Summary
Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.
Abstract
L'uso di cardiomiociti primari (CMS) in cultura ha fornito un potente complemento modelli murini di malattie cardiache nelle avanzare la nostra comprensione di malattie cardiache. In particolare, la capacità di studiare l'omeostasi di ioni, la funzione del canale ionico, eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione e loro alterazioni in condizioni malate e da mutazioni patogenetiche hanno portato a intuizioni significative sulle malattie cardiache. Inoltre, la mancanza di una linea cellulare adeguata immortalato per imitare adulti CM, e le limitazioni della neonatale CM (che mancano molti dei biomeccanica caratteristica strutturale e funzionale degli adulti CMS) in coltura hanno ostacolato la nostra comprensione della complessa interazione tra le vie di segnalazione, canali ionici e le proprietà contrattili del cuore adulto rafforzare l'importanza di studiare adulte isolate cardiomiociti. Qui vi presentiamo i metodi per l'isolamento, la cultura, la manipolazione dell'espressione genica da adenovirus-espresproteine ssed, e la successiva analisi funzionale dei cardiomiociti dal topo adulto. L'uso di queste tecniche vi aiuterà a sviluppare la comprensione meccanicistica in vie di segnalazione che regolano l'eccitabilità cellulare, Ca 2 + dinamiche e contrattilità e di fornire una caratterizzazione molto più fisiologicamente rilevanti di malattie cardiovascolari.
Introduction
Modelli murini di malattie cardiovascolari sono serviti come strumenti efficaci per chiarire i meccanismi fondamentali di malattia 1,2 e per identificare potenziali obiettivi terapeutici 1,3. In particolare, l'utilizzo di entrambi i modelli murini di malattia cardiaca acquisita (per esempio pressione sovraccarico) 4,5 e modelli di topi transgenici hanno avanzato la nostra comprensione di malattie cardiache 6-8. L'uso di tecniche di coltura cellulare per studiare cascate di segnalazione 3,9,10 e alterazioni in singole proteine che sono alla base eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore 11-13 a livello di singola cellula hanno integrato i modelli di topo in vivo. Tuttavia, la mancanza di linee cellulari adeguate che riflettono la struttura e la funzione adulto CM è una limitazione significativa. Gli investigatori hanno cercato di superare questo studiando singole proteine, come i canali ionici, in sistemi di espressione eterologhi
Primarie neonatali cardiomiociti di ratto ventricolari (NRVMs) sono relativamente facili da cultura, possono essere infettati con adenovirus e lentivirus per manipolare l'espressione genica 15, unnd sono stati quindi utilizzati con successo 1, ma hanno dei limiti dei loro propri. Anche se offrono un microambiente fisiologico 1 e sono stati il cavallo di battaglia del campo di segnalazione, le differenze sostanziali tra la morfologia e l'organizzazione subcellulare di NRVMs e cardiomyoctyes adulti li rendono un modello inadeguato per lo studio dei flussi ionici e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore adulto . In particolare NRVMs mancano di una t-tubolare sottosistema definitivo 4. Da Ca 2 + flusso e la dinamica sono criticamente dipendente matura t-tubulare e reticolo sarcoplasmatico (SR) Struttura 6, Ca 2 + dinamiche e gli studi funzionali della contrattilità cardiaca in NRVMs non sono una riflessione accurata di questi processi critici in cardiomiociti adulti. Inoltre, alcuni componenti di vie di segnalazione differiscono tra neonatale ed adulta topi 9, fornendo così un altro limite per lo studio dei processi di malattia e la loro iIMPATTO su eccitabilità cellulare e contrattilità in NRVMs. Infine, la distribuzione della macchina contrattile provoca l'accorciamento cella multidirezionali e non uniforme limitando la precisione delle misure contrattili.
L'uso di cardiomiociti isolati adulte fornisce quindi un più accurato sistema di modellazione in vitro. La straordinaria crescita della conoscenza resa possibile dalla manipolazione genetica di topi sottolinea l'importanza di ottenere cardiomiociti funzionali isolate da topi. Infatti, la caratterizzazione di CM adulte isolate da modelli murini ha fatto luce su molti eventi biologici e patologici. Isolato CMS da modelli di topi transgenici hanno permesso per studi del guadagno o la perdita della funzione delle proteine sulle proprietà contrattili delle singole cellule 2,16, e la vitalità in modelli di malattia come ischemia / riperfusione 17,18, integrando in tal modo le informazioni acquisite in Studi in vivo sultopi sé. L'uso di isolati adulto CMS da modelli murini di malattie cardiache acquisite 3,19,20 (come il sovraccarico trasversale aortica costrizione indotta pressione, che imita l'ipertensione o stenosi valvolare aortica) o l'esercizio 5,21 (per la modellazione di ipertrofia fisiologica) consente per l'esame dell'interazione di cascate di segnalazione implicati in questi processi con l'eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione a livello di singola cellula. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica usando l'espressione dei geni, guidato in adulto CMs ci offre l'opportunità di sezionare i componenti di vie di segnalazione complessi.
Dal punto di vista elettrofisiologico, tensione whole-cell e gli esperimenti clamp attuali isolato adulto CM sono stati critici nel chiarire la natura dei flussi ionici al basale e in vari stati di malattia. A causa della complessa struttura della membrana cellulare e la prote differenzialein strutture ponteggi tra adulti CM e NRVMs o linee cellulari eterologhi, la possibilità di patchare le cellule adulte fornisce una migliore rappresentazione degli effetti di alcune proteine di membrana, proteine strutturali, e che interagiscono partner di canale di ioni sui componenti elettrofisiologiche del cuore adulto.
