Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Montering af nukleosomal Arrays fra rekombinant Core Histoner og nukleosom Positioning DNA

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

En metode præsenteres for rekonstituering af model nukleosomal arrays fra rekombinante kerne histoner og tandemgentaget DNA nukleosom positionering. Vi beskriver også, hvordan sedimentationshastighed eksperimenter i den analytiske ultracentrifuge og atomic force mikroskopi (AFM) anvendes til at overvåge omfanget af nukleosomal matrix mætning efter rekonstitution.

Abstract

Core histon octamerer, der gentagne mellemrum langs en DNA-molekyle kaldes nukleosomal arrays. Nukleosomal arrays opnås på en af to måder: oprensning fra in vivo-kilder eller rekonstitution in vitro fra rekombinante kerne histoner og tandemgentaget DNA nukleosom positionering. Sidstnævnte metode har den fordel, at til samling af en mere sammensætningsmæssigt ensartet og præcist placeret nukleosomal array. Sedimentationshastighed eksperimenter i den analytiske ultracentrifuge udbytte information om størrelse og form af makromolekyler ved at analysere den hastighed, hvormed de migrerer gennem opløsning under centrifugalkraft. Denne teknik, sammen med atomic force mikroskopi, kan anvendes til kvalitetskontrol, der sikrer, at størstedelen af ​​DNA-skabeloner er mættet med nukleosomer efter rekonstitution. Her beskriver vi de protokoller, der er nødvendige for at rekonstruere milligram mængder af længde og deres sammensætning defined nukleosomal arrays egnet til biokemiske og biofysiske studier af kromatin struktur og funktion.

Introduction

Eukaryote genomer ikke eksisterer som nøgent DNA, men snarere er komprimeret og organiseret af bundne proteiner. Disse komplekser af DNA og protein, som kaldes kromatin. Den grundlæggende gentagne enhed i kromatin er nucleosome. En nukleosom består af histon octamer og 146 basepar af DNA viklet omkring histon octameren omkring 1,6 gange 1. Histon octamer er sammensat af to eksemplarer hver af de centrale histoner H2A, H2B, H3 og H4. Core histon octamerer, der gentagne mellemrum langs en DNA-molekyle kaldes nukleosomal arrays. Den udvidede struktur nukleosomal arrays er blevet omtalt som den 10 nm fiber eller "perler på en snor"-struktur og er til stede in vitro under lave saltbetingelser 2. Den 10 nm fiber er i stand til at kondensere i højere orden strukturer gennem intra-matrix komprimering og / eller inter-matrix oligomerisation 2. Disse strukturer af højere orden kan induceres i nærvær af salte,eller kan påvirkes gennem binding af kromatin arkitektoniske proteiner til nukleosomal matrix 3,4. Niveauer af kromatin komprimering omvendt korreleret med hastigheden af transskription in vivo 5,6. Nyere forskning understreger betydningen af den strukturelle organisering af genomer i processer såsom differentiering, udviklingen af kræft, og andre 7,8. Brugen af ​​nukleosomal arrays til at studere kromatin struktur og funktion er blevet udbredt. Her beskriver vi en fremgangsmåde til samling af nukleosomal arrays fra rekombinante kerne histoner og nukleosom positionering DNA.

Brug rekombinant DNA med tandemgentagelser af nukleosom positionering sekvenser giver mulighed for genoprettelse af arrays, som indeholder regelmæssigt fordelte nukleosomer. To af de mere populære positionering sekvenser er 5S rRNA-gensekvens og "601" sekvens 9,10. Den 601-sekvensen blev afledt af SELEX eksperimenter og more positionerer kraftigt nucleosomes end 5S sekvens 11. Følgelig linker-DNA længde 601 arrays er mere homogen. Tandemgentaget nukleosom positionering DNA opnås ved gelfiltrering 4,12. Rekombinante histoner oprenses fra E. coli under denaturerende betingelser 13. Anvendelsen af ​​rekombinante histoner tillader en at omhyggeligt at kontrollere histon sammensætning nukleosomal arrays. For eksempel kerne histoner bærer specifikke mutationer 14 eller post-translationelle modifikationer 15,16 kan erstatte vildtype kerne histoner.

