Summary
L'article décrit une adaptation facile facile
Abstract
L'article décrit une adaptation facile facile modèle in vitro pour étudier la polarisation des macrophages. En présence de GM-CSF/M-CSF, les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse sont dirigés dans la différenciation monocytaire, suivie par la stimulation M1 ou M2. L'état d'activation peut être suivi par des changements dans les antigènes de surface cellulaire, l'expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire.
Introduction
Distinct de réponses inflammatoires classiques, les macrophages qui infiltrent les tissus manifestant souvent état d'activation polarisée qui joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions physiologiques des tissus de l'hôte 1-8. Lors de la stimulation, l'activation des macrophages peut être triée en classique (M1) et alternative (M2) activation 2, 4, 9. L'activation des macrophages M1 dépend de récepteurs Toll-like (TLR) et l'activation du facteur nucléaire kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), conduisant à la production de cytokines inflammatoires, comme le TNF-α et d'IL- 1β et de l'activation de la iNOS qui résulte en une production accrue d'espèces réactives de l'oxygène, comme l'oxyde de nitrure (N) 10, 11. En revanche, M2 recrues d'activation des macrophages PPARy, PPARÔ, ou l'IL-4 STAT6 voies, conduisant à l'activation alternatif, anti-inflammatoire (M2) qui est associée à la régulation positive des récepteurs mannose CD206, et arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
moelle macrophages dérivés d'os (BMDM) présentent un idéal modèle in vitro de comprendre les mécanismes qui contrôlent la polarisation des macrophages activés 15. Plus précisément, l'activation des macrophages M1 peut être induite par les lipopolysaccharides (LPS) stimulation, tandis que la polarisation des macrophages M2 peut être induite par l'IL-4 et / ou de l'IL-13. Moelle osseuse macrophages dérivés matures et les macrophages activés peuvent être identifiés grâce à l'analyse de cytométrie en flux pour l'expression des antigènes de surface, y compris CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 et CD86 9, 16, 17. En outre, des changements dans la production de cytokines et les voies de signalisation cellulaires associés à la polarisation des macrophages peuvent être mesurés par RT-PCR quantitative et Western blot, respectivement. En résumé, la moelle osseuse macrophages dérivés de souris peuvent servir de modèle pertinent pour étudier la polarisation des macrophages in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolement de cellules de moelle osseuse
- Isoler fémur et du tibia os 6-8 semaines vieilles souris, rincer les cheveux et découpées ensuite l'os.
- Utiliser une aiguille 21G et 10 ml seringue pour débusquer osseuse dans PBS froid +2% inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (FBS) (3-5 ml / souris).
- Passez osseuse à travers une aiguille 21G 4-6 fois de dissocier les cellules.
- Passez cellules à travers un tamis cellulaire um 70 pour enlever des amas de cellules, des os, des cheveux et d'autres cellules / tissus.
- Ajouter 3 volumes de solution de NH 4 Cl (0,8% solution de NH 4 Cl, Stemcell Technologie), et incuber sur de la glace pendant 10 min pour éliminer les globules rouges.
- Isoler les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot cellulaire dans du PBS froid +2% FBS (20-50 ml, en fonction de la quantité de cellules).
2. Formation BMDM à induction
- Remettre en suspension les cellules de moelle osseuse isolées dans un milieu de croissance BMDM (2x10 6 cellules / ml).
Un milieu de croissance BMDM:
Le milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM) + 10% de FBS + 15% filtré (0,2 um) L-929 cellules (ATCC, CCL-1) surnageant de culture (contenant des monocytes-colony stimulating factor, M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF.
Note: L-929 surnageant cellulaire contient M-CSF 18. Pour assurer l'activité effective de milieu conditionné, 5 X 10 5 L-929 cellules sont ensemencées dans des flacons T75 cm 2 pour 6-7 jours, le milieu conditionné est recueilli et passé à travers un filtre de 0,45 um avant utilisation. Portions moyennes peuvent être utilisées immédiatement ou stockées dans des -80 ° C pendant 1-2 mois.