Nonostante tali vantaggi importanti nello studio degli adulti cardiomiociti murini, isolamento e coltura di cardiomiociti topi adulti è stato impegnativo, sollecitando la necessità di una descrizione sistematica e accurata della metodologia per isolare cardiomiociti vitali mouse e al loro mantenimento in coltura per consentire un ulteriore manipolazione genetica utilizzando virale vettori. Precedenti studi hanno utilizzato sia acuto isolato topo adulto CMS o coltivate ratto adulto CM. Questi ultimi sono più facili da cultura di topo adulto CM, e la maggior parte degli esperimenti di manipolazione di espressione genica in vitro hanno usato ratto adulto CM. Pochi studi hanno modificato con successo e indagato functiespressione genica onale in topo adulto CM, presentando una grande limitazione nella portata di esperimenti. Pertanto, qui vi presentiamo in dettaglio tali metodologie, modificati dalle indagini precedenti, per l'isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infezione adenovirale 11-13,15, e analisi funzionale di cardiomyoctyes ventricolari topo adulto. Questo protocollo isolamento risultati in Ca 2 +-tolleranti, cardiomiociti eccitabili che abbiamo successo in coltura per un massimo di 72 ore e transitoriamente trasfettate con adenovirus. La funzionalità di queste cellule isolate può essere valutata utilizzando il sistema di imaging MMSYS 14,24 e patch clamp, che sarà anche discusso.
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Protocol
1. Cardiomiociti Isolamento
Materiali (Figura 1)
Microdissecting forcipe
Pinze dei tessuti
Pinze emostatiche delicate
Pinza emostatica
Microdissecting, seghettati, pinze curve
Forbici operative, dritto
Forbici operative, curvo
15 ml provette Falcon (5)
60 millimetri capsula di Petri
Soluzione tampone fosfato (PBS)
Nylon Mesh - dimensione 400 micron pori
Piccolo imbuto
Cera rivestito, intrecciato di seta 4-0, 19 millimetri, 7-10 cm di lunghezza
Non ago-ipodermico, punta smussata, 24 G o commerciale animale-alimentazione ago (24 x 1, W/1-1/4)
Eparina sodica
Miscela di ketamina / xylazina
Pipette Pasteur
OptiVision dissezione Goggles
Sistema IonOptix MMSYS
Nota: se la coltura di cellule, vedere paragrafo 2 sulla coltura cellulare prima di iniziare questo protocollo.
Nota: Tutti i topi sono stati curati inun impianto di barriera e sacrificato secondo le norme approvate IACUC, le pratiche e le procedure.
Nota: Prima di iniziare la procedura, l'intero sistema deve essere preriscaldato per garantire che tutti gli elementi del sistema Langendorff (Figura 2A, Figura 3) vengono riscaldati a 37 ° C per consentire una corretta e completa attività collagenasi.
- Iniettare topi adulti (~ 12 settimane) con 150 unità USP eparina sodica nello spazio addominale.
- Anestetizzare con una iniezione di una miscela di ketamina / xilazina alla dose-dipendente peso (Tabella 1).
- 80:12 mg / kg di ketamina: ricetta xilazina: 2,6 ml ketamina (100 mg / ml) + 0,4 ml xilazina (100 mg / ml) + 37 ml di PBS. Finale: ketamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
- Fissare il mouse sedato al pad operativo, asportare il cuore, e mettere in un piatto di temperatura ambiente PBS o soluzione fisiologica 0,9% (Figura 1J). Physalina STUDI permette al cuore intatto a contrarre per una migliore estrusione di sangue nella camera e facile identificazione dell'aorta prima del punto 1.6. I topi sono stati controllati per assicurare che sono profondamente anestetizzati con perdita di arto posteriore punta pizzico reflex e il rallentamento della frequenza respiratoria prima della comparsa di toracotomia.
- Utilizzare OptiVision occhiali dissezione (Figura 1A) per identificare e denunciare l'aorta. Rimozione del tessuto intorno l'aorta, anche se lo fa facilitare la visualizzazione della nave, non è necessario per l'ottimizzazione dell'isolamento cella se la radice aortica è chiaramente visibile.
- Innescare la pompa con tampone di perfusione (Tabella 2). La temperatura dovrebbe essere tenuto a 37 ° C per la durata del procedimento utilizzando una controllata, circolanti bagnomaria (Figura 2D).
- Montare il cuore sul Apparato Langendorff (Figura 2A). Utilizzando due pinze micro-dissezione (Figure 1D-E), prime l'aorta intorno alla non-ipodermico, ago punta smussata (24 G) con tubo in silicone sulla punta distale. In alternativa, un animale-alimentazione ago commerciale (24 x 1, W/1-1/4) può essere utilizzato. Il tubo in silicone sulla ago 24 G o l'ago di alimentazione animale consentirà a garantire la sutura sopra la scanalatura. Posizionare l'aorta sull'ago come un calzino. (Figura 2C).
- Nota: È importante assicurarsi che l'estremità dell'ago riposa in aorta ascendente, idealmente nel distale della radice aortica alla anonima destra, ma che non si estende attraverso la valvola aortica nel ventricolo sinistro, in modo da gravemente limitare la capacità dei buffer di perfusione efficace attraverso il cuore attraverso le arterie coronarie.
