Summary
את המאפיינים של פאראמגנטיים hemozoin משמשים כדי לבודד שלבים מאוחרים של
Abstract
בניגוד למינים אחרים Plasmodium, פ falciparum יכול להיות מתורבת במעבדה, המאפשרת המחקר שלה 1. בעוד parasitemia הושג יכול להגיע לגבול ≈ 40%, החוקר בדרך כלל שומר על אחוז בסביבות 10%. במקרים רבים יש צורך לבודד את תאי טפיל המכילים דם האדומים (RBCs) מאלה הנגועים, כדי להעשיר את התרבות ולהמשיך בניסוי נתון.
כאשר פ falciparum מדביק הכדורי האדום, הטפיל מפרק ונזון מהמוגלובין 2, 3. עם זאת, הטפיל צריך לטפל במחצית רעילה מאוד המכיל ברזל haem 4, 5. הטפיל חומק רעילותו על ידי הפיכת haem לתוך פולימר אינרטי גביש קרא 6 haemozoin, 7. מולקולה המכיל ברזל זה מאוחסן בvacuole המזון והמתכת שביש מצב חמצונים שונים מהאחד בhaem 8. מצב הברזל של ברזל בhaemozoin מעניק לו רכוש פאראמגנטיים נעדר באריתרוציטים הנגועים. כטפיל הפולש מגיע לפדיון, תוכן haemozoin גם מגדיל 9, שמעניק עוד יותר paramagnetism בשלבים האחרונים של פ falciparum בתוך כדורי האדום.
בהתבסס על נכס זה פאראמגנטיים, בשלבים האחרונים של פ תאי דם אדומים נגועים falciparum יכולים להיות מופרדים על ידי עובר דרך תרבות עמודה המכילה חרוזים מגנטיים. חרוזים אלו הפכו מגנטיים כאשר העמודות שמכילות אותם מונחות על בעל מגנט. RBCs הנגוע, בשל paramagnetism, אז יהיה לכוד בתוך הטור, ואילו זרימה דרך יכיל, על פי רוב, אריתרוציטים נגועים ואלו שלבים מוקדמים של המכילים את הטפיל.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה להעשרת האוכלוסייה של טפילים בשלב מאוחר עם עמודות מגנטיות, אשר שומרת על יכולת קיום טפיל טובה 10.לאחר ביצוע הליך זה, התרבות הפנויה יכולה להיות מוחזרת לאינקובטור על מנת לאפשר לטפילים שנותרו להמשיך ולצמוח.
Protocol
כל הצעדים של הפרוטוקול, למעט centrifugations, צריכים להתבצע בתוך מכסה מנוע כדי לשמור על מדגם סטרילי.
1. בידוד שלב מאוחר של פ אריתרוציטים falciparum נגועים
כל השלבים המאוחרים של אריתרוציטים Plasmodium הנגועים ניתן להפריד במתודולוגיה זו, מאז hemozoin, שמעניק paramagnetism על הטפיל, הוא מטבוליט משותף לסוג. Parasitemia גבוה (3-10%) בתרבות שמומלץ להגיע תשואות טובות יותר עם פרוטוקול זה, למרות שתרבות טיפוסית תכיל 2-4% המטוקריט (אחוז הנפח של תאי דם אדומים) ו1-8% parasitemia (אחוז נגוע תאי דם אדומים). טפילים יכולים להיות מתורבתים כפי שתואר על ידי טרייגר וינסן 1.
- התקנה פשוטה, חלק רב צריכה להרכיב אותו על כל הליך בידוד schizont. לשם כך, עמודות LS, מפריד MidiMACS מגנטי וMultiStand MACS מMiltenyi BIOTEC (איור 1
- בצינור נפרד (שימוש 50 מ"ל conicals לאורך), לערבב 23.2 מ"ל של RPMI 1640 ו 750 μl של 7.5% סודיום ביקרבונט כדי ליצור את פתרון העבודה. יש צינורות נוספים על ידו עבור שלכת ואיסוף הזרימה דרך מהתרבות הטפילה.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת העבודה לעמודה לאזן אותו, והשלך את הזרימה דרך לתוך צינור.
- הוסף 8 מ"ל של פ falciparum התרבות לעמודה, ולוודא כי ברגע שהחלק האחרון של פתרון העבודה נדחקה אל מחוץ לטור על ידי התרבות, הצינור שקבל הוא הוחלף על ידי אחד האיסוף להתחיל התאוששות של התרבות לא המאוגדת. זה הכרחי כדי להימנע מדילול התרבות יותר מזה.
