Summary
As propriedades paramagnéticas de hemozoin são utilizados para isolar as fases tardias da
Abstract
Ao contrário de outras espécies de Plasmodium, P. falciparum pode ser cultivado no laboratório, o que facilita o seu estudo 1. Enquanto a parasitemia obtida pode atingir o limite ≈ 40%, o investigador geralmente mantém a percentagem de cerca de 10%. Em muitos casos, é necessário isolar o parasita contendo glóbulos vermelhos (RBC) de os não infectados, para enriquecer a cultura e proceder com uma dada experiência.
Quando P. falciparum infecta o eritrócito, o parasita se degrada e se alimenta de hemoglobina 2, 3. No entanto, o parasita tem de lidar com uma porção heme muito tóxico contendo ferro 4, 5. O parasita escapa a sua toxicidade mediante a transformação do heme em um polímero de cristal inerte chamado haemozoin 6, 7. Esta molécula contendo ferro é armazenado no seu vacúolo alimentar e o metal em que tem um estado de oxidação diferente daquele do heme 8. O estado férrico em ferro no hemeozoin confere-lhe uma propriedade paramagnética ausente em eritrócitos não infectados. À medida que o parasita invasor atinge a maturidade, o conteúdo de haemozoin também aumenta 9, que confere paramagnetismo ainda mais sobre as últimas fases de P. falciparum no interior de eritrócitos.
Com base nesta propriedade paramagnético, os últimos estágios de P. As células infectadas falciparum-vermelhos do sangue podem ser separados pela passagem da cultura através de uma coluna contendo as esferas magnéticas. Estes grânulos tornar magnético quando as colunas que contêm eles são colocados sobre um suporte de íman. RBC infectados, devido à sua paramagnetismo, será então aprisionado no interior da coluna, enquanto que o fluxo através conterá, na sua maior parte, os eritrócitos não infectados e os estágios iniciais da contendo o parasita.
Aqui, descrevemos a metodologia para enriquecer a população de parasitas estágio final com colunas magnéticas, que mantém a viabilidade do parasita bom 10.Depois de executar este processo, a cultura não acoplada pode ser retornado para uma incubadora para permitir que as restantes parasitas que continue a crescer.
Protocol
Todos os passos do protocolo, excepto para centrifugações, deve ser realizada dentro de uma capa para manter a amostra estéril.
1. Isolamento fase tardia de P. falciparum eritrócitos infectados
Todos os estágios de Plasmodium eritrócitos infectados podem ser separados com esta metodologia, uma vez que hemozoin, que confere o paramagnetismo em que o parasita é um metabolito comum para o género. A parasitemia elevada (3-10%) em cultura é recomendado para obter melhores rendimentos com o presente protocolo, apesar de uma cultura típica irá conter 2-4% de hematócrito (percentagem de volume de células vermelhas do sangue) e 1-8% de parasitemia (percentagem de infectados células vermelhas do sangue). Parasitas podem ser cultivadas tal como descrito por Trager e Jansen 1.
- Um simples, configuração multi-parte deve ser montado por cada procedimento de isolamento esquizonte. Para isso, as colunas LS, um separador magnético e um MidiMACS MultiStand MACS da Miltenyi Biotec (Figura 1
- Num tubo separado (usar 50 ml ao longo cônicas), misturar com 23,2 ml de RPMI 1640 e 750 ul de bicarbonato de sódio a 7,5%, para criar a solução de trabalho. Têm tubos adicionais na mão para descarte e coleta o fluxo através da cultura parasita.
- Adicionar 3 ml da solução de trabalho para a coluna atinja o equilíbrio, e descartar o fluxo através de um tubo em.
- Adicionar 8 mL de P. falciparum cultura para a coluna, certificando-se de que, assim que a última parte da solução de trabalho foi empurrada para fora da coluna através da cultura, o tubo de recepção é substituído por um colector, para iniciar a recuperação da cultura não ligado. Isto é necessário para evitar a diluição da cultura ainda mais.