- Fissare cuore all'ago legando una piccola lunghezza di seta sutura (lunga 7-10 cm) (Figura 1K) intorno alla parte superiore della aorta, assicurando che il legame è a livello dell'aorta ascendente, in basso a destra anonima artery, ma è sopra l'estremità dell'ago.
- Abbassare cuore verso l'interno del vetro conico (Figura 2B) per aiutare a mantenere una temperatura adatta.
- Profumato cuore con tampone di perfusione per 5 minuti ad una velocità di 1 ml / min e bloccare il deflusso camera di vetro per consentire il perfusato per raccogliere nel bicchiere conico e busta cuore. Lo schema per digerire il cuore è mostrato in Figura 3.
- A questo punto si dovrebbe vedere il volume dell'aumento cuore. Inoltre, il sangue nel tessuto cardiaco sarà sostituito da perfusato, provocando pallore tessuto.
- Rilasciare il morsetto uscita per drenare perfusato. Arrestare la pompa per spostare il tubo dal contenitore buffer di perfusione al contenitore buffer di enzima (figura 2E). Riavviare la pompa per iniziare a perfusione del cuore con tampone enzimatico (Tabella 2) a 1 ml / min. Bloccare nuovamente il deflusso per consentire il buffer enzima per la bustacuore.
- Qui, come l'enzima viene perfusione del cuore e digerire il tessuto connettivo, il cuore diventerà più pallido e l'integrità strutturale diminuirà.
- Per determinare quando tagliare i ventricoli del cuore digerita, sollevare il cuore fuori dal vetro conico, premere delicatamente il cuore con una pinza e raccogliere qualche goccia di perfusato in una piccola scatola di Petri e verificare se le celle singole sono in calo .
- Per il principiante è utile per collegare la linea di perfusione con un manometro. Quando il cuore è sempre digerito la pressione diminuirà rapidamente, come il tessuto connettivo non regge la resistenza. Il manometro è utile per il novizio anche per garantire che la posizione dell'ago sia sopra la valvola aortica e non nel ventricolo. Bassa pressione indica che l'ago è nella camera ventricolare e l'alta pressione ha indicato che l'ago tocca la valvola.
- Tagliare i ventricoli del cuore in un piattopieno di buffer di trasferimento (A) (Tabella 2) quando la pressione ventricolare inizia a diminuire drasticamente o quando si è in grado di vedere le singole cellule nel perfusato. Questo richiede di solito ~ 7-10 min.
- Sempre con pinze micro-dissezione (Figura 1C), tritate i ventricoli in piccoli pezzi a dissociarsi. Una digestione successo lascerà quasi nessun pezzi solidi di tessuto dopo la macinatura, con la maggior parte del tessuto divenire amorfo su dissociazione.
- Per dissociare ulteriormente il tessuto, pipetta la soluzione in / out utilizzando una pipetta Pasteur plastica (Figura 4) dal quale la punta era stata tagliata con un angolo ~ 45 °. Questa modifica serve per aumentare lo spazio diametrale interna della punta della pipetta diminuendo così la quantità di sollecitazione di taglio sulle cellule come il tessuto viene triturato.
- Prima di sezionare il tessuto con la pinza è possibile separare le singole camere e separatamente dissociare atriale, ventricolare sinistra o right cellule ventricolari.
- Fissare la maglia quadrata (Figura 1M) per un piccolo imbuto (Figura 1 litro) con fascette e collocare questo apparecchio filtrante in una provetta da 15 ml Falcon (Figura 1I).
- Usare la pipetta Pasteur modificato per rimuovere la soluzione di cellule dal piatto e filtrare la soluzione nel tubo Falcon.
- Lasciare le cellule vive di depositarsi sul fondo della provetta (sedimentazione delle cellule vive dovrebbe prendere 2-4 min).
- Aliquota 2,5 ml di ciascuna delle quattro soluzioni di calcio (Tabella 3) in 4 tubi 15ml falco separati.
- Nuovamente utilizzando una pipetta Pasteur norma, rimuovere accuratamente il pellet di cellule dal fondo della provetta e trasferire le cellule alla prima delle soluzioni calcio.
- Permettono alle cellule di depositarsi sul fondo della provetta e ripetere il punto 1.17 nelle successive soluzioni calcio finché le cellule sono in ultima soluzione.
- Non lasciate che le cellule stabilirsi nel Fourth soluzione di calcio. Tappare la provetta e girarlo su un fianco.
2. Cell Culture
- Prima l'isolamento, piastra 1 ug / ml laminina topo naturale su vetrini coprioggetto e incubare per almeno 1 ora a 37 ° C e 2% di CO 2. Consentono anche la vostra placcatura e terreni di coltura (Tabella 4) per riscaldare in incubatrice a 37 ° C e il 2% di CO 2. Questo permette la CO 2 disciolto nei media per equilibrare.
- Non rimuovere la parte superiore da parte dei media. Basta svitare la parte superiore per evitare la contaminazione.
- Lasciare le cellule isolate a pellet sul fondo della provetta Falcon.
- Rimuovere il pellet usando una pipetta Pasteur plastica e risospendere serie nella quantità appropriata di placcatura media.
- Piastra le cellule sui vetrini laminina rivestite nel piatto di dimensioni adeguate e incubare a 37 ° C e 2% di CO 2 per almeno 30-60 minuti per consentire alle cellule di aderire alle lamelle.
- ** Se trasfezione con adenovirus, diluire il virus in una quantità appropriata di terreni in piastra e sostituire il supporto placcatura nel piatto con il supporto contenente il virus. Sia il virus incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C e 2% di CO 2. **
- Rimuovere il supporto placcatura dal piatto e sostituirlo con la cultura dei media.
