Summary
hemozoin의 상자성의 특성은 월말 단계를 분리하는 데 사용됩니다
Abstract
다른 Plasmodium 종과는 달리, P. falciparum은 그 연구 1 용이 실험실에서 배양 할 수 있습니다. 달성 parasitemia는 ≈ 40 % 한도에 도달 할 수 있지만, 탐정은 일반적으로 약 10 %로 비율을 유지합니다. 대부분의 경우 그것은 문화를 풍부하게하고 주어진 실험을 진행하기 위해 감염되지 않은 사람에서 기생충 함유 적혈구를 (적혈구), 분리 할 필요가 있습니다.
때 P. falciparum은 적혈구를 감염 기생충이 저하과 헤모글로빈 2, 3의 피드. 그러나 기생충은 매우 독성 철 함유 haem 잔기 4, 5를 처리해야합니다. 기생충은 haemozoin 6, 7이라는 불활성 크리스탈 폴리머에 haem를 변화함으로써 독성을 도망 간다. 이 철 함유 분자은 그 식품 액포에 저장하고 그 안에 금속이 haem 8 하나에서 다른 산화 상태를 가지고있다. haem의 철의 철 상태ozoin는 감염되지 않은 적혈구의 부재 상자성체의 속성에 수여. 침략 기생충이 성숙에 도달로서, haemozoin의 내용은 P.의 최신 단계에서 더욱 paramagnetism을 준다고하는 9 증가 적혈구 내부 falciparum.
이 상자성체의 속성, P.의 최신 단계에 따라 falciparum 감염 - 적혈구는 자기 구슬이 포함 된 열을 통해 문화를 전달하여 분리 할 수 있습니다. 을 포함하는 열 자석 홀더에 배치 할 때이 구슬은 자석이된다. 흐름을 통해이 포함하면서 paramagnetism로 인해 감염된 적혈구는 다음 대부분의, 감염되지 않은 적혈구 및 기생충들을 포함하는 초기 단계를 들어, 열 안에 갇혀 될 것입니다.
여기, 우리는 좋은 기생충의 생존 능력 (10) 유지 자성 열과 후반 단계 기생충의 인구를 풍부하게 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.이 절차를 수행 한 후 무소속의 문화가 남아있는 기생충은 성장을 계속 할 수 있도록 보육에 반환 할 수 있습니다.
Protocol
프로토콜의 모든 단계는 centrifugations을 제외하고, 샘플 무균 유지하는 후드 안에 수행해야합니다.
1. P.의 하순 무대 절연 falciparum에 감염된 적혈구
기생충에 paramagnetism을 수여 hemozoin는, 속으로 일반적인 신진 대사이기 때문에 Plasmodium에 감염된 적혈구의 모든 후반 단계는이 방법으로 분리 할 수 있습니다. 전형적인 문화 2 ~ 4 %의 혈소판 (적색 혈액 세포의 부피 비율)와 1-8%의 parasitemia을 (감염된 비율이 포함되어 있지만, 문화에 높은 parasitemia (3-10%)은이 프로토콜보다 나은 수율을하는 것이 좋습니다 적혈구). Trager와 젠슨 (1)에 의해 설명 된대로 기생충을 배양 할 수 있습니다.
- 간단한 멀티 일부 설정은 모든 schizont 격리 절차를 조립해야합니다. 이를 위해 LS 열, 자기 MidiMACS 구분 기호와 Miltenyi BioTec에서 맥 MultiStand (그림 1
- 별도의 관 (전역 50 ML conicals 사용), RPMI 1640의 23.2 ML 및 작업 솔루션을 생성 할 7.5 % 나트륨 중탄산염의 750 μl를 섞는다. 폐기를위한 손에 추가 튜브를 가지고 흐름을 통해 수집 기생충 문화의.
- 를 평형에 열을 작업 솔루션의 3 ML를 추가하고 흐름을 통해 튜브에 폐기하십시오.
- P. 8 ML을 추가 컬럼에 falciparum 문화, 즉시 작업 솔루션의 마지막 부분으로 문화에 의해 열을 밖으로 밀어되었는지 확인하는, 수신 튜브는 언 바운드 문화의 복구를 시작하기 위해 수집 하나씩 교체됩니다. 이 더 문화를 diluting 방지 할 필요가 있습니다.