Sedimentation velocity eksperimenter overvåger hastigheden af sedimentering af makromolekyler i opløsning under en anvendt centrifugalkraft 17. Dette giver information om størrelsen og formen af ​​makromolekyler i en prøve. Sedimentation velocity eksperimenter er derfor et egnet værktøj til at studere løsning tilstandsændringer i kromatin fibergrund chromatinkondensering 18 struktur. Vigtigere er det, er det nødvendigt først at bruge sedimentationshastighed eksperimenter som en kvalitetskontrol skridt i nukleosomal matrix rekonstituering. Hvis DNA og nukleosomer ikke kombineres på rette molforholdet, kan arrays være under-eller over-mættet med kerne histoner. Således er oplysninger fra de sedimentationshastighed eksperimenter anvendes til at sikre, at DNA'et er korrekt mættet med nukleosomer. Det er vigtigt at anvende alternative metoder til at estimere mætning af DNA med nukleosomer, især hvis du arbejder med en tidligere uncharacterized DNA-skabelon. Derfor har vi også beskrive en metode til analyse af nukleosomal arrays bruger atomic force mikroskopi (AFM). AFM er en kraftfuld teknik, der tillader visualisering af virkningerne af en række parametre, såsom graden af mætning, virkning af tilstedeværelsen af histon varianter eller virkninger af MgCl2 19,20. AFM har også været ansøged at studere nukleosom dynamik ved hjælp af tid bortfalder billeddannelse 21. In vitro samles nukleosomal 12-mer arrays er særligt modtagelige for AFM studier, fordi de hører til i den rigtige størrelse interval for AFM billeddannelse 22. I nærværende undersøgelse har vi brugt AFM af nukleosomal arrays som en kvalitetskontrol samt som et middel til at bekræfte data fra AUC ("se er at tro"). Ud over simple visualisering, AFM tillader måling af højde profiler af prøverne som en yderligere parameter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Montering af rekombinante Core Histoner ind octamerer

Grundlag: Det første skridt i nukleosomal vifte rekonstituering er at forberede native kerne histon octamerer fra frysetørrede rekombinante kerne histoner. Histonproteinerne kombineres i lige store molære mængder og samles i histon octamerer ved dialyse af prøverne af et denaturerende puffer i genfoldningspuffer.

  1. Rense og lyofilisere rekombinante kerne histoner (H2A, H2B, H3, H4) som beskrevet 13..
  2. Opløses ca 5 mg af hvert lyofiliseret kerne histon i 3 ml udfoldning puffer (6 M guanidinium-HCI, 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM DTT). Lad hver alikvot til at opløse mindst en time. Sikre, at ingen protein tilbage på siderne af beholderen.
  3. Absorbansen af ​​hver histon ved 276 nm under anvendelse af udfoldning buffer som reference.
  4. Beregn molariteten af hver histon bruge deres ekstinktionskoefficienter (se tabel 1 Xenopus histon ekstinktionskoefficienter). Sammenlign absorbansen bestemt koncentration af histon til lyofiliserede tørvægt og skøn, hvis størstedelen af ​​proteinet er opløst.
  5. Afgør, hvilke histon du har færrest mol, da dette vil være den begrænsende antal mol for alle histoner.
  6. Kombiner histoner i lige molære mængder og fortyndes med udfoldning buffer til en slutkoncentration på 1 mg / ml.
  7. Anbring prøven i 6-8 kDa MWCO dialyserør. Forsegle røret og anbringes i 2 l kold genfoldningspufferen (2 M NaCI, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-mercaptoethanol).
  8. Dialyseres prøven i 18 timer ved 4 ° C under omrøring. Sørg dialyseslangen kan rotere frit og energisk, ellers histonerne kan udfældes.
  9. Skift dialysebufferen to gange i 18 timer (dvs. ændre genfoldningspufferen om hver 6 timer indtil gjort). Selv hvis bundfald ikke kassereprøven, kan nogle octamer genvindes selvom udbyttet vil blive reduceret.

Bemærk: Se trin 2,1-2,2 at forberede kolonne ligevægt til næste dag.

2. Oprensning af histon octamerer ved gelpermeationskromatografi

Rationale: Efter at have konkluderet med § 1, vil prøver indeholder histon octamerer samt andre histon komplekser såsom aggregater, H3/H4 tetramere og H2A/H2B dimerer. Histon octamerer vil oprenses væk fra disse andre komplekser ved hjælp af gelpermeationskromatografi (SEC).

  1. Tilslut en HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) kolonne til en FPLC system. Sørg for, at luftbobler ikke kommer ind i systemet.
  2. Rengør S200 kolonnen med 0,2 um filtreret vand. Brug en strømningshastighed på 0,3 ml / min og indstille et modtryk grænse på 0,5 MPa. Sørg for at du har nok vand og lad kolonnen for at rense natten over.
  3. Ækvilibrere S200-søjle og prøvesløjfe af FPLC hjælp genfoldningspuffer. Brug 1 L 0,2 um filtreret genfoldningspufferen. Flow genfoldningspuffer gennem søjlen med en hastighed på 1 ml / min og et tryk på højst 0,5 MPa i omkring 2 timer.
  4. Ækvilibrer en Vivaspin centrifugal-koncentrator (50 kDa MWCO) med 1 ml genfoldningspuffer. Prøven fjernes fra dialyserøret og centrifugeres prøven ved 4 ° C for at fjerne eventuelle bundfald. Pipette prøvesupernatant i koncentrator. Koncentrer prøven til et volumen på ca 500 pi.
  5. Tag den koncentrerede octamer prøven til en ny beholder og skyl koncentrator med 1 ml genfoldningspuffer. Koncentrer skyllevandet ned til 500 ul, og føje den til oktamer prøven. Dette medvirker til at redde nogen octamer tilbage i koncentrator.
  6. Spin prøven i et 1,5 ml mikrocentrifugerør i 5 minutter ved 10.000 rpm ved 4 ° C. Saml supernatanten og overføres til et nyt rør. Dette medvirker til at fjerne eventuelt bundfald, før du lægger prøven på FPLC.
  7. Load prøven på S200 kolonne. Load maksimalt 1,5 ml totalt volumen eller 15 mg octamer i en enkelt rensning.
  8. Eluere prøven under anvendelse frisklavet genfoldning buffer. Brug en strømningshastighed på 1 ml / min og et modtryk grænse på 0,5 MPa. Brug to søjlevolumener (400 ml) genfoldningspuffer og indsamler fraktioner på 2 ml. Overvåge absorbansen ved 280 nm under elueringen. De forskellige arter vil elueres i rækkefølge efter faldende størrelse. Histon aggregater normalt elueres ved cirka 45 ml, octamer på omkring 65 ml og dimer på omkring 84 ml (figur 1).
  9. Analyser elueringsfraktionerne fra toppe af interesse ved at køre prøver på en 18-20% SDS-PAGE. Fraktioner indeholdende oprensede octamerer bør have lige molære mængder af de fire centrale histonproteinerne (Figur 1).
  10. Pool fraktionerne, der indeholder oprenset octamerer, og koncentreres til ≤ 15 mg / ml med en Vivaspin centrifugalfilter. Hvis venstre fortyndet, kan octamerer adskille into H2A/H2B dimerer og H3/H4 tetramerer.
  11. Bestem oktamer koncentration ved at måle absorbansen ved 280 nm og beregning ved anvendelse af ekstinktionskoefficienten af tabel 1.
  12. Histon octamerer kan holdes kort sigt genfoldningspuffer ved 4 ° C. Hvis der er gemt på lang sigt, vil octamerer være mere stabile ved -20 ° C og i en 50% glycerol opløsning. Octamerer gemt i glycerol skal dialyseres i frisk genfoldningspufferen før absorbansmålinger og brug i nukleosomal array-rekonstitutioner.

3. Rekonstituering af nukleosomal Arrays fra DNA og rensede octamerer

Rationale: Rekonstituering af nukleosomal arrays kræver, at histon octamerer og skabelon-DNA kombineres på bestemte molforhold. Blandinger af DNA-og histon octamerer i 2 M NaCl er trin dialyseres i buffere af faldende ionstyrke. En gradvis ændring lavere salt sikrer korrekt nukleosom dannelse. Indhentning af nucleosomal arrays med det ønskede niveau af histon octamer mætning af template-DNA kræver mindre målestok rekonstitutioner efterfulgt af en stor skala præparativ rekonstitution. De passende betingelser, som de mindre målestok rekonstitutioner bruges til at guide den præparative rekonstituering.

  1. Renses tandemgentaget nukleosom positionering DNA som beskrevet 4,12. Kort fortalt isolere plasmid-DNA under anvendelse af et Qiagen GigaPrep kit eller et lignende produkt. Set-up et restriktionsenzym fordøje for at frigive template-DNA og fordøje plasmid-DNA'et i mindre størrelser (≤ 700 bp). Template-DNA kan derefter oprenses fra de små plasmid DNA rester ved hjælp af gelpermeationskromatografi (SEC). En tyngdekraftsforsynet kolonne med en højde på omkring 115 cm pakket med Sephacryl S-1000 perler er tilstrækkeligt til rensning af 601 207bp x 12mer DNA.

Bemærkninger: Af plasmid DNA oprensning ved reduceret pris, men øget effort, kan man anvende alkalisk lysis med phenol / chloroform DNA-oprensning for at isolere plasmid-DNA fra E. coli 23,24. Strategier til adskillelse template-DNA fra plasmid-DNA kan variere med ændringer i template-DNA-størrelse. For SEC er det vigtigt at opsætte restriktionsenzym fordøje på en måde, der maksimerer forskellen i størrelse mellem skabelonen og plasmid DNA.

  1. Afgøre, hvilke molforhold (r) til brug for rekonstitutioner. R er lig med forholdet af mol octamer til mol af DNA repeat. For første lille skala forsøg, R-værdier på 0,9, 1, og 1,1 er passende, hvis hensigten er at opnå mættede nukleosomal arrays.
  2. Forbered i lille skala stikprøver ved at beregne mængden af ​​octamer at tilføje til cirka 18 ug DNA til hver molforhold, der skal testes. Bland DNA'et og histon octamerer. Den endelige koncentration af NaCl i prøven skal være ≥ 2 M, og den endelige koncentration af DNA bør være omkring 0,3 pg / pl. Den endelige prøve buffer betingelser bør også omfatte 10 mM Tris pH 7,8, og 1 mM EDTA.
  3. Prøverne er nu klar til dialyse. Load prøverne i 12k-14k MWCO dialyserør. Dialysér prøverne mod 2 liter buffer faldende ionstyrke som følger.

Komponenter i alle buffere: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Buffer 1 (add 1 M NaCl, 1 mM DTT) i 5-6 timer. Buffer 2 (tilføj 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) natten over. Buffer 3 (tilføj 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) for 5-6 timer. Buffer 4 (tilføj 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) natten over.

  1. Tag prøver fra dialyserøret og fortsæt til § § 4-6. Hvis prøver i lille målestok de give de ønskede resultater, skal du gentage trinnene i § § 3-6 på den store skala.

Bemærk: For at spare på ressourcerne, bør i lille skala prøver have den mindste mængde er nødvendigt for at være tilstrækkeligt for downstream screeningassays. For at få enough prøve til sedimentationshastigheden og AFM eksperimenter er anført her, prøver 50 pi på 0,3 mg / ml DNA er passende. Størrelsen af ​​stor skala præparative prøver er afhængig af deres anvendelse. En storstilet prøve skal udarbejdes på samme måde som i lille målestok prøver de.

4.. Sedimentation Velocity Analyse af Færdigopløst nukleosomal Arrays

Rationale: sedimentationshastighed eksperimenter i analytisk ultracentrifuge indholdsoplysningerne Beckman XL-A / I på størrelse og form af molekyler i opløsning. Sedimentation velocity eksperimenter udført under lav saltbetingelser bruges til at afgøre, i hvilket omfang de rekonstituerede arrays er mættet med nukleosomer.

  1. Fortynd prøven til en absorbans på omkring 0,5 ved 260 nm under anvendelse af TEN-buffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Load 400 ul prøve i en celle med en to sektor opsats, med prøven på den ene side og folkeafstemnince (TEN buffer) på den anden 25. Hold reference menisk højere end prøven menisk (dvs. tilføje 420 ul henvisning opløsning).
  2. Læg de celler i rotoren, og tilpasse cellerne korrekt ved hjælp af hash mærker på bunden af celler og rotor 25. Forsigtigt støv linser af de celler, der anvender trykluft.
  3. Tænd XL-A/XL-I centrifuge, indsæt rotoren, og fastgør og sikre optik som beskrevet i vejledningen. Åbn Proteome Lab software og vælg fil: ny.
  4. Opsæt en enkelt scanning køre på 3.000 rpm og en temperatur på 25 ° C. Under indstillinger, vælg stop efter sidste scanning, og køre radial kalibrering (radial kalibrering er ikke nødvendig, hvis rotoren var den sidste rotor anvendes i AUC).
  5. For hver celle, navngive prøverne, skal du vælge en bølgelængde (260 nm), vælg absorbans, og vælg en gemme fil placering på din computer. Begynd enkelt scanning løb.
  6. Brug enkelt scanning for at bestemme den passende radial scan længde (figur 2A). Reducering længden af ​​den celle, der skal scannes nedsætter køretid. Dog være sikker på at medtage prøven menisken og udvide ende meget tæt på eller i bunden af ​​cellen.

Bemærk: Enkelte scanninger tillader måleområdet skal afkortes ved at starte målinger lige før prøven menisk (figur 2A). De fleste af de scanninger genereret under AUC sigt bør have grænsebetingelser fraktioner sidste menisken samt stabil plateauer (figur 2B). Dirty linser på AUC celler kan generere scanninger med store pigge, kan disse påvirke analysen af ​​data. Den UltraScan software indeholder en manual, som er en stor ressource for information om analysen af analytiske ultracentrifugering data 26.

  1. Brug af XL-A/XL-I kontrolpanelet, skal du indtaste en hastighed på 0, og tryk på start. Dette vil foranledige centrifugekammeret at trække et vakuum og alleow temperaturen i kammeret for at ækvilibrere. Vent 1 time for at tillade temperaturækvilibrering, før du begynder en løbetur.
  2. Bruge softwaren til at indstille kørslen op til den ønskede hastighed og antallet af scanninger. Højere hastigheder øger opløsