Summary
इस पत्र में, हम गतिशील विपरीत बढ़ाकर प्रतिदीप्ति videomicroscopy का उपयोग vivo में ट्यूमर microvessels का विश्लेषण करने के लिए एक तरीका मौजूद है. दो मात्रात्मक मापदंडों का अधिग्रहण किया गया: कार्यात्मक ट्यूमर की vascularity दर्शाती केशिका घनत्व, और endothelial दीवार की leakiness दर्शाती सूचकांक रिसाव.
Abstract
एक फाइबर ऑप्टिक बंडल के साथ fibered confocal प्रतिदीप्ति में vivo इमेजिंग फ्लोरोसेंट confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में एक ही सिद्धांत का उपयोग करता है. यह ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से सीटू तत्वों में फ्लोरोसेंट उत्तेजित, और फिर एक ही ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से उत्सर्जित फोटॉनों से कुछ रिकॉर्ड कर सकते हैं. प्रकाश स्रोत फाइबर बंडल के भीतर एक तत्व के माध्यम से रोमांचक प्रकाश भेजता है और यह नमूना भर में स्कैन करता है, के रूप में पिक्सेल द्वारा एक छवि पिक्सेल recreates कि एक लेजर है. इस स्कैन समर्पित इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन से, बहुत तेजी से होता है, 12 फ्रेम / सेकंड की एक आवृत्ति के साथ वास्तविक समय में छवियों को प्राप्त किया जा सकता है.
हम एक confocal प्रतिदीप्ति videomicroscopy उपकरण का उपयोग कर, मात्रात्मक केशिका आकारिकी और समारोह को चिह्नित करने के लिए एक तकनीक विकसित की है. हमारे प्रयोग में पहला कदम केशिका नेटवर्क कल्पना करने के लिए ट्यूमर के चार quadrants में 5 सेकंड फिल्मों का रिकॉर्ड था. सभी फिल्में (सॉफ्टवेयर का उपयोग संसाधित थे मैंmageCell, एक चुना व्यास (हमारे मामले में 10 माइक्रोन) के आसपास वाहिकाओं के एक स्वचालित विभाजन से करता है कि मौना प्रौद्योगिकी, पेरिस फ्रांस). इस प्रकार, हम कुल पोत क्षेत्र और छवि के कुल क्षेत्र के बीच का अनुपात है जो 'कार्यात्मक केशिका घनत्व', यों सकता. यह पैरामीटर आमतौर पर विकृति उपकरणों का उपयोग करके मापा, microvascular घनत्व के लिए एक किराए मार्कर था.
दूसरे चरण के interstitium में केशिका दीवार के माध्यम से macromolecular विपरीत एजेंट के रिसाव यों को 20 मिनट से अधिक ट्यूमर की फिल्मों का रिकॉर्ड था. वाहिकाओं में है कि अधिक interstitium में संकेत तीव्रता के अनुपात को मापने के द्वारा, एक 'सूचकांक रिसाव' केशिका पारगम्यता के लिए एक किराए मार्कर के रूप में अभिनय, प्राप्त हुई थी.
Introduction
Angiogenesis पूर्व मौजूदा जहाजों से नए रक्त वाहिकाओं के गठन शामिल है एक जटिल प्रक्रिया है 1. धमनियों, capillaries, और venules से बना ऊतक microcirculation में रोग परिवर्तन, जैसे कैंसर, सूजन, या मधुमेह जैसे रोगों की एक बड़ी रेंज में फंसा रहे हैं. यह मात्रात्मक microvessel संरचना और समारोह का आकलन करने के तरीकों को विकसित करने के लिए इसलिए जरूरी है. इमेजिंग वास्तविक समय में और vivo में, एक गैर या सूक्ष्म आक्रामक तरीके से microvessels के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है, और एक ही पशु 2 में समय पर दोहराया उपाय.