- Uma vez que o fluxo da cultura através da coluna cessou, adicionar 1 ml da solução de trabalho para empurrar os restantes glóbulos vermelhos para fora da coluna.
- Processo de lavagem: Adicione outro 3 ml da solução de trabalho para a coluna e recolher o líquido que flui para o "desfazer" tubo, a fim de evitar a diluição da cultura a ser guardado como fluxo através do outro tubo.
- Eluição: Uma vez que a 3 ml de ter passado através da coluna, retirar este último da base e colocá-lo em cima de um tubo de 15 ml.
- Novamente, adicionar 3 ml de solução de trabalho para a coluna. Este passo é eluída dos eritrócitos infectados com parasitas fase tardia que ficaram presos nas pérolas da coluna.
Nota: Neste ponto, e dependendo da quantidade de parasitas necessário, iniciar uma nova ronda / s de recolha, evidentemente dentro dos limites da parasitemia na cultura original. A coluna pode ser reutilizado, enquanto o fluxo mantém um estado de equilíbrio.
- A concentração dos parasitas recolhidos: Centrifugar o tubo de 15 ml contendo o eluído durante 5 minutos a 150 xg à temperatura ambientepara formar um sedimento escuro dos eritrócitos parasitados.
- Remover o sobrenadante deixando líquido suficiente para dar uma amostra muito pequena e determinar a concentração e rendimento total por meio de microscopia (Ver passo 2 abaixo).
- Neste momento, se o isolamento e a captura de parasitas estágio final é realizado de forma satisfatória, incubar a cultura recolhido de novo com meio fresco.
- Diluir os parasitas recolhidos do volume e da solução necessária para as experiências subsequentes.
2. Pureza e Rendimento Análise
- Verificar a concentração de parasitas obtidos utilizando um hemocitómetro e contagem sob um microscópio de luz. Para contar, adicionar 10 ul da mistura dos parasitas coletados e os meios de comunicação sob a lamínula do hemocitômetro. Contar o número de parasitas nos quatro quadrantes do hemocitômetro e dividir o número total por 4. Multiplicar esse número por 10 4 para se obter a concentração do e-infectadorythrocytes por ml.
Notas: a) A concentração da mistura será decidida pelo utilizador no momento da ressuspensão do sedimento, adicionando mais ou menos meio. A concentração sugerida de trabalho é de 5,5 x 10 4 schizontes por ul (isto é normalmente conseguido pela adição de 100-300 ul para os parasitas recolhidos). Se 20 uL desta concentração é adicionado a um volume final de 100 ul de mistura de meios de comunicação e os eritrócitos, uma parasitemia de cerca de 1% de uma cultura típica de 4% de hematócrito será obtida. b) A contagem em hemocitómetro o tem de ser rápido, uma vez que os eritrócitos iniciar a lise após a secagem da amostra no interior da câmara. Eritrócitos infectados, que devem ser a maioria, vai mostrar uma mancha escura no interior, o que os diferencia dos animais não infectados.
- Executar uma Giemsa camada fina mancha a avaliar a pureza da recolha, através da fixação das lâminas muito rapidamente em metanol a 10%, secagem, e imergindo tbainha de uma solução a 20% de corante de Giemsa diluído em água destilada. Coloração das lâminas durante 10 min, após o que podem ser secos por ar e examinadas ao microscópio. A parasitemia bem acima de 70% deve ser realizável.
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Representative Results
Na Figura 2, a cultura que passa através da coluna magnético é mostrado, antes (A) e após (B). Uma a duas eritrócitos infectados são geralmente vistos em um campo de ampliação de 100X, como mostrado na Figura 2, com as setas que apontam para eritrócitos infectados na Figura 2A. Num procedimento típico, a partir de uma cultura em 5% de parasitemia (Figura 2A), o desempenho deste procedimento normalmente produz eritrócitos com uma parasitemia de 97% a 100% (Figura 2B). Enriquecimento de parasitemia na ordem de 20X é facilmente realizável, e várias passagens da cultura através da coluna pode atingir um elevado rendimento de P. falciparum fase final de eritrócitos infectados, conforme necessário ou desejado.