- 열을 통해 문화의 흐름이 중단되면, 컬럼의 나머지 적혈구을 밀어 작업 솔루션 1 ML을 추가.
- 단계를 세탁하면 : 열에 작업 솔루션의 또 다른 3 ML을 추가하고 다른 튜브에 흐름을 통해로 저장되는 문화를 diluting 방지하기 위해 '폐기'튜브에 흐르는 액체를 수집합니다.
- 용출 : 3 ML,이 칼럼을 통과 한 후, 스탠드에서 후자를 분리하고 15 ML 튜브의 상단에 배치.
- 다시 열을 작업 솔루션의 3 ML를 추가합니다. 이 단계는 칼럼의 구슬에 갇힌 늦게 무대 기생충에 감염된 적혈구를 elutes.
참고 :이 시점에서, 그리고 필요한 기생충의 양에 따라 원래의 문화의 parasitemia의 한계를 분명히 대상이 컬렉션의 또 다른 라운드 / s를, 시작합니다. 흐름이 정상 상태를 유지로 열이 오랫동안로 활용할 수 있습니다.
- 수집 된 기생충의 농도 : 실온에서 150 XG에서 5 분의 eluate를 포함하는 15 ML 튜브를 원심 분리기parasitized 적혈구에서 어두운 펠렛을 형성합니다.
- 아주 작은 샘플을 가지고 (아래 2 단계 참조) 현미경을 통해 농도와 총 생산량을 결정하기 위해 충분한 액체두고 표면에 뜨는을 제거합니다.
- 늦은 무대 기생충의 절연 및 캡처가 만족스럽게 수행하는 경우이 순간에, 신선한 미디어로 다시 수집 문화를 품다.
- 후속 실험에 필요한 볼륨 및 솔루션에 수집 된 기생충을 희석.
2. 순도 및 항복 분석
- hemocytometer를 사용하여, 가벼운 현미경으로 계산하여 얻은 기생충의 농도를 확인합니다. 계산하려면, hemocytometer의 커버 슬립에서 수집 된 기생충과 미디어의 혼합의 10 μl를 추가합니다. hemocytometer의 네 당장 자리에 기생충의 수를 세어, 4로 총 수를 나눕니다. 감염된 전자의 농도를 얻기 위해 10 4에 의해 그 수를 모두 곱하면ML 당 rythrocytes.
주 : 믹스의) 농도가 더 많거나 적은 매체를 추가하여 펠렛을 resuspending의 순간에 사용자가 결정합니다. 제안 작업 농도는 μl 당 5.5 X 10 4 schizontes (이 일반적으로 수집 된 기생충에 100-300 μl를 추가하여 달성된다)입니다. 이 농도의 20 μl가 미디어와 적혈구, 전형적인 4 %의 혈소판 문화의 약 1 %의 parasitemia 100 μl 믹스의 최종 볼륨에 추가되어있는 경우 얻을 수 있습니다. b)는 hemocytometer에 따라 계산은 적혈구가 챔버 내부의 샘플 건조로 lysing 시작부터 빨리 할 수 있습니다. 대부분의해야 감염된 적혈구는 비 감염된 사람에서 그들을 차별화 어두운 장소 내부를 표시합니다.
- 얇은 층 Giemsa은 10 % 메탄올에 매우 빠르게 슬라이드를 고정을 건조하고, t을 immersing하여 컬렉션의 순결을 평가하기 위해 얼룩을 수행Giemsa의 20 % 솔루션 자락은 증류수로 희석 청바지. 그들이 공기에 의해 건조하고 현미경으로 검사 할 수있는 후 10 분, 대한 슬라이드를 청바지. 잘 70% 위 parasitemia이 달성해야합니다.
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Representative Results
그림 2에서, 자기 열을 통과 문화는 전에 표시됩니다 (A)와 절차 후 (B). 화살표가 그림 2A에 감염된 적혈구를 가리키는과 그림 2에 도시 된 바와 같이 하나 두 감염된 적혈구는 보통 100X 배율 필드를 볼 수 있습니다. 전형적인 프로 시저에서 5 % parasitemia (그림 2A)에서 문화로 시작,이 절차의 성능은 일반적으로 97% -100 % (그림 2B)의 parasitemia으로 적혈구를 생성합니다. 20X의 순서에 parasitemia의 농축은 쉽게 달성하고, 칼럼을 통해 문화의 여러 패스 P.의 높은 수율을 달성 할 수 있습니다 falciparum 말기에 감염된 적혈구, 필요에 따라 또는 원하는.