- Cambiare con cura il terreno di coltura di ogni giorno in modo da non disturbare le cellule sui vetrini.
Utilizzando questa procedura, le cellule sono state coltivate con successo per un massimo di 72 ore. Immagini di colture cellulari e GFP transfettate possono essere trovati in Figura 5.
3. MMSYS sistema
- Alimentare il sistema MMSYS garantire che la lampada ad arco viene iniziata prima.
- Collegare i tubi dalla pompa all'ingresso appropriato e prese della camera MMSYS (Figura 6).
- Prime sistema con tampone di calcio (B) (Tabella 2).
- Inserire un caopriately dimensioni coprioggetto di vetro nella camera e fissare (Figura 6E). La maggior parte dei MMSYS camere di utilizzare uno 22 millimetri o 25 millimetri coprioggetto quadrati. Consultare il manuale utente MMSYS per determinare il vetrino appropriato per la camera.
- Trasferire 500 microlitri della soluzione di cella a un piccolo tubo Eppendorf.
- Aggiungere 0,5 microlitri Fura2-AM (soluzione stock di 1 mg / mL) per il tubetto di cellule e permettere loro di incubare al buio a temperatura ambiente per 5-7 min. Questo permette al Fura2-AM per "caricare" in cellule attraverso rapida diffusione passiva attraverso la membrana cellulare.
- Lasciare che i Fura-2 celle caricate pellet al fondo della provetta, e lavare l'eccesso Fura con 500 microlitri di tampone di calcio B.
- Spegnere le luci della stanza.
- Usando una pipetta Pasteur norma, cadere 1-2 gocce (a seconda della concentrazione cellulare) della soluzione di cellule "caricato" nel centro della camera (figura 6C) e permettere alle cellule To stabilirsi sul vetrino per 5 min.
- La densità delle cellule nella camera deve essere tale che le cellule non sovrapposte singoli possono essere visualizzati facilmente nella piattaforma di acquisizione dati MMSYS.
- Cominciare con attenzione a fluire buffer di calcio (B) attraverso la camera.
- Aumentare la temperatura della camera a 37 ° C.
- IMPORTANTE: Non accendere l'apparecchio di riscaldamento fino a quando è stato avviato il flusso. Questo può danneggiare gravemente il thermocoupler risposte (Figura 6A).
- Assicurarsi che la camera è collegata al MyoPacer tramite i fili di collegamento (Figura 6B) e cominciare a camminare le cellule 5 Hz a 1,5 volte la soglia di stimolazione per le cellule.
- Scegliere una cella che si batte alla frequenza corretta e spostarlo nell'apertura inquadratura.
- Regolare la telecamera e riformulare Dimensioni dell'apertura in modo che l'intera cella è al centro della finestra, diretto orizzontalmente, con la sarcomeri apgenitore.
- Per regolare la lunghezza della cella rosso e verde (destra e sinistra) indicatori fotodiodi al bordo della cella. Regolare il contrasto per ottimizzare il contrasto nero / bianco ai bordi della cella. Consultare il manuale Ionoptix per ulteriori dettagli.
- Porre il recipiente in una zona della cella contenente sarcomeri ben definiti e regolare il fuoco per ottimizzare il picco dello spettro di potenza (rosso). Inoltre la regolazione della luminosità del microscopio per ottimizzare la finestra smoothing blu e informazioni contrasto nero.
- Regolare le barre di soglia verdi per catturare la maggior quantità di spettro di potenza rosso (di picco) e come sfondo poco possibile.
- Iniziare la registrazione.
- Dopo abbastanza dati sono stati registrati, fare clic su "Pausa" per interrompere temporaneamente la registrazione e, assicurando che né il fuoco, né le dimensioni della finestra di visualizzazione sono alterati, spostare tappa del microscopio ad una zona del vetrino in cui non cellule o materiale cellulare può essere visto. Length della registrazione varia a seconda del protocollo sperimentale del ricercatore.
- Nota: Facendo clic su "Stop" terminerà la registrazione e senza sfondo sarà in grado di essere registrato per quella cella.
- Fare clic su "Continua" per registrare una misurazione del fondo.
- Dopo abbastanza bassa è stata registrata fare clic su "Stop" per terminare la registrazione.
- Fare clic su "File >> Salva" per salvare tutte le tracce di quella cella in un unico file ZPT..
- Ripetere i passaggi 3,12-3,20 finché non sono stati registrati sufficiente di cellule.
- Consultare il manuale d'uso IonOptix-MMSYS 12 per le istruzioni per l'analisi dei dati registrati. Dati caratteristici registrati di tipo selvaggio cardiomiociti sono mostrati nella Figura 7.
4. Patch Clamp
Patch di serraggio dei diversi tipi cellulari sono stati ben descritto in precedenza in questa rivista 25-28. Abbiamo quindi concentriamo su qualche criticoparametri di AL per il successo di serraggio pezzo di cardiomiociti adulti isolate utilizzando il nostro protocollo descritto.
- Utilizzando un estrattore pipetta e vetro borosilicato (con filamento: OD 1,5 mm ID 0,86 millimetri - 10 cm di lunghezza), tirare una pipetta che esibisce ~ 2.0-3.0 mW quando è riempita con una soluzione di pipetta (Tabella 5).
- Fuoco lucidare la punta della pipetta delicatamente con un Narishige o altro incendio lucidatrice verticale. La resistenza della pipetta cerotto deve essere di 2-4 MO dopo lucidatura fuoco.