Figura 1.
A Figura 2. A) 5% típica unsynchronized conteúdo parasita antes de enriquecimento. Uma amostra de 1 ul de os parasitas recolhidos através deste procedimento magnética foi corado Giemsa e visualizadas com uma ampliação de 100X. De um a três eritrócitos infectados são geralmente vistos em qualquer área de abrangência (marcado com setas). B) conteúdo Parasite após o enriquecimento. Uma amostra de 1 ul de os parasitas recolhidos através deste procedimento magnético é corado Giemsa e visualizadas com uma ampliação de 100X. A parasitemia é agora de 99%.
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Discussion
As culturas in vitro de parasita da malária P. falciparum exibem uma parasitemia limitada, com mais de metade das células vermelhas do sangue não infectados, no ponto mais elevado de proliferação de cultura. Para a maioria das experiências de investigação, é desejável para funcionar apenas com os eritrócitos infectados. Para este fim, uma técnica de separação é necessário dividir a cultura de acordo com a infecção. Métodos úteis incluem a utilização de estreptolisina para permeabilizar e lisar os glóbulos vermelhos não infectados 11 e uma série de variações de centrifugações diferenciais que se aproveitam da densidade diferente dos dois grupos. Alguns destes métodos incluem flotação de gelatina 12 e a utilização de Plasmion 13 mas a substância mais comum utilizado para criar camadas de densidades diferentes para prender as diferentes células de sangue vermelhas é a densidade de Percoll meio de gradiente, o qual pode apresentar alguma toxicidade para os 14 parasitas.
Estamos hausei uma técnica descrita pela primeira vez por Paul e posteriormente analisado por Trang 15, 16, com base na propriedade de haemozoin paramagnético, um cristal inerte produzido pela digestão da hemoglobina pelo parasita. Como relatado em outra parte do nosso grupo, este método é não-invasivo e não parecem afectar o parasita, tal como indicado pela normal após o tratamento, a capacidade de invasão dos eritrócitos frescos, em comparação com as taxas de invasão de parasitas sujeitos a enriquecimento por Percoll gradiente de centrifugação 10, 14, 17. Para além desta vantagem, se a cultura com um elevado número de eritrócitos infectados, não pode haver mais do que um passo de recolha, uma vez que a capacidade de ligação da coluna pode não ser suficiente para manter todo o conteúdo do parasita de uma só vez. Portanto, a cultura recolhidos podem ser passadas através da coluna, até várias vezes por parasitas suficientes sejam recolhidos para uma dada experiência subsequente.
A coleção de P. falciparum parágrafolocais com a utilização de esferas magnéticas é simples, rápido, e requer apenas uma centrífuga de bancada, ao contrário das técnicas de centrifugação diferencial que necessitam de um grande centrifugador chão e caro e que também requer um tratamento minucioso das amostras.
Algumas aplicações de cultura de enriquecimento são a utilização dos parasitas em ensaios de invasão em que a parasitemia de partida é rigorosamente controlados em todas as amostras, a utilização dos parasitas recolhidos para extrair hemozoin, o cristal inerte comum à família de Plasmodium, a utilização de uma elevada densidade de parasitas para se preparar para a análise de microscopia, e a extracção de DNA de parasitas apenas quando são misturadas com outras células sanguíneas. Esta última aplicação pode ser utilizado para a análise de amostras clínicas para identificar a estirpe geneticamente de malária que são infectadas com e fazer um plano terapêutico informado.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções PRB-009 para o CS e uma bolsa de doutorado à LC, do Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panamá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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