- cellules de semences dans 6 ou 12 plaques de culture de tissus ainsi (selon le modèle expérimental) (Corning Costar).
- Changer le milieu de croissance BMDM frais le jour 3.
- Au jour 7, la formation de BMDM mature est évaluée par une analyse de cytométrie en fluxet fluorophore anticorps conjugués pour détecter les cellules exprimant CD11b et F4/80.
3. BMDM Activation polarisé
- Au jour 7, changer de milieu de stimulation douce: pour l'activation M1, utilisez IMDM contenant 10% de FBS et 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS avec 50 ng / ml IFN, par activation M2, utilisez IMDM contenant 10% de FBS avec 10 ng / ml d'IL-4 et / ou de 10 ng / ml d'IL-13.
- Recueillir BMDMs stimulées par les détachant du plat chaud en utilisant trypsine à 0,05%, suivi par le lavage des cellules deux fois avec du PBS contenant 10% de FBS.
Remarque: Pour retirer et remettre les macrophages matures après différenciation, solution de trypsine à 0,05% (contenant 0,48 mM EDTA, Invitrogen) ou 2-5 mM EDTA de Ca et Mg-PBS sans tampon ou équilibrée de Hank (HBSS) peut être utilisé. Lors de l'utilisation moyenne digestif contenant de la trypsine, les cellules sont traitées à 37 ° C pendant moins de 10 minutes pour éviter la perte de survisage protéines de due à une sur-digestion.
- Utiliser des anticorps pour détecter l'expression des antigènes de surface des cellules, y compris CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 à différents points dans le temps en utilisant des procédures de coloration de cytométrie de flux standard.
- Déterminer l'expression de gènes caractéristiques de macrophages activés M1 et M2 dont l'IL-1β, TNF-α et d'IL-6 (activation M1) ou de l'IL-10, IL-13, arginase1 et PPAR (activation M2) à l'aide qRT-PCR. Déterminer l'activation des voies de signalisation cellulaires impliqués dans l'activation des macrophages M1 ou M2 par analyse western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une description schématique de la procédure de génération BMDM est présentée (figure 1). Haute pureté des macrophages matures peut être observée le jour 7 quand ils représentent 95 à 99% de CD11b + + cellules F4/80 (Figure 2). Macrophages polarisés peuvent être examinés en utilisant des anticorps contre CD11b, F4/80, CD11c et CD206 suivie d'une analyse de cytométrie en flux. Comme le montre la figure 3, les macrophages M1 sont détectés comme CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellules (Q2), tandis que les macrophages M2 sont CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellules (Q4). L'état d'activation BMDM peut être confirmé par augmentation de la taille cellulaire (figure 4A, décalage à droite dans FSC-A) et l'augmentation de l'abondance des antigènes de surface CD69, CD80, CD86 ou sur les macrophages (Porte: CD11b + F4/80 +), comme illustré à la figure 4B. La production de cytokine, expression génique et cellulaire activation de la voie de signalisation dans les macrophages M1 ou M2 peuvent être évaluées en utilisant RT-PCR quantitative ou western blot. As montre la figure 5, arginase 1 (Arg1) et les niveaux de PPAR ont été augmentés dans les macrophages M2 à 10 ng / ml d'IL-4 stimulation, tandis que la production d'IL-1β et TNF ont été augmentés dans les macrophages (M1) stimulées avec 100 ng / ml de LPS , qui est accompagné par p65 activation (figure 6).
Figure 1. Programme pour l'isolement, la formation et la stimulation de BMDMs de souris. Procédures étape par étape sont décrits dans le texte. En bref, fémur et le tibia os sont prélevés 6-8 semaines souris et des cellules de la moelle osseuse débusqué en utilisant PBS additionné de 2% de FBS inactivé à la chaleur. Après les globules rouges sont lysées avec une solution NH4Cl, les cellules sont cultivées dans un milieu de croissance BMDM pendant 7 jours suivi d'une maturation et d'analyse pour la pureté de la population cellulaire. Pour l'analyse des macrophages po risation, les cellules ont été stimulées avec du LPS ou LPS + IFN pour M1, ou l'IL-4 et / ou IL-13 pour l'activation M2. Macrophages polarisés peuvent être évalués sur la base des changements dans la morphologie des cellules, la présentation des marqueurs de surface, la production de cytokines et cellules voie de signalisation activée.
