Summary
Les propriétés paramagnétiques de hémozoïne sont utilisés pour isoler les stades tardifs de la
Abstract
Contrairement aux autres espèces de Plasmodium, P. falciparum peuvent être cultivées en laboratoire, ce qui facilite son étude 1. Alors que la parasitémie atteint peut atteindre la limite ≈ 40%, le chercheur conserve généralement le pourcentage d'environ 10%. Dans de nombreux cas, il est nécessaire d'isoler les cellules du parasite contenant globules rouges (hématies) de ceux non infectés, afin d'enrichir la culture et de procéder à une expérience donnée.
Lorsque P. falciparum infecte les érythrocytes, le parasite se dégrade et se nourrit de l'hémoglobine 2, 3. Cependant, le parasite doit faire face à un groupement hème contenant du fer très toxique 4, 5. Le parasite échappe de sa toxicité en transformant l'hème en un polymère à cristaux inertes appelé hémozoïne 6, 7. Cette molécule contenant du fer est stocké dans sa vacuole alimentaire et le métal en elle possède un état d'oxydation différent de l'une à l'hème 8. L'état ferrique en fer de l'hèmeozoin lui confère une propriété paramagnétique absente dans les érythrocytes non infectés. Comme le parasite envahit atteint sa maturité, le contenu de hémozoïne augmente également 9, qui confère paramagnétisme encore plus sur les derniers stades de P. falciparum à l'intérieur du globule rouge.
Sur la base de cette propriété paramagnétique, les dernières étapes de P. falciparum cellules sanguines infectée-rouge peuvent être séparées par le passage de la culture à travers une colonne contenant des billes magnétiques. Ces billes se magnétique lorsque les colonnes les contenant sont placés sur un support d'aimant. Globules rouges infectés, en raison de leur paramagnétisme, sera alors coincé à l'intérieur de la colonne, tandis que le flux continu contiendra, pour la plupart, les érythrocytes non infectés et les stades précoces contenant du parasite.
Ici, nous décrivons la méthode d'enrichir la population de parasites stade avancé avec des colonnes magnétiques, ce qui maintient la viabilité du parasite bon 10.Après avoir effectué cette procédure, la culture libre peut être renvoyé dans un incubateur pour permettre aux parasites restants de continuer à croître.
Protocol
Toutes les étapes du protocole, à l'exception des centrifugations, doit être effectuée sous une hotte pour garder l'échantillon stérile.
1. Isolation Late Stage de P. érythrocytes infectés par P. falciparum
Tous les stades de Plasmodium érythrocytes infectés peuvent être séparés par cette méthode, car hémozoïne, qui confère paramagnétisme sur le parasite, est un métabolite commun au genre. Une parasitémie élevée (3-10%) dans la culture est recommandé d'obtenir de meilleurs rendements avec ce protocole, bien que d'une culture typique contiendra hématocrite 2-4% (pourcentage en volume de globules rouges) et la parasitémie 1-8% (pourcentage des personnes infectées globules rouges). Les parasites peuvent être cultivées comme décrit par Trager et Jansen 1.
- Une simple configuration multi-parties doivent être assemblées pour chaque procédure d'isolement schizonte. Pour cela, colonnes LS, un séparateur magnétique MidiMACS et un Multistand MACS de Miltenyi Biotec (figure 1
- Dans un tube séparé (utiliser 50 ml coniques, tout au long), mélanger 23,2 ml de RPMI 1640 et 750 pi de bicarbonate de sodium à 7,5% pour créer la solution de travail. Ont des tubes supplémentaires à la main pour écarter et à recueillir le produit d'écoulement de la culture de parasites.
- Ajouter 3 ml de la solution de travail à la colonne pour s'équilibrer, et jeter le accréditives dans un tube.
- Ajouter 8 ml de la p falciparum culture de la colonne, en veillant à ce que, dès que la dernière partie de la solution de travail a été poussé hors de la colonne par la culture, le tube de réception est remplacée par la collecte de commencer une reprise de la culture non lié. Cela est nécessaire pour éviter de diluer la culture plus loin.