- Accendere il computer, amplificatore (Axopatch 200B), convertitore AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) e Micromanipulator (MP-285). Per tutto il serraggio delle patch cella, iniziamo con parametri standard come precedentemente descritto.
- Per colta adulto CM, rimuoverli dal termostato e lavare delicatamente il vetrino sul quale CMS sono placcati con PBS a temperatura ambiente.
- Rimuovere delicatamente il vetrino e collocarlo nella camera di perfusione al microscopio invertito (Nikon TE 2000).
- Assicurarsi che l'ingresso per il sistema di perfusione e di uscita (per aspirazione) sono appena sopra la superficie del vetrino.
- Inizia perfusione con soluzione extracellulare appropriato (Tabella 5).
- Per l'adulto appena dissociato CM, mettere un coprioggetto di collagene rivestito nel sistema di perfusione come sopra.
- Poiché le cellule saranno in soluzione, sostituire lentamente la soluzione con tampone extracellulare.
- Utilizzando la pipetta Pasteur modificato (Figura 4), delicatamente risospendere le cellule nel buffer extracellulare, prendere una aliquota e posizionarlo sul vetrino.
- Lasciate che le cellule attaccano per 10-15 minuti prima di iniziare la perfusione come in 4.4.
- Back-riempire tutta la pipetta di patch cella con tampone intra-cellulare utilizzando un Microfil (Mondo Strumenti di precisione, 28 G) ago. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella punta della pipetta, toccare delicatamente per consentire le bolle d'aria per galleggiare al surface della soluzione.
- Attaccare la pipetta di patch riempito alla pipetta titolare, assicurando che vi sia contatto tra il microelettrodo e la soluzione interna.
- Usiamo elettrodi di cloruro d'argento, ma prendiamo cura di 'chloriding' i fili d'argento almeno una volta alla settimana immergendo notte in candeggina.
- Abbassare delicatamente la pipetta nel bagno, in modo che l'elettrodo bagno è immerso in ogni momento della soluzione del bagno / extra-cellulare. Compensare eventuali potenziali di giunzione liquido in questo momento. Grandi potenzialità di giunzione può essere un segno di deterioramento cloruro di argento sugli elettrodi.
- Adulto sano cilindrico CM sono identificati al microscopio e centrato nel campo visivo. Come precedentemente descritto, una combinazione di movimento micromanipolatore e regolazione della messa a fuoco permette prossimità della pipetta di patch e la superficie del CM.
- Una volta che sono nello stesso piano focale, si usa una combinazione di visualezione della cellula e impulso di prova (disponibile in Axopatch 200B).
- Una volta che la resistenza della pipetta diminuisce a metà (suggerendo che la pipetta è in contatto con la superficie della cellula), e la cellula continua a guardare cilindrica, si stabilisce sigillo gigaohm usando aspirazione delicata.
- Per CMS, preferiamo aspirazione bocca per stabilire pressione negativa. Se un gigaseal si ottiene con successo, usiamo di nuovo aspirazione delicata bocca ritmica di 'rodaggio' alla cella di stabilire modalità intera zona cell.
- Potenzialità di riposo tipici di sana CM sono nell'ordine di -85 a -90 mV. Una volta ottenuto un gigaseal, misurare il potenziale di membrana a riposo con pinza corrente con I = 0 pA.
- Se il potenziale di membrana è depolarizzata questo può indicare una cellula danneggiata o una scarsa tenuta.
- Poiché il CMS sono grandi cellule con un sacco di superficie, particolare attenzione deve essere prestata al risarcimento di capacità, soprattutto wgallina rapidamente attivando correnti quali il canale del sodio deve essere studiato. Se un risarcimento adeguato di capacità non può essere ottenuto utilizzando il costruito nel impostazioni di compensazione sul generatore di impulsi, prepulses alla tensione sotto-soglia e la polarità opposta potrebbe dover essere applicata e la corrente risultante sottratto dal segnale registrato. Tale protocollo è facilmente programmabile in Axopatch.
- Una modalità tutta cerotto cella è stata stabilita, attendere 15 min per permettere equilibrazione e per garantire la stabilità del sigillo prima tensione all'inizio o protocolli pinza amperometrica. Usiamo protocolli standard che sono stati descritti in precedenza in questa e altre riviste e non sarà trattato.
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Representative Results
L'isolamento di adulti cardiomyoctyes risultati nelle cellule a forma di bastoncello, striati, e quiescenti (non spontaneamente battere) (Figura 5A). Le cellule morte guarderanno arrotondate e senza striature saranno presenti. Cellule quiescenti possono essere coltivate e trasfettate con adenovirus per manipolare l'espressione genica (figure 5B e 5C). Dopo 24 ore di coltura, la morfologia delle cellule vive non cambia, sono ancora Ca 2 +-tolerant, e possono essere stimolati da stimolazione del campo. Con la procedura proposta, una resa di cellule vitali 80-90% può essere raggiunto.
Per misurare la contrattilità della cella, il software di sistema MMSYS prende le informazioni di fase dal microscopio per segnalare sia le variazioni sarcomere o lunghezza di cella. Illustrato nella (Figura 7A) è una traccia rappresentante contrattilità tramite misurazione della lunghezza sarcomero di un tipo selvatico topo C57BL6. Per miociti di topo adulto sano daltopi sé, la lunghezza sarcomero base è ~ 1,7-1,9 micron. Il software di sistema MMSYS è in grado di misurare simultaneamente contrattilità e movimentazione calcio misurando il rapporto tra il limite alle forme non legate di colorante Fura2-AM calcio-attivato. Mentre le misure di rapporto possono variare leggermente tra le configurazioni, per le cellule sane, il rapporto è normalmente compresa fra 1,5-2,5 (Figura 7B). Se il sistema MMSYS è stato calibrato per il calcio, questo rapporto può essere tradotto in una misura assoluta della concentrazione di calcio intracellulare. Per analizzare i dati generati dai contrattilità e di calcio tracce, le tracce devono essere mediati per creare una traccia caratteristica per detta cella (Figure 7C e 7D). Tali tracce caratteristici vengono poi sottoposti ad un algoritmo di analisi dati monotransient dal software di sistema MMSYS che poi genera parametri per la funzione sistolica e diastolica. Ulteriori dettagli sono presenti nel Ionmanuale Optix.
Cardiomiociti topo adulto sono state oggetto di interi esperimenti patch clamp cella in cui il potenziale d'azione è stato registrato in modalità current clamp (Figura 8).
| Peso corporeo (g) | Ketamina / xylazina (ml) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
Tabella 1. Topo adulto di peso-dipendente ketamina / xylazina Dosaggio (80:12).
| Soluzione | Ricetta |
| Tyrode Buffer * (PH 7.4) | 1 L DDH 2 O 137 mM NaCl KCl 4 mM 1 mM MgCl HEPES 10 mM 0.33 mM NaH 2 PO 4 |
| Perfusione Buffer * (PH 7.4) | 500 ml Tyrode Buffer 10 mM D-(+)-Glucosio, minimo 5 Taurina mM 10 mM butanedione monoxime (BDM) |
| Enzyme Buffer * | 50 ml di perfusione Buffer 0.024 g Collagenase D (tipo IV) 0.018 g Collagenase B (tipo II) 0.003 g proteasi XIV da Streptomyces griseus |
| Trasferimento Buffer (A) | 45 ml di perfusione Buffer 5 ml di albumina sierica bovina (da 5 mg / ml di soluzione stock) |
| Calcio Buffer (B) | 1 L Tyrode Buffer 1.2 mM CaCl 5.5 mM D-(+)-Glucosio, minimo |
Tabella 2. Cardiomyocyte Adulto Isolamento Buffer ricette.
| [CaCl] | Trasferimento Buffer (A) | Calcio Buffer (B) |
| Ca 0,06 mm 2 + | 9.5 ml | 0,5 ml |
| 0.24 mM Ca 2 + | 8,0 ml | 2,0 ml |
| 0.60 mM Ca 2 + | 5.0 ml | 5.0 ml |
| Ca 1.20 mM 2 + | 0 ml | 10 ml |
Tabella 3.Calcium titolazione Solution ricette.
| Placcatura Media | Cultura Media |
|
|
Tabella 4. Placcatura e Media Cultura ricette.
| Pipetta Solution | Bath Solution |
|
|
Tabella 5. Patch Clamp Solutions (soluzioni indicate sono per la misura delle correnti di sodio).
Figura 1. .. Strumenti isolamento cardiomiociti adulti A) OptiVISOR vetro ottico di ingrandimento binoculare B) pinze dei tessuti, 5.5, denti 1x2 -. Roboz scientifico C) Moloney pinze - 4,5 in (11,5 cm) leggera curva, seghettata -. Roboz scientifico DE) Dumont # 3 Pinze, Dumostar, ugello di dimensioni 0,17 x 0,10 mm. F) Packer Mosquito Pinze 5 in Diritto Piso -. Roboz scientifici G) Micro dissezione forbici 4.5 in curva Sharp / Sharp -. Roboz Scientifico H) Micro dissezione forbici 3.5 in Diritto Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Scientific I) 15 ml tubo Falcon - Thermo ... - Covidien L) imbuto di plastica, 6,0 centimetri di diametro M) maglia Nylon - 400μm dimensione dei pori di seta intrecciata Wax rivestito 19 mm: J) 60 millimetri capsula di Petri contenente PBS K) Softsilk-Fisher Scientific..
Figura 2. Langendorff Apparecchiatura. A) L'intero sistema di perfusione Langendorff utilizzato per l'isolamento dei cardiomiociti adulti. B) Visualizzazione ingrandita della cava, conico imbuto di raccolta di vetro utilizzato per scaldare il cuore cannulato. C) Visualizzazione ingrandita della ago canula non-ipodermico. (Feedin riutilizzabileg aghi (24 G,, punta rotonda dritto, lungo 25 mm; Belle Scienza Strumenti Inc. articolo 18061-24). D) circolante bagnomaria E) Bagnomaria per l'incubazione di perfusione, di enzimi e di trasferimento buffer.
Figura 3. Uno schema dettagliato del sistema di perfusione.
Figura 4. Modificato pipetta Pasteur. La pipetta è stata modificata tagliando della punta con un angolo di circa 45 °. Questo consente una maggiore superficie e crea meno sforzo di taglio sulle cellule mentre vengono dissociate. L'inserto mostra una visione più ravvicinata della punta modificato.
Figura 5. Cardiomiociti in coltura e GFP transfettate. A) Appena isolat ED cardiomiociti adulti da un mouse C57BL6 di 12 settimane. Le frecce indicano le cellule morte o morenti. Queste cellule sono più arrotondata rispetto al sano, adulto a forma di bastoncino CM. B) cardiomyoctyes topo adulto GFP-transfettate dopo 24 ore di coltura. C) coltivate cardiomiociti di topo adulto dopo 24 ore. Inserto mostra maggiore ingrandimento di miociti in coltura.
