Summary
Die paramagnetischen Eigenschaften des Hämozoins werden verwendet, um späten Stadien der Isolierung
Abstract
Im Gegensatz zu anderen Plasmodium-Arten, P. falciparum kann im Labor, die ihre Studie 1 erleichtert kultiviert werden. Während die Parasitämie erreicht die ≈ 40%-Grenze erreichen kann, die Ermittler in der Regel hält der Anteil bei rund 10%. In vielen Fällen ist es notwendig, die Parasiten-haltigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) von den infizierten diejenigen, zu isolieren, um die Kultur zu bereichern und fahren Sie mit einem gegebenen Experiment.
Wenn P. falciparum infiziert den Erythrozyten, verschlechtert sich die Parasiten und speist von Hämoglobin 2, 3. Allerdings muss der Parasit mit einem sehr giftig eisenhaltigen Häm-Einheit 4, 5 umzugehen. Der Parasit entzieht seiner Toxizität durch die Umwandlung der Häm in einem inerten Kristall Polymer namens haemozoin 6, 7. Diese eisenhaltigen Molekül in seiner Nahrungsvakuole gespeichert und das Metall in sich hat einen oxidativen Zustand, der sich von dem in Häm 8 unterscheidet. Die Eisen-III von Eisen in der Häm-ozoin verleiht es eine paramagnetische Eigenschaft fehlt in infizierten Erythrozyten. Da die eindringenden Parasiten Reife erreicht, der Inhalt haemozoin erhöht auch 9, die noch Paramagnetismus schenkt den letzten Stadien von P. falciparum Inneren der Erythrozyten.
Basierend auf dieser paramagnetische Eigenschaft, die neuesten Stadien von P. falciparum infizierten Erythrozyten-Zellen können durch Passieren der Kultur über eine Säule mit magnetischen Kügelchen abgetrennt werden. Diese Perlen werden magnetisch, wenn die Spalten enthält sie auf einem Magnethalter gestellt werden. Infizierten Erythrozyten, die aufgrund ihrer Paramagnetismus, werden dann im Inneren der Säule eingefangen werden, während die Flow-Through enthält, zum größten Teil nicht infizierten Erythrozyten und solchen mit frühen Stadien des Parasiten.
Hier beschreiben wir die Methodik, um die Bevölkerung der späten Phase Parasiten mit magnetischen Säulen, die gute Parasiten Lebensfähigkeit 10 hält bereichern.Nach Durchführung dieses Verfahrens kann das ungebundene Kultur in einen Inkubator zurückgegeben werden, damit die verbleibenden Parasiten weiter wachsen.
Protocol
Alle Schritte des Protokolls, mit Ausnahme Zentrifugationen, sollte innerhalb einer Haube zu halten die Probe steril erfolgen.
Ein. Late Stage Isolierung von P. falciparum-infizierten Erythrozyten
Alle späten Stadien von Plasmodium-infizierten Erythrozyten kann mit dieser Methode getrennt werden, da Hemozoin, die Paramagnetismus überträgt der Parasit, ist eine gemeinsame Metabolit zur Gattung. Eine hohe Parasitämie (3-10%) in der Kultur wird empfohlen, bessere Ausbeuten bei diesem Protokoll zu erhalten, obwohl eine typische Kultur 2-4% Hämatokrit (Volumenprozentsatz von roten Blutkörperchen) und 1-8% Parasitämie (Prozentsatz der infizierten enthalten wird rote Blutzellen). Parasiten können kultiviert wie durch Trager und Jansen 1 beschrieben.
- Eine einfache, mehrteilige Installation muss für jeden Schizonten Verfahren zur Isolierung montiert werden. Dafür LS Säulen, ein Magnetic MidiMACS Separator und eine MACS MULTISTAND von Miltenyi Biotec (Abbildung 1
- In einem separaten Röhrchen (verwenden Sie 50 ml Schrägen überall), mischen 23,2 ml RPMI 1640 und 750 ul von 7,5% Natriumbicarbonat, um die Arbeit Lösung zu schaffen. Zusätzliche Röhren an Hand zum Verwerfen und Sammeln der Durchströmung des Parasiten Kultur.
- 3 ml der Arbeit auf die Säule zu äquilibrieren, und entsorgen Sie die Flow-Through in ein Rohr.
- 8 ml des P. falciparum Kultur auf die Säule, um sicherzustellen, dass, sobald der letzte Teil der Arbeit Lösung wurde aus der Säule durch die Kultur geschoben wird das Aufnahmerohr durch das Sammeln von ein bis Gewinnung des ungebundenen Kultur beginnen ersetzt. Dies ist notwendig, um zu vermeiden Verdünnen der Kultur nicht weiter.