- Une fois que le flux de la culture à travers la colonne a cessé, ajouter 1 ml de la solution de travail pour pousser les globules rouges restants de la colonne.
- Étape de lavage: 3 ml Ajouter une solution de travail à la colonne et recueillir le liquide qui s'écoule dans le "rejet" tube afin d'éviter la dilution de la culture est enregistrée en tant que flux continu dans l'autre tube.
- Elution: Une fois le 3 ml ont traversé la colonne, retirez celle-ci de son support et placez-le au-dessus d'un tube de 15 ml.
- Encore une fois, ajouter 3 ml de solution de travail à la colonne. Cette étape élue les érythrocytes infectés par des parasites stade avancé qui ont été pris au piège dans les perles de la colonne.
Remarque: À ce stade, et en fonction de la quantité de parasites nécessaire, démarrer un autre cycle / s de collecte, de toute évidence, dans les limites de la parasitémie dans la culture d'origine. La colonne peut être réutilisé à condition que l'écoulement maintient un état d'équilibre.
- La concentration des parasites collectés: Centrifuger le tube de 15 ml contenant l'éluat pendant 5 min à 150 xg à la température ambiantepour former un culot de sombre hématies parasitées.
- Eliminer le surnageant en laissant assez de liquide pour prendre un très petit échantillon et déterminer la concentration et le rendement total par microscopie (voir étape 2 ci-dessous).
- En ce moment, si l'isolement et la capture des parasites au stade fin est accompli de façon satisfaisante, incuber la culture recueilli à nouveau avec du milieu frais.
- Diluer les parasites recueillis dans le volume et la solution nécessaire pour les expériences ultérieures.
2. Pureté et analyse de rendement
- Vérifier la concentration de parasites obtenus en utilisant un hémocytomètre et compter au microscope optique. Pour compter, ajouter 10 ul du mélange des parasites collectés et les médias sous la lamelle de l'hémocytomètre. Comptez le nombre de parasites dans les quatre quadrants de la hémocytomètre et divisez le nombre total de 4. Multipliez ce nombre par 10 4 pour obtenir la concentration de l'e infectérythrocytes par ml.
Notes: a) La concentration du mélange sera décidé par l'utilisateur au moment de la remise en suspension du culot, en ajoutant plus ou moins à moyen terme. Une concentration de travail proposé est de 5,5 x 10 4 schizontes par ul (ce qui est généralement obtenu en ajoutant 100 à 300 ul aux parasites collectés). Si 20 ul de cette concentration est ajouté à un volume final de 100 ul mélange des médias et des érythrocytes, une parasitémie d'environ 1% dans une culture hématocrite 4% type sera obtenue. b) Comptage sous la hémocytomètre doit être rapide, puisque les érythrocytes commencer à lyser les échantillons sèche à l'intérieur de la chambre. Érythrocytes infectés, ce qui devrait être la majorité, affiche une tache sombre à l'intérieur, ce qui les différencie de ceux non infectés.
- Effectuer une Giemsa couche mince tache d'évaluer la pureté de la collection en fixant les lames très rapidement dans le méthanol 10%, à les sécher, et l'immersion de tourlet dans une solution à 20% de Giemsa dilué à l'eau distillée. Colorer les lames pendant 10 minutes, après quoi ils peuvent être séchés par l'air et examinés au microscope. Une parasitémie bien au-dessus de 70% devrait être réalisable.
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Representative Results
Dans la figure 2, la culture en passant par la colonne magnétique est montré, avant (A) et après la procédure (B). Une à deux érythrocytes infectés sont généralement vus sur un champ de grossissement 100X comme le montre la figure 2, les flèches pointant vers érythrocytes infectés dans la figure 2A. Dans une procédure typique, à commencer par une culture de la parasitémie 5% (figure 2A), la performance de cette procédure produit habituellement érythrocytes avec une parasitémie de -100% à 97% (figure 2B). Enrichissement de la parasitémie de l'ordre de 20X est facilement réalisable, et plusieurs passages de la culture à travers la colonne peut atteindre un rendement élevé de P. falciparum au stade avancé érythrocytes infectés, comme nécessaire ou souhaité.