वर्तमान में, गतिशील विपरीत बढ़ाकर (डी सी इ) इमेजिंग 3 सामान्यतः ऊतक microcirculation आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. गतिशील विपरीत बढ़ाकर इमेजिंग समय के साथ नसों में इंजेक्शन एक दरियाफ्त की biodistribution इस प्रकार है जो एक तकनीक है. इस अधिग्रहण से, मात्रात्मक मापदंडों ऊतक vascularization दर्शाती निकाला जा सकता है. डी सी इ इमेजिंगसबसे अधिक बार सीटी, एमआरआई या अल्ट्रासाउंड के साथ इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इन इमेजिंग तकनीक विशिष्ट प्रयोगात्मक उपकरणों के उपयोग के साथ अन्य की तुलना में उनके संकल्प, सबसे अधिक बार macroscopic रहता है के बाद से, microvessels के प्रत्यक्ष देखने की अनुमति नहीं है.
इस पत्र में, हम fibered confocal videomicroscopy साथ, गतिशील विपरीत बढ़ाकर ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग सूक्ष्म पैमाने पर और vivo में ट्यूमर वाहिका अध्ययन करने का प्रस्ताव है. हम अपनी आणविक वजन और ऊतकों की अन्तःचूचुक की विशेषताओं 4 अध्ययन के अनुसार, interstitium में endothelial बाधा के माध्यम से जहाजों या लीक के भीतर विशेष रूप से बनी हुई है, जो एक macromolecular विपरीत एजेंट (FITC-dextran) का इस्तेमाल किया. इस लीक और interstitium में जमते द्वारा, सही ढंग से जहाजों delineating द्वारा दोनों microvessel संरचना का अध्ययन, और केशिका पारगम्यता की अनुमति दी.
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Protocol
1. इसके विपरीत एजेंट की तैयारी
- FITC-dextran 70 केडीए के लिए, इंजेक्शन की खुराक 500 मिलीग्राम / किग्रा (FITC-dextran के 10 मिलीग्राम 20 ग्राम वजन एक माउस के लिए नमक की 0.1 मिलीलीटर में पतला) है.
- एजेंट प्रकाश को भी लंबे समय उजागर नहीं किया जाना चाहिए. विरंजन से बचने के लिए, यह एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करने के लिए सिफारिश की है.
2. संज्ञाहरण
- चूहे xylazine का 01:04 का एक मिश्रण की एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा anesthetized गया (Rompun 2%, बायर, Puteaux, फ्रांस) और ketamine (ketamine 500, VIRBAC, काररॉस, फ्रांस), क्रमशः 66 मिलीग्राम / किग्रा और 264 मिलीग्राम / किग्रा एक 20 ग्राम माउस के लिए.
3. ब्याज का अंग की तैयारी
- हम (एक चमड़े के नीचे ट्यूमर से अधिक उदाहरण के लिए,) हित के स्थान पर चूहों के बाल काटे. पशु बाल अक्सर सफेद जब ऑटो फ्लोरोसेंट है. जब काला, यह प्रकाश अवशोषित.
- imaged किया जा अंग का सामना करना पड़ त्वचा छिन्न गया था. यह bleedin जब तक प्रतीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण हैजी अन्यथा यह रक्त में रिसाव और छवि दूषित होगा, इसके विपरीत एजेंट इंजेक्शन लगाने से पहले बंद कर दिया गया है.
4. अर्जन
- इसके विपरीत एजेंट गले का नस या दुम नस या तो इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था. एक फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट के अभाव में मनाया अंग में नहीं है या थोड़ा पृष्ठभूमि संकेत नहीं है.
- जांच imaged किया जा अंग के सामने रखा गया था. हमारे अध्ययन में, यह ट्यूमर था.
- लेजर ट्यूमर रोशन और केशिकाओं में प्रतिदीप्ति देखने के लिए चालू किया गया था.
- ट्यूमर केशिका नेटवर्क कल्पना करने के लिए, जबकि रिकॉर्डिंग एक बहुत धीमी गति से आंदोलन में जांच आगे बढ़ करके स्वयं भी पता लगाया गया था. यह एक स्थिर हाथ बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और इस तकनीक का एक छोटा सा अनुभव की आवश्यकता है. हमारे अध्ययन में, इस दिशा में पहला कदम कार्यात्मक केशिका घनत्व की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी.
- दूसरे चरण के लिए समय के साथ गतिशील अधिग्रहण किया गया था. इस अध्ययन के लिए, हम एक 70 केडीए FITC-dextran इस्तेमाल किया. सबसे सामान्य अंगों में कोई बीचवाला रिसाव है लेकिन ट्यूमर में वहाँ है. (हमारे मामले में) समय के साथ एक ही स्थान प्राप्त चित्रों के लिए, यह ब्याज के क्षेत्र पर जांच बनाए रखने के लिए एक प्रणाली स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह जांच कराने के लिए एक हस्तनिर्मित समर्थन का उपयोग करके किया, और जांच की नोक पर अल्ट्रासाउंड जेल का एक सा रखकर किया गया था. रिकॉर्डिंग से पहले, समय ट्यूमर के साथ संपर्क में रखा जांच को स्थिर करने के लिए खर्च किया गया था. स्थान सुरक्षित किया गया था, की वजह से माउस की सांस लेने के लिए केवल न्यूनतम गति नहीं थी. लेजर केशिका रिसाव की उपस्थिति का पता लगाने के लिए 20 मिनट के लिए 3 छवियाँ हर 30 सेकंड रिकॉर्ड करने के लिए चालू किया गया था. यह विपरीत एजेंट विरंजन कम करने के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बीच बंद कर दिया गया था.
- हमारे प्रयोग में चूहों के ट्यूमर के histological विश्लेषण के लिए प्रक्रिया के अंत में बलिदान किया गया.
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Representative Results
एकत्र आंकड़ों का प्रयोग, हम मात्रात्मक microcirculation को दर्शाती विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण कर सकता है.
हमने अध्ययन में विवो एक fibered confocal प्रतिदीप्ति videomicroscopy प्रणाली (Cellvizio, Maunakea प्रौद्योगिकी, पेरिस, फ्रांस 2), एक macromolecular फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट के इंजेक्शन के बाद fluorescein आइसोथियोसाइनेट-dextran (का उपयोग BALB सी चूहों में प्रत्यारोपित एक पेट के ट्यूमर के परिधीय संवहनी नेटवर्क 70 केडीए (सिग्मा Aldrich, सेंट क्वेंटिन Fallavier, फ्रांस) और क्रमश: 488 एनएम और 520 एनएम का उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ (हमारे इमेजिंग सिस्टम के साथ संगतता के लिए) की एक आणविक वजन के साथ FITC-dextran).
हमारे प्रयोग में पहला कदम केशिका नेटवर्क कल्पना करने के लिए ट्यूमर के चार quadrants में से प्रत्येक में 5 सेकंड फिल्मों का रिकॉर्ड था. ट्यूमर vascularization का यह अनुमति दी प्रतिनिधि नमूना. सभी फिल्में एक सॉफ्टवेयर (ImageCell, Mauna का उपयोग संसाधित किया गयाKea प्रौद्योगिकी, पेरिस फ्रांस) व्यास में 5-20 माइक्रोन से लेकर जहाजों शामिल है जो एक चुने हुए व्यास (हमारे मामले में 10 माइक्रोन,) के आसपास छवियों में जहाजों के एक स्वचालित विभाजन प्रदर्शन. इस प्रकार, हम कुल पोत क्षेत्र और छवि के कुल क्षेत्र के बीच का अनुपात है जो 'कार्यात्मक केशिका घनत्व' (FCD), यों सकता. यह पैरामीटर आमतौर पर विकृति उपकरणों का उपयोग करके मापा, microvascular घनत्व की एक किराए मार्कर था. चित्रा 1 प्राप्त छवियों के प्रकार और पोत विभाजन के परिणाम का एक उदाहरण से पता चलता है. इस उदाहरण में, FCD 36% के रूप में मापा गया था.
फिर, तीन छवियों केशिका रिसाव की उपस्थिति का पता लगाने के लिए 20 मिनट के लिए हर 30 सेकंड दर्ज किए गए. छवियों के दृश्य परीक्षा पहली विपरीत एजेंट interstitium में रिसाव के साथ ही अपने स्थानिक वितरण (सजातीय या विषम) की अनुपस्थिति या उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, प्रदर्शन किया गया था.
हम int के तीन क्षेत्रों को आकर्षित किया समय अंक 0, 5, 10 और 20 मिनट में interstitium में केशिकाओं और तीन आरओआई में erest (आरओआई). तीन अलग केशिकाओं और सन्निहित बीचवाला क्षेत्रों के भीतर संकेत तीव्रता (एसआई) हर समय बिंदु पर औसतन थे. = Σ आईपी परिवाहकीय (या बीचवाला) तीव्रता है और द्वितीय intravascular तीव्रता 5 है, जहां [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] एक्स 100/3, के रूप में सूचकांक रिसाव (%) गणना की गई -7. चित्रा 2 interstitium में विपरीत एजेंट रिसाव का एक उदाहरण दिखाता है. इस उदाहरण में, सूचकांक रिसाव 1.47 के रूप में मापा गया था.
इस गतिशील विपरीत बढ़ाकर ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक ट्यूमर microcirculation के विवो माप में अनुमति देता है. यह केशिका पारगम्यता बढ़ाता द्वारा केशिका घनत्व, और उनकी कार्यक्षमता बढ़ाता द्वारा ट्यूमर जहाजों की वास्तुकला को दर्शाता है.
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चित्रा 1. वाम:. ट्यूमर की सतही परत में microvessels के चित्र अधिकार: पोत का पता लगाने के मॉड्यूल का आवेदन करने के लिए स्वचालित रूप से लेकर व्यास के साथ खंड वाहिकाओं 5-20 माइक्रोन (ब्याज का व्यास: 10 माइक्रोन). खंडित वाहिकाओं बैंगनी में डाला जाता है.
चित्रा 2. अलग अलग समय बिंदुओं पर interstitium, क्रमशः टी 0 (एक), टी 5 (बी), टी 10 (ग) और टी 20 (घ). वेसल्स (वी) के लिए केशिकाओं से रिसाव के रूप में उच्च संकेत रैखिक संरचनाओं में देखा जाता है. इंजेक्शन (टी 0) पहले, कोई संकेत interstitium (मैं) में देखा जाता है. उत्तरोत्तर, एक वृद्धि की वजह से असामान्य ट्यूमर endothelial बाधा के माध्यम से फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट का रिसाव को interstitium में देखा जा सकता है.
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Discussion
ट्यूमर microcirculation के अध्ययन ट्यूमर के विकास, प्रसार और चिकित्सा 1 के जवाब के pathophysiology समझ में आवश्यक हो गया है. ऑप्टिकल इमेजिंग एक फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट का उपयोग केशिकाओं निरीक्षण करने के लिए और रूपात्मक (कार्यात्मक केशिका घनत्व) और कार्यात्मक (सूचकांक रिसाव) मापदंडों यों इस्तेमाल किया जा सकता है कि तकनीक से एक है.
हम इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग फायदे और सीमा दोनों है. एक लाभ यह प्रयोग किया विपरीत एजेंट के आकार का चयन करने में सक्षम किया जा रहा है. इधर, एक 70 केडीए FITC-dextran के साथ, प्रयोग की शुरुआत में endothelial बाधा के माध्यम से रिसाव हमारे बीच एक अच्छा विपरीत के साथ जहाजों की प्रारंभिक आकारिकी (टेढ़ा - मेढ़ापन, अराजक नेटवर्क, आदि.) का निरीक्षण करने की अनुमति दी है, जो कम से कम था जहाजों और interstitium 8, और एक देरी के बाद, प्रेक्षण के 20 मिनट से अधिक विपरीत एजेंट का रिसाव. में विमान (एक्सy) संकल्प हमें बजाय अधिकांश अन्य इमेजिंग तकनीक (एमआरआई, सीटी, अल्ट्रासाउंड, पीईटी ...) के साथ के रूप में एक macroscopic स्तर के, एक सूक्ष्म स्तर पर जहाजों और interstitium कल्पना करने की अनुमति दी है, जो (3.5 माइक्रोन) उच्च था. अंत में, इस रूप में वे होते परिवर्तन देखा जा सकता है जिसका अर्थ है कि वास्तविक समय इमेजिंग है.