- לאחר הזרימה של התרבות דרך העמודה חדל, להוסיף 1 מ"ל של פתרון העבודה כדי לדחוף החוצה את RBCs הנותר של העמודה.
- כביסת צעד: הוסף עוד מ"ל 3 לפתרון העבודה לעמודה ואוסף את הנוזל זורם לתוך הצינור "נזרק" על מנת להימנע מדילול התרבות שנשמרה כזרימה דרך בצינור האחר.
- Elution: לאחר 3 המ"ל עבר דרך העמודה, לנתק את האחרון מהדוכן ולמקם אותו על גבי צינור מ"ל 15.
- שוב, להוסיף 3 מ"ל של תמיסת עבודה לעמודה. צעד זה elutes את אריתרוציטים נגועים בטפילים בשלב מאוחרים שהיו לכודים בחרוזים של העמודה.
הערה: בשלב זה, ובהתאם לכמות הטפילים הנדרשים, מתחיל סיבוב נוסף / ים של אוסף, כמובן בכפוף למגבלות של parasitemia בתרבות המקורית. העמודה ניתן לעשות שימוש חוזרת כל עוד הזרימה שומרת על מצב יציב.
- ריכוז של הטפילים שנאספו: צנטריפוגה שפופרת המכילה 15 המ"ל eluate למשך 5 דקות ב 150 XG בטמפרטורת חדרכדי ליצור גלולה כהה מאריתרוציטים parasitized.
- הסר את supernatant משאיר מספיק נוזלים לקחת דגימה קטנה מאוד ולקבוע את הריכוז ואת התשואה כוללת באמצעות מיקרוסקופיה (ראה שלב 2 להלן).
- ברגע זה, אם הבידוד ולכידתו של טפילים בשלב מאוחרים נעשה משביע רצון, דגירת התרבות נאספה שוב עם תקשורת טריה.
- לדלל את הטפילים שנאספו בהיקף והפתרון הנדרש לניסויים באים.
2. טוהר וניתוח תשואה
- ודא הריכוז של טפילים המתקבלים באמצעות hemocytometer וספירה תחת מיקרוסקופ אור. כדי לספור, להוסיף 10 μl של התמהיל של טפילים שנאספו והתקשורת תחת תלוש השער של hemocytometer. לספור את מספר הטפילים בארבעת הרביעים של hemocytometer ומחלק את המספר הכולל של 4. להכפיל מספר זה ב 10 4 לקבל הריכוז של דואר נגועrythrocytes למ"ל.
הערות: א) ריכוז של התמהיל שיוחלט על ידי המשתמש ברגע resuspending הגלולה, על ידי הוספה פחות או יותר בינוני. ריכוז עבודה הציעה הוא 5.5 X 10 4 schizontes לμl (זו מושגת בדרך כלל על ידי הוספת 100-300 μl לטפילים שנאספו). אם 20 μl ריכוז זה מתווסף לנפח סופי של תערובת μl 100 של תקשורת ואריתרוציטים, parasitemia של כ 1% ב4% המטוקריט תרבות טיפוסית יושג. ב) ספירה תחת hemocytometer צריך להיות מהיר, מאז אריתרוציטים להתחיל lysing עם התייבשות המדגם בתוך החדר. אריתרוציטים נגועים, אשר אמור להיות הרוב, יציגו בתוך כתם כהה, שמבדיל אותם מאלה שלא נדבקו.
- בצע Giemsa דק שכבת הכתם להעריך את הטוהר של האוסף על ידי תיקון את השקופיות בקצב מהיר מאוד במתנול 10%, מייבש אותם, וטבילה לאמכפלת בפתרון 20% מGiemsa כתם מדולל במים מזוקקים. להכתים את השקופיות עבור 10 דקות, לאחר שהם יכולים להיות מיובשים באוויר ונבדקים תחת המיקרוסקופ. Parasitemia הרבה מעל 70% צריך להיות בר השגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 2, התרבות עוברת דרך העמודה המגנטית מוצגת, לפני () ואחרי ההליך (B). אחת עד שניים אריתרוציטים נגועים בדרך כלל ראו בתחום הגדלת 100X כפי שמוצגים באיור 2, עם החצים המצביעים על אריתרוציטים הנגועים באיור 2A. בהליך טיפוסי, החל בתרבות בparasitemia 5% (איור 2 א), ביצוע נוהל זה בדרך כלל מייצר אריתרוציטים עם parasitemia של 97%% -100 (איור 2 ב '). העשרת parasitemia על סדר 20X היא השגה בקלות, וכמה העברות של התרבות דרך העמודה עשוי להשיג תשואה גבוהה של פ אריתרוציטים falciparum בשלב מאוחר נגועים, בהתאם לצורך או רצוי.
איור 1.
איור 2. ) 5% אופייניים אינם מסונכרנים תוכן טפיל לפני ההעשרה. מדגם μl 1 לטפילים נאספו באמצעות ההליך המגנטי הזה היה מוכתם Giemsa ונצפה בהגדלת 100X. אחד עד שלושה אריתרוציטים נגועים בדרך כלל ראו בכל. B) תוכן טפיל לאחר העשרת שדה נתון של היקף (מסומן בחיצים). מדגם 1 μl של הטפילים נאספו באמצעות ההליך המגנטי הזה מוכתם Giemsa ונצפה בהגדלת 100X. Parasitemia הוא כעת 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתרבויות מבחנה של המלריה הטפילה פ falciparum תערוכת parasitemia מוגבל, עם יותר ממחצית תאי הדם האדומים הנגועים בנקודה הגבוהה ביותר של התפשטות התרבות. עבור רוב ניסויי מחקר, רצוי לעבוד רק עם אריתרוציטים הנגועים. לשם כך, טכניקת הפרדה היא הכרחית כדי לחלק את התרבות בהתאם לזיהום. שיטות שימושיות כוללות שימוש בstreptolysin O ל permeabilize וlyze את RBCs הנגוע 11 וסדרה של וריאציות של centrifugations דיפרנציאלי אשר מנצלות את הצפיפות השונה של שתי קבוצות. חלק מהשיטות הללו כוללים הנפקת ג'לטין 12 ושימוש בPlasmion 13 אבל חומר הנפוץ ביותר המשמש ליצירת שכבות של צפיפויות שונות כדי ללכוד את תאי הדם האדומים הוא שונים Percoll צפיפות השיפוע הבינוני, שיכול להציג כמה רעילות לטפילים 14.
אנו חהיש להשתמש בטכניקה שתוארה לראשונה על ידי פול ונתח יותר על ידי 15 טראנג, 16, המבוסס על הקניין פאראמגנטיים של haemozoin, גביש אינרטי המיוצר על ידי העיכול של המוגלובין ידי הטפיל. כפי שדווח במקומות אחרים על ידי הקבוצה שלנו, שיטה זו אינה פולשני ולא נראה שתשפיע על הטפיל, כפי שעולה מנורמלי לאחר טיפול היכולת של פלישה לאריתרוציטים הטריים, בהשוואה לשיעורי הפלישה של טפילים הנתונים להעשרה על ידי Percoll שיפוע צנטריפוגה 10, 14, 17. בנוסף להטבה זו, אם התרבות יש מספר גבוה של אריתרוציטים הנגועים, לא יכול להיות צעד אוסף אחד או יותר, שכן יכולת הקשירה של הטור עשויה להיות לא מספיק כדי להחזיק את כל תוכן הטפיל בפעם אחת. לכן, התרבות שנאספה יכולה להיות מועברת דרך העמודה כמה פעמים עד שמספיק טפילים נאספים לניסוי בא נתון.
האוסף של פ falciparum סעיףאתרים עם השימוש בחרוזים מגנטיים הם פשוטים, מהיר, ודורשים רק צנטריפוגה benchtop, בניגוד לטכניקות השונות שצריכה צנטריפוגה צנטריפוגה רצפה גדולה והיקרה ושגם דורשות טיפול קפדני של הדגימות.
יישומים מסוימים של העשרת התרבות הם השימוש בטפילים במבחני פלישה בי parasitemia ההתחלה הוא נשלט בקפדנות בכל המדגמים; השימוש בטפילים שנאספו כדי לחלץ hemozoin, הגביש המשותף למשפחת Plasmodium אינרטי, השימוש בצפיפות גבוהה של טפילים להתכונן לניתוח מיקרוסקופי, והמיצוי של DNA של טפילים רק כשהם מעורבבים עם תאי דם אחרים. בקשה אחרונה זו יכולה לשמש כדי לנתח דגימות קליניות גנטי כדי לזהות את הזן של מלריה הם נגועים ולעשות תכנית טיפולית מושכלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק PRB-009 לCS ומלגת דוקטורט לLC, מSecretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), פנמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