Figura 6. . Sistema Camerale MMSYS frecce blu rappresentano il flusso del buffer di perfusione (Buffer B) A) Singolo, in linea soluzione di riscaldamento autonomo -... Warner Instrument Corporation B) Collegare i fili dalla camera di sistema MMSYS allo stimolatore campo MyoPacer C) Platinum elettrodi per stimolazione campo situato nel centro della camera. D) Scarico serbatoio. E) Sezione morsetti in posizione aperta.
Figura 7. Dati di sistema MMSYS rappresentativi registrate per tipo selvaggio C57BL6 topi ottenuti da Jackson Labs. A) le tracce contrattilità di base. MMSYS B) Rapporto di Ca 2 +-legato a Ca 2 +-non legato Fura2-AM registrato per generare tracce di calcio di base. Queste tracce corrispondono alle misure contrattilità in A). C) In media le tracce contrattilità di base elaborate dal software di sistema MMSYS in una caratteristica traccia contrattilità. D) traccia il calcio Caratteristica compilato dalle tracce di base in B). L'analisi delle tracce compositi consentirà ai ricercatori di generare parametri sostitutivi per la funzione sistolica e diastolica. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 8. Traccia di patch clamp che mostra il potenziale d'azione di una wild-type topo adulto cardiomiociti.
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Discussion
In questo rapporto, abbiamo descritto le tecniche necessarie per l'isolamento di successo e la cultura degli adulti CM dal cuore mouse. La nostra tecnica consente successivo studio della funzione CM e l'eccitabilità con i metodi sopra descritti. Il parametro critico per studiare la funzionalità di adulto CMS è la salute e la qualità della isolato CM. Come descritto sopra, le nostre tecniche consentono un elevato rendimento di cellule funzionali che sono suscettibili di manipolazione dell'espressione genica usando infezioni adenovirus / lentivirali in coltura, e analisi di eccitabilità cellulare e funzione contrattile.
Uno dei parametri più importanti per l'isolamento di funzionale topo adulto CMS è precisa e rapida incannulazione del cuore sull'ago non ipodermico. Cura deve essere garantito che l'aorta attaccata al ventricolo sinistro è sezionato ad una lunghezza sufficiente a consentire la più agevole e più rapida incannulazione del cuore. Quando cannulating tegli cuore, è anche essenziale che la punta dell'ago rimane in aorta ascendente e non si estende oltre la valvola aortica nel ventricolo sinistro per consentire perfusione efficace del tessuto attraverso le arterie coronarie. Il prossimo passo cruciale è garantire l'aorta al gambo dell'ago utilizzando una sutura seta. La sutura dovrebbe essere legato sulla aorta ascendente, in modo che il buffer di perfusione retrograda scorre nelle arterie coronarie e ventricolo sinistro cavità ma non fluisce antegradely attraverso l'estremità distale dell'aorta sezionato o grossi vasi.
Alcuni ricercatori trovano utile per impostare un indicatore di pressione per valutare la qualità del incannulazione e successiva perfusione dell'enzima. Quando si utilizza un manometro, la pressione iniziale ventricolare sinistra dovrebbe essere ~ 80-100 cm H 2 O, e dopo perfusione con l'enzima, la pressione diminuisce a ~ 40-50 cm H 2 O. Quando la pressione ventricolare raggiunge questo punto, èpiù probabile pronto per essere per essere tagliato dall'ago. Per garantire che i ventricoli sono ben digeriti, alcune gocce del flow-through possono essere raccolti da sotto il cuore in una capsula di Petri e controllati per vedere se sono presenti, cellule quiescenti in diretta.
Le risultanti cellule isolate di questa procedura si prestano bene a immunocitochimica. Essi possono essere fissati utilizzando metodi di fissaggio regolari 29 (cioè in formalina, paraformaldeide, metanolo ghiacciato o acetone), ma un più alto livello di permeabilizzazione rispetto è tipicamente utilizzato per cardiomyoctyes neonatali a volte è necessario per immagini proteine citosoliche o strutture proteiche (cioè alfa- actina sarcomerica, beta miosina). Infine, le cellule possono essere coltivate e successivamente infettati con adeno-o lentivirus per manipolare l'espressione genica, o utilizzati per analisi funzionali dell'apparato contrattile cellulare.
Cultura del topo adulto CM è stato a lungo descritto comeimpegnativo. Usando le tecniche descritte qui, possiamo ordinariamente coltura queste cellule fino a 72 ore, anche se il rendimento delle cellule funzionali diminuisce notevolmente dopo 36 ore. Quando coltivando le cellule, è imperativo che le cellule piastrate a 37 ° C in 2% di CO 2. Questo è diverso da neonatale CM, che preferiscono essere coltivate con il 10% di CO 2 per la prima 24 ore e poi passati al 5% di CO 2, o fibroblasti cardiaci neonatali, che preferiscono anche 5% di CO 2. La placcatura e di coltura può essere equilibrato in modo che il disciolto CO 2 è del 2%.
