na tampa placa de Petri com a ajuda de um quadrante impressos utilizados como lona. Posteriormente a primeira camada de folha de alumínio pode ser colada na superfície externa da placa e ser coberta com fita preta nos dois quadrantes opostos de escuridão. (B) Esquema configurado para o teste de preferência de luz-escuridão. (C) Um Petri prato coberto com quadrantes escuro e cheio com 2,5% de agar, pronto para ser utilizado para as experiências. clique aqui para ver figura maior .
Figura 2. Teste de preferência claro-escuro, o exemplo de um prato logo após a criação larva na placa de teste (Start) e depois de 5 min (End). Normalmente, usamos um grupo de 30 animais para cada experimento.
tp_upload/50237/50237fig3.jpg "alt =" Figura 3 "fo: content-width =" 5.5in "fo-src =" / files/ftp_upload/50237/50237fig3highres.jpg "/>
Figura 3. (A) regime Luz seguiu para testar a preferência light na alimentação L3 larva. (B) Percentagem de preferência escuro por tanto tempo aponta testado (CT0 e CT12). Percentual de larva que a escuridão preferido e luz são contados para cada repetição e todas as repetições em média. Larvas nas bordas da placa ou escavação no agar são considerados neutros. (C) índice de preferência escuro calculado para os mesmos pontos de tempo. Diferença estatística significativa entre os grupos é mostrada pelo teste de rank-sum de Wilcoxon (p <0,05). (N = 18 (540 larvas) por ponto de tempo). Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
O teste de preferência light descrito aproveita o photobehavior inata larval. O ensaio é fácil de estabelecer, permite que muitas repetições com baixo custo e oferece informações valiosas sobre detecção de luz e de processamento. O paradigma experimental permite a quantificação relativamente rápido de quantas pessoas preferem clara ou escura. Essa preferência pode ser exibido como percentagens brutas ou, alternativamente, como Índice de Preferência (PREF). O PREF é expressa como a diferença entre os animais que a luz preferido e animais que escuridão preferido, dividido pelo total de animais.
Um ponto crucial para o teste de preferência a luz é a duração das experiências. Aqui, testaram cinco minutos, no entanto, é possível que outros genótipos ou sob outras diferenças qualidades de luz não são tão claras usando esta duração da experiência. Para certos estímulos (gustativo) nós percebemos que as experiências mais longas, com 20 min de duração, entregar preferencial limpoces com menor variabilidade. Testando diferentes durações experimentais poderia ser justo, especialmente quando se utiliza genótipos onde locomoção ou sensibilidade é afetada e as larvas necessitam de mais tempo para explorar a placa de testes. Nesse caso, o tempo deve ser igualmente ajustada para controlos experimentais e genótipos.
O ensaio também permite detectar diferenças entre os pontos do dia de tempo através do ciclo circadiano, como mostrado aqui e em relatórios anteriores 7,13. Respostas a estímulos de luz fóticos são fortemente regulados pelo relógio circadiano, presumivelmente através da modulação da sensibilidade dos fotorreceptores. Larvar respostas à luz diminuição durante as primeiras duas horas do dia, e tornar-se estável durante as restantes 10 horas de fase de luz. Para comparar os diferentes grupos no decurso do dia, é crucial para fazer experiências em pontos do ciclo circadiano para cada grupo de tempo equivalente ou idêntica. Além disso, é também importante para evitar as mudanças quepode afetar o comportamento larval, como flutuações térmicas ou entradas de luz anteriores para experimentos se trabalhar no escuro. Por isso, é importante para elevar as larvas à mesma temperatura e humidade do que os utilizados para a experimentação e ter o cuidado de manter os animais na escuridão, quando necessário.
Pelo menos três caminhos descritos recentemente contribuir para iluminar sensor de Drosophila larva 5,14: 1) o sistema dependente rodopsina mediado pelo olho larval, 2) os neurônios multidendritic classe IV, distribuídos ao longo do corpo larval e 3) sensores de luz azuis intrínsecas relógio expressando Cry. Contribuição dos caminhos de luz sensores distintos para o comportamento visual pode ser abordado pelo teste de preferência aqui descrito. Diferentes fontes de iluminação e comprimentos de onda, com intensidades específicos podem ser usados para testar diferentes qualidades de luz. Esta possibilidade pode depender de detalhes sobre a sensibilidade de elementos individuais do sistema de detecção de luz de umd tais como entradas de luz são processados. Para uma experimentação mais detalhada em relação à estimulação de luz, o ensaio pode ser facilmente modificado para testar diferentes qualidades de luz. Aumentando e diminuindo intensidades de luz, bem como testar diferentes comprimentos de onda de luz é possível usando lâmpadas LED self-made com comprimentos de onda específicos (muitas possibilidades estão disponíveis no mercado). O controle de tais lâmpadas com fontes de alimentação oferece uma boa gama de intensidades. Estas possibilidades para manipular qualidades de luz fornecer uma ampla gama de variáveis a serem testadas com o teste de preferência light.
Além disso, larvas de Drosophila são capazes de associar a punição ou recompensa com luz ou trevas, modificando seu photobehavior nativo 15. Para isso, uma adaptação do protocolo descrito foi empregue mostrando a versatilidade do ensaio. Em resumo, o teste de preferência luz-escuro é um instrumento valioso contribuir com uma melhor compreensão da rápidae comportamentos circadianos derivados de estímulos luminosos, e que os elementos do sistema sensível à luz e ao relógio circadiano da larva de Drosophila estão envolvidos neste processo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos colegas do Departamento de Biologia, Universidade de Fribourg para discussões proveitosas. Agradecemos ao Bloomington Banco Central para fornecer estoques de voar. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Swiss National Science Foundation (PP00P3_123339) ea Fundação Velux para SGS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
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