Figure 2. analyse de cytométrie de flux de formation BMDM. (A) BMDMs ont d'abord été fermée sur FSC et SSC pour enlever les débris et conjugués. (B) BMDMs matures ont été définis comme CD11b + F4/80 + sous-populations (en haut à droite) avec la pureté affichée en pourcentage du population mère fermée sur FSC / SSC.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Figure 3. . analyse de polarisation des macrophages tissulaires des macrophages infiltrés sont définis comme CD11b + + cellules F4/80; macrophages M1 sont CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellules, tandis que les macrophages M2 sont CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellules.
Figure 4. l'analyse par activation des macrophages par cytométrie de flux. (A) Lors de l'activation, la taille des macrophages augmenter, comme en témoigne le passage de FSC-A de M1 ou de macrophages M2 à 24 h après stimulation par rapport à M0 (non traité) macrophages. (B) L'activation marqueurs de surface liées ont été analysés par cytométrie en flux après stimulation IL4 ou LPS. Les premiers répondants CD69 marqueurs a été évaluée à 5 ou 24 heures après la stimulation, CD80 et CD86 Markers ont été analysés à 48 h après la stimulation. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Alternative activation des macrophages. Des macrophages stimulés avec 10 ng / ml d'IL-4 pendant 24 heures ont été recueillies et l'ARN total extrait. Arginase élevée 1 (Arg1) et PPAR expression a été détectée dans les macrophages M2 par rapport aux macrophages non traités à l'aide de l'analyse RT-PCR quantitative.
Figure 6. Classique activation des macrophages. (A) ARN total a été extrait à partir de macrophages stimulés avec 100 ng / ml LPS pendant 24 heures et utilisés dans les analyses RT-PCR quantitative. L'expression de cytokines pro-inflammatoires IL-1β, y compris et TNF a augmenté dans les macrophages M1. (B) Activation de la voie NFkB a été induite par LPS déterminée en utilisant des anticorps à p65 et p65 phosphorylée en analyses par Western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous rapportons ici une procédure simple et facilement adaptable in vitro pour induire l'activation des macrophages dérivés de cellules progénitrices de la moelle osseuse. Cette procédure peut être utilisée pour l'étude des mécanismes responsables de la polarisation des macrophages. La pureté des macrophages matures obtenus en utilisant ce protocole moyennes de 95 à 99%, et aucune procédure de purification supplémentaires sont nécessaires. Pour étudier la fonction des gènes spécifiques d'intérêt dans le contexte de polarisation des macrophages, l'expression ectopique ou knockdown spécifique d'un gène peut être réalisée suivant la transfection des cellules au jour 7. Ce protocole fournira également une fenêtre de culture de 7 jours pour étudier les effets de certains facteurs ou des gènes qui influent sur la formation, la maturation et le phénotype des macrophages.
Les macrophages activés affichent des profils moléculaires et cellulaires complexes avec une grande plasticité en réponse à divers stimuli 3, 9, 19. Pourexemple, le LPS provoque des réponses M1 pro-inflammatoires qui peut être encore améliorée en présence d'IFN ou facteur de nécrose tumorale (TNF) et de l'IL-4 et IL-13 à la fois stimuler l'activation M2, mais les profils d'activation ne se chevauchent pas complètement 3, 4, 9, 15, 19, 20. Les résultats présentés dans ce protocole ne représentent résultats typiques d'expériences avec la moelle osseuse macrophages dérivés analysés par cytométrie en flux, RT-PCR quantitative et Western blot. présentation de l'antigène de surface et les voies de signalisation cellulaire associée à l'activation des macrophages varient comme indiqué dans l'abondante littérature sur les macrophages polarisation 1-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (BGIA 7850037 pour Dr. Beiyan Zhou).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S.
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