- Sobald die Strömung der Kultur durch die Säule hat aufgehört, 1 ml der Arbeit Lösung, um die verbliebenen Erythrozyten Push aus der Säule.
- Waschschritt: Hinzufügen weitere 3 ml der Arbeit auf die Säule und sammelt das strömende Flüssigkeit in den "Discard" Rohr zur Vermeidung Verdünnen der Kultur als Durchströmung in dem anderen Rohr gespeichert.
- Elution: Sobald die 3 ml durch die Säule passiert haben, lösen diese aus dem Stand und legen Sie sie auf einer 15-ml-Tube.
- Wieder, 3 ml der Arbeit auf die Säule. Dieser Schritt eluiert die Erythrozyten mit späten Stadium Parasiten, die in den Wülsten der Säule eingefangen wurden infiziert.
Hinweis: An dieser Stelle, und je nach der Menge der Parasiten erforderlich, starten eine neue Runde / s für die Sammlung, natürlich in den Grenzen der Parasitämie in der ursprünglichen Kultur. Die Spalte können so lange wiederverwendet werden, da der Strom einen stationären Zustand aufrechterhält.
- Konzentration der gesammelten Parasiten: zentrifugieren 15 ml Röhrchen mit dem Eluat für 5 min bei 150 × g bei Raumtemperatureine dunkle Pellets aus befallenen Erythrozyten zu bilden.
- Entfernen Sie den Überstand, wobei genügend Flüssigkeit, um eine sehr kleine Probe nehmen und bestimmen die Konzentration und Gesamtertrag durch Mikroskopie (siehe Schritt 2 unten).
- In diesem Moment, wenn die Isolierung und Erfassung von späten Stadium Parasiten zufriedenstellend durchgeführt wird, Inkubieren der Kultur gesammelt wieder mit frischen Medien.
- Verdünnen Sie die gesammelten Parasiten im Volumen und die Lösung für weitere Versuche notwendig.
2. Reinheit und Ausbeute Analysis
- Überprüfen der Konzentration von Parasiten unter Verwendung eines Hämozytometers und Zählen unter einem Lichtmikroskop erzielt. Zu zählen, fügen Sie 10 ul der Mischung aus den gesammelten Parasiten und den Medien unter dem Deckglas des Hämozytometer. Zähle die Anzahl der Parasiten in den vier Quadranten des Hämozytometer und teilen die Gesamtzahl von 4. Multiplizieren Sie diese Zahl durch 10 4, um die Konzentration von infizierten E zu erhaltenrythrocytes pro ml enthält.
Anmerkungen: a) Die Konzentration der Mischung wird durch den Benutzer im Moment des Resuspendieren des Pellets entschieden werden, indem mehr oder weniger Medium. Ein Vorschlag Arbeitskonzentration beträgt 5,5 X 10 4 schizontes pro ul (dies wird in der Regel durch Zugabe von 100-300 ul zu den gesammelten Parasiten erreicht). Wenn 20 ul dieser Konzentration auf ein Endvolumen von 100 ul Medienmix und Erythrozyten, eine Parasitämie von 1% in einer typischen 4% Hämatokrit Kultur zugegeben wird erhalten wird. b) Zählen unter dem Hämozytometer muss schnell sein, da die Erythrozyten lysiert, wenn die Probe trocken im Inneren der Kammer zu beginnen. Infizierten Erythrozyten, die die Mehrheit sein sollte, zeigen einen dunklen Fleck im Inneren, die sie aus dem nicht-infizierten.
- Führen Sie eine Dünnschicht-Giemsa-Färbung, um die Reinheit der Sammlung durch die Fixierung der Folien sehr schnell in 10% Methanol, Trocknen und Eintauchen t beurteilen,Saum in einer 20% Lösung von Giemsa mit destilliertem Wasser verdünnt Fleck. Flecken auf den Objektträger für 10 min, nach dem sie von der Luft getrocknet werden kann und unter dem Mikroskop untersucht. A Parasitämie deutlich über 70% erreichbar sein.
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Representative Results
In Abbildung 2 wird das Kulturmedium durch den magnetischen Spalte gezeigt, vor (A) und nach dem Verfahren (B). Ein bis zwei infizierten Erythrozyten werden in der Regel auf einem 100-facher Vergrößerung Feld gesehen, wie in 2 gezeigt, wobei die Pfeile zeigen auf infizierten Erythrozyten in 2A. In einem typischen Verfahren, beginnend mit einem Kulturmedium mit 5% Parasitämie (2A), die Leistung dieses Verfahrens erzeugt gewöhnlich Erythrozyten mit einer Parasitämie von 97% -100% (Abb. 2B). Anreicherung der Parasitämie in der Größenordnung von 20X ist leicht erreichbar, und mehrere Durchgänge der Kultur durch die Säule kann eine hohe Ausbeute erreicht von P. Spätstadium falciparum-infizierten Erythrozyten, nach Bedarf oder Wunsch.
Abbildung 1.
Abbildung 2. A) Typische 5% Parasiten Inhalte vor der Anreicherung nicht synchronisiert. A 1 ul Probe der Parasiten durch dieses magnetische Verfahren gesammelt wurde Giemsa gefärbt und angesehen bei 100facher Vergrößerung. Ein bis drei infizierten Erythrozyten sind in der Regel in einem bestimmten Gebiet der Umfang (mit Pfeilen markiert). B) Parasite Inhalt nach Bereicherung gesehen. A 1 ul Probe der gesammelten Parasiten durch dieses magnetische Prozedur Giemsa angefärbt und bei 100-facher Vergrößerung betrachtet. Parasitämie ist nun 99%.
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Discussion
In-vitro-Kulturen des Malaria-Parasiten P. falciparum Parasitämie weisen eine begrenzte, mit mehr als der Hälfte der nicht infizierten Erythrozyten auf dem höchsten Punkt der Proliferation Kultur. Für die meisten Forschungs-Experimenten ist es wünschenswert, dass es nur mit den infizierten Erythrozyten. Zu diesem Zweck ist ein Trennverfahren notwendig, die Kultur nach der Infektion zu unterteilen. Nützliche Verfahren umfassen die Verwendung von Streptolysin O zu permeabilisieren und lysieren die nicht infizierten RBC 11 und eine Reihe von Variationen, die von differentiellen Zentrifugationen ausnutzen die unterschiedliche Dichte der beiden Gruppen. Einige dieser Verfahren umfassen Gelatine Flotation 12 und die Verwendung von Plasmion 13, sondern die häufigste Substanz verwendet werden, um Schichten unterschiedlicher Dichte zu schaffen, um die verschiedenen roten Blutkörperchen wird das Abfangen Dichtegradientenmedium Percoll, die eine gewisse Toxizität auf den Parasiten 14. Mai präsentieren.
Wir have verwendet eine Technik erstmals von Paul beschriebenen und weiter durch Trang 15, 16, auf dem paramagnetischen Eigenschaft haemozoin, eine inerte Kristalls durch die Verdauung von Hämoglobin durch den Parasiten produziert basierend analysiert. Wie an anderer Stelle von unserer Gruppe berichtet, ist diese Methode nicht-invasiv und scheint nicht zu den Parasiten, wie von der normalen angegeben Nachbehandlung Fähigkeit Invasion von frischen Erythrozyten, wie die Invasion Preise von Parasiten ausgesetzt Bereicherung durch Percoll Vergleich beeinflussen Gradientenzentrifugation 10, 14, 17. Zusätzlich zu diesem Vorteil, wenn die Kultur eine hohe Anzahl von infizierten Erythrozyten, kann es mehr als eine Sammlung Schritt, da die Bindungskapazität der Säule kann nicht genug, um alle Inhalte der Parasit gleichzeitig aufnehmen. Daher kann die Kultur gesammelt durch die Säule geleitet werden mehrmals, bis genügend Parasiten für einen gegebenen weiteren Experiment werden gesammelt.
Die Sammlung von P. falciparum Abs.Plattformen mit der Verwendung von magnetischen Perlen ist einfach, schnell, und benötigt nur einen Tischzentrifuge, anders als die differentielle Zentrifugation Techniken, die eine große und kostspielige Boden Zentrifuge brauchen und die auch erfordert eine sorgfältige Handhabung der Proben.
Einige Anwendungen der Kultur Anreicherung sind die Verwendung der Parasiten in Invasionsassays wo das Ausgangsmaterial Parasitämie rigoros in allen Proben gesteuert wird, wobei die Verwendung der gesammelten Parasiten Hemozoin, das inerte Kristall gemeinsam mit dem Plasmodium Familie zu extrahieren, wobei die Verwendung eines hochdichten von Parasiten für die Mikroskopie Analyse vorzubereiten, und die Extraktion von DNA aus nur Parasiten, wenn sie mit anderen Blutzellen gemischt. Diese letzte Anwendung verwendet werden, um klinische Proben analysieren, um genetisch identifizieren den Stamm von Malaria sie infiziert sind und eine fundierte therapeutische Plan werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde gefördert durch Gewährung PRB-009 CS und ein Promotionsstipendium an LC, aus dem Secretaría Nacional de für Wissenschaft und Technologie (SENACYT), Panama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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