Le cellule vengono piastrate su vetrini laminina rivestite in modo che non si sollevano del vetro quando il supporto viene modificato. Tuttavia, i cardiomiociti non attribuiscono molto saldamente al vetro anche con il rivestimento laminina. E 'quindi molto importante che la cautela da adottare quando si modifica il terreno di coltura, utilizzando pipette sterili, e non un sistema di aspirazione a vuoto. Quando la cellulas sono placcati, possono essere trasfettate con adenovirus incubando il virus per non più di 2 ore. La tempistica dipende il titolo del virus e la proteina essendo over-espresso, quindi si consiglia di condurre esperimenti preliminari per determinare LD 50 ED 50 per il virus. Nella maggior parte dei casi, si usa un MOI di 20-100 per l'adenovirus. Una volta che le cellule sono state incubate con il virus, l'espressione del gene target (s) richiede tipicamente ~ 24-36 hr.
Cellule isolate che sono placcati su vetrini di dimensioni adatte per la camera di sistema MMSYS possono essere analizzati per contrattilità e movimentazione calcio usando il sistema di imaging MMSYS. Queste lamelle possono essere posizionati direttamente nella camera, e il mezzo di coltura può essere rimosso attivando il sistema di perfusione. Se le cellule non sono in coltura e sono stati utilizzati per l'analisi direttamente dopo l'isolamento, possono essere aggiunti direttamente alla camera una volta coprioggetto è stato collocato. Mentrenon è necessario pre-coat i coprioggetti con la laminina quando si analizzano le cellule appena isolate, nella nostra esperienza, laminina non aiutano le cellule meglio aderire al vetrino. Utilizzando un flusso lento per l'unità MMSYS assicura inoltre che le cellule rimangono attaccate al vetrino. Infine, l'ottica del microscopio, in particolare la lente obiettivo devono essere scrupolosamente pulite prima di ogni esperimento, per consentire la visualizzazione accurata dei sarcomeri necessari per la valutazione della contrattilità.
Il componente più importante del sistema MMSYS è l'unico riscaldatore di fluidi in-linea che riscalda il buffer di perfusione (B) come fluisce nella camera. L'elemento termogenico di questo apparecchio è stato progettato per scambiare calore con il passaggio del fluido attraverso trasferimento di calore convettivo, quindi se il flusso è assente, lo scambiatore si surriscalda e potrebbe danneggiare irreparabilmente il sistema. È pertanto indispensabile che il riscaldamento è acceso solo dopo la colata.
Altri metodi di analisi dell'apparato contrattile dei cardiomiociti adulti sono stati precedentemente descritti, compresi i metodi sofisticati utilizzando microscopia a forza atomica 30-32. Alcuni di questi metodi permettono più sofisticata misura della forza localizzata e proprietà come modulo di Young contrattile, che li rende più adatto per la misurazione di cellule di forma irregolare o cellule prive di sistemi sarcomeric chiaramente definiti, come CMs derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Queste tecniche possono essere altrettanto facilmente utilizzato su adulto isolato CM. Il vantaggio del sistema MMSYS è la relativa facilità di misurazione contrattilità e la capacità di misurare un gran numero di cellule in un breve periodo di tempo in celle con sarcomeri chiaramente definiti. Inoltre, i sistemi soft-edge e analisi sarcomere in grado di misurare la lunghezza della cella o la lunghezza tra sarcomeri permettono rispettivamente per due diverse (ma reuforico) i metodi per misurare la contrattilità. Il software di acquisizione dei dati in combinazione con l'avanzato software di analisi user-friendly rende questo sistema facile da imparare e da usare. Infine, la capacità di misurare simultaneamente dinamiche di calcio permette correlazione tra contrattilità e omeostasi del calcio, che non è fattibile con microscopia a forza atomica. Inoltre, poiché l'uscita di dati è una misura raziometrica di un colorante calcio-attivata (Fura2-AM), con la calibrazione corretta, possono essere raccolti misure assolute di concentrazioni di calcio interne.
La registrazione di successo di segnali del canale ionico di cardiomiociti adulti richiede le cellule siano in condizioni ottimali. Immediatamente dopo l'isolamento e la placcatura delle cellule che non sono aderenti e galleggia in soluzione, in questa fase non possono essere studiate. Nel giro di poche ore si aderiscono ad un coprioggetto rivestito, ed è a questo punto che essi possono essere studiati. Nella nostra esperienza l'applicazione di patch entro poche oreplaccatura ottiene il risultato ottimale, in attesa troppo a lungo negativamente colpisce le cellule. Come descritto sopra, testando il potenziale di membrana a riposo dopo aver stabilito un sigillo gigaohm e rottura nella cellula, come pure la capacità di creare una tenuta gigaohm stessa sono due parametri che riflettono come sano le cellule sono al momento del patch. Mentre è più facile di patch su cellule che non sono amministrazioni, questo non è un prerequisito, guarnizioni adeguate possono essere ottenuti su cellule battendo pure. I protocolli utilizzati a questo punto dipendono gli obiettivi dello studio patch di bloccaggio, utilizzando tecniche di clamp correnti, potenziali d'azione spontanei o indotti possono essere registrati. In alternativa, la tensione di serraggio può essere usato per studiare specifici canali ionici. Data la panoplia di canali nella membrana, tali registrazioni sono di solito eseguite in presenza di bloccanti del canale ionico. Tetrodotossina (TTX), nisoldipina, e cesio sono spesso utilizzati per bloccare i canali del sodio, calcio e potassio, rispettivamente, although una varietà di farmaci sono stati utilizzati, ed i dettagli del loro utilizzo sono stati pubblicati ampiamente. La maggior parte degli approcci coinvolgono sia le correnti di registrazione prima e dopo l'applicazione di bloccanti dei canali ionici e sottraendo le correnti, e / o bloccando i canali del fondo con i bloccanti del caso prima di registrare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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