हालांकि, इस तकनीक को नुकसान कर रहे हैं. तंत्र संचालित करने के लिए नाजुक है. दरअसल, जांच बहुत छोटे (1.8 मिमी) और फिसलन है और यह समय की लंबी अवधि में ट्यूमर पर एक ही जगह में रहने के लिए मुश्किल है. जानवर की सांस लेने की गति का भी स्थिरता समझौता. इस में सुधार करने के लिए, हम स्थिति में जांच बनाए रखने के लिए जांच और एक हस्तनिर्मित समर्थन स्थिर अल्ट्रासाउंड जेल का इस्तेमाल किया. इसके अलावा, हम परिणामों चिंता ट्यूमर का ही सबसे ऊपरी परत प्राप्त जिसका अर्थ है कि ट्यूमर का केवल सतही क्षेत्र (100 माइक्रोन से 170 माइक्रोन से) देख सकते हैं.
मुख्य सीमा, Howeveआर, ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग पूर्ण मात्रा का ठहराव तक पहुँचने में कठिनाई है. सूचकांक के रिसाव एक अनुपात है, और इसलिए केवल एक अर्द्ध मात्रात्मक पैरामीटर. सबसे पहले, आरओआई में आंशिक voluming की वजह से कलाकृतियों कर रहे हैं. में विमान संकल्प उच्च है, हालांकि वास्तव में, Z-विमान संकल्प यह वाहिकाओं और interstitium दोनों शामिल हैं जिसका मतलब है कि, (70 माइक्रोन का टुकड़ा मोटाई) कम है. एक 10 माइक्रोन व्यास के साथ एक पोत में संकेत तीव्रता मापने इसलिए, जब यह टुकड़ा में शामिल आसपास के interstitium साथ औसत निकाला जाता है. इसके अलावा, ऑप्टिकल इमेजिंग में, संकेत तीव्रता और विपरीत एजेंट एकाग्रता के बीच एक जटिल रिश्ता नहीं है. एक ऊतक फोटॉनों से प्रकाशित किया जाता है, कई घटनाओं में एक साथ होते हैं और एकत्र संकेत को प्रभावित कर सकते हैं. ऐसे हीमोग्लोबिन या कोलेजन के रूप में उत्तेजना या उत्सर्जन फोटॉनों अवशोषित कर सकते हैं कि ऊतकों में प्राकृतिक chromophores कर रहे हैं. कई दिशाओं में फोटॉनों disperses जो कुछ प्रसार भी है. अंत में, विरंजन शायद एक हैयह एकाग्रता का संकेत स्वतंत्र का नुकसान लाती है, क्योंकि FITC का उपयोग करते समय सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों में से. कई अनुसंधान समूहों ऑप्टिकल संकेत बढ़ाता पर काम कर रहे हैं, लेकिन यह एक जटिल modelization 9,10 निकलता है.
अंत में, अनुदैर्ध्य अध्ययन आसानी से प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं. हम छवियों को प्राप्त करने के क्रम में ट्यूमर प्रकट करने के लिए त्वचा काटकर अलग कर देना था, और यह देखा अंग शरीर गुहा (जैसे जिगर या गुर्दे) में गहरी है, खासकर जब चीरा को बंद करने के लिए मुश्किल साबित हो सकता है.
कुल मिलाकर, हम एक confocal प्रतिदीप्ति videomicroscopy उपकरण का उपयोग कर, मात्रात्मक केशिका शरीर रचना और समारोह को चिह्नित करने के लिए एक गतिशील विपरीत बढ़ाकर प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक विकसित की है. इस तकनीक को आगे सत्यापन की आवश्यकता है, लेकिन चिकित्सा से पहले और बाद, या ट्यूमर मॉडलों के बीच ट्यूमर vascularization की तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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