1 그림.
그림 2. A) 일반적으로 5 % 농축하기 전에 기생충 내용을 동기화되지 않은. 이 자기 절차를 통해 수집 된 기생충 A 1 μl 샘플 Giemsa 물들과 100X 배율에서 볼되었습니다. 1 ~ 3 감염된 적혈구는 보통 범위의 특정 필드 (화살표로 표시) 농축 한 후. B) 기생충 콘텐츠에 볼 수 있습니다. 이 자기 절차를 통해 수집 된 기생충 A 1 μl 샘플 Giemsa 물들과 100X 배율에서 볼 수 있습니다. Parasitemia 지금 99%입니다.
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Discussion
말라리아 기생충 P.의 체외 문화에 falciparum 더 문화의 높은 확산 지점에 감염되지 않은 적혈구의 절반 이상으로 제한된 parasitemia을 나타냅니다. 대부분의 연구 실험을 위해, 감염된 적혈구으로 만 작동하는 것이 바람직하다. 이를 위해 분리 기술은 감염에 따라 문화를 분할 할 필요가 있습니다. 유용한 방법은 감염되지 않은 적혈구 11 두 그룹의 서로 다른 밀도를 이용 차동 centrifugations의 변화 일련의 permeabilize하고 lyze하는 streptolysin O의 사용을 포함합니다. 이러한 방법 중 일부는 젤라틴 부양 12 Plasmion 13을 사용하지만, 다른 적혈구를 추적하기는 다양한 밀도의 레이어를 기생충 14 일부 독성을 제시 할 수 밀도 기울기 매체 Percoll,되어 작성하는 데 사용되는 가장 일반적인 물질이 포함되어 있습니다.
우리 헥타르VE 첫번째 폴에 의해 설명 및 추가 haemozoin, 기생충에 의한 헤모글로빈의 소화에 의해 생성 불활성 크리스탈의 상자성의 속성을 기반으로 Trang 15, 16,에 의해 분석 기법을 사용했습니다. 우리의 그룹에 의해 다른 곳으로보고,이 방법은 비 침습적이며, 같은 후 치료 신선한 적혈구의 침략 기능은 같은 Percoll에 의해 강화의 대상이 기생충의 공격 속도에 비해 정상으로 표시 기생충에 영향을 미치지하지 않는 것 기울기 원심 분리 10, 14, 17. 문화가 감염된 적혈구의 높은 숫자가있는 경우 열의 바인딩 용량이 한 번에 모든 기생충 콘텐츠를 저장하는 것만으로는 충분하지 될 수 있기 때문에이 혜택뿐만 아니라, 하나 이상의 수집 단계가 될 수 있습니다. 충분한 기생충이 주어진 이후의 실험을 위해 수집 될 때까지 따라서 수집 된 문화 칼럼을 통해 여러 번 통과 할 수 있습니다.
P.의 수집 falciparum 파라자기 구슬의 사용과 사이트는 빠르고, 간단하고, 크고 비용이 많이 드는 바닥 원심 분리기가 필요하고 또한 샘플 세심한 취급을 필요로하는 차동 원심 분리 기술과는 달리 만 benchtop 원심 분리기가 필요합니다.
문화 농축의 일부 응용 프로그램은 시작 parasitemia가 엄격하게 모든 샘플에서 제어됩니다 침공 assays에있는 기생충의 사용이다; 수집 된 기생충의 사용은 hemozoin, Plasmodium 가족에 공통적으로 불활성 크리스탈을 추출, 높은 밀도의 사용 기생충의 현미경 분석에 대비하기 위해, 그리고 다른 혈액 세포와 혼합하는 경우에만 기생충의 DNA의 추출. 마지막 응용 프로그램이 유전자들은에 감염된 말라리아의 변형을 식별하고 정보를 치료 계획을 만들기 위해 임상 샘플을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은이 자금을 지원 한 보조금 PRB-009 CS와 Secretaría Nacional 드 Ciencia Y Tecnología (SENACYT), 파나마에서 LC에 박사 장학금합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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