Figure 1.
Figure 2. A) Typique 5% désynchronisé contenu parasite avant l'enrichissement. Un échantillon de 1 pl des parasites recueillies dans le cadre de cette procédure magnétique a été Giemsa colorés et à un grossissement de 100X vu. Un à trois érythrocytes infectés sont habituellement observées dans un domaine donné de la portée (indiquées par des flèches). B) contenu Parasite après enrichissement. Un échantillon de 1 pl des parasites recueillies dans le cadre de cette procédure magnétique est Giemsa colorés et à un grossissement de 100X vu. Parasitémie est maintenant de 99%.
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Discussion
Des cultures in vitro de la malaria parasite P. falciparum présentent une parasitémie limitée, avec plus de la moitié des globules rouges non infectés au point le plus élevé de prolifération de la culture. Pour la plupart des expériences de recherche, il est souhaitable de travailler uniquement avec les érythrocytes infectés. À cette fin, une technique de séparation est nécessaire de diviser la culture en fonction de l'infection. Méthodes utiles comprennent l'utilisation de streptolysine O pour perméabiliser et lyser les globules rouges non infectés 11 et une série de variations de centrifugations différentielles qui profitent de la différence de densité des deux groupes. Certaines de ces méthodes comprennent la gélatine flottation 12 et l'utilisation de Plasmion 13, mais la substance la plus couramment utilisée pour créer des couches de différentes densités pour piéger les différentes cellules rouges du sang est le moyen gradient de densité Percoll, ce qui peut présenter une certaine toxicité pour les 14 parasites.
Nous haavons utilisé une technique initialement décrite par Paul et analysées par Trang 15, 16, basée sur la propriété paramagnétique de hémozoïne, un cristal inerte produit par la digestion de l'hémoglobine par le parasite. Comme indiqué par ailleurs par notre groupe, cette méthode est non invasive et ne semble pas affecter le parasite, comme indiqué par la normale après traitement capacité de l'invasion des érythrocytes frais, par rapport aux taux d'invasion de parasites soumis à l'enrichissement par Percoll centrifugation de gradient 10, 14, 17. En plus de cet avantage, si la culture a un nombre élevé de globules rouges infectés, il ne peut y avoir plus d'une étape de collecte, car la capacité de liaison de la colonne peut ne pas être suffisante pour contenir tout le contenu du parasite à la fois. Par conséquent, la culture peut être collectée à travers la colonne à plusieurs reprises jusqu'à ce que suffisamment de parasites sont collectées pour une expérience donnée ultérieure.
La collection de P. falciparum parsites avec l'utilisation de billes magnétiques est simple, rapide, et ne nécessite qu'une centrifugeuse de paillasse, à la différence des techniques de centrifugation différentielles qui ont besoin d'une centrifugeuse étage grande et coûteuse et qui nécessite également une gestion minutieuse des échantillons.
Certaines applications de l'enrichissement culturel sont l'utilisation des parasites dans les essais d'invasion, où la parasitémie de départ est rigoureusement contrôlées dans tous les échantillons, l'utilisation des parasites collectés pour extraire hémozoïne, le cristal inerte commun à la famille Plasmodium, l'utilisation d'une haute densité des parasites à préparer pour l'analyse microscopique, et l'extraction de l'ADN de parasites seulement quand ils sont mélangés avec d'autres cellules du sang. Cette dernière application pourrait être utilisée pour analyser des échantillons cliniques afin d'identifier génétiquement la souche de paludisme elles sont infectées et faire un plan thérapeutique éclairé.
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Disclosures
Nous n'avons rien à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions PRB-009 à CS et une bourse de doctorat à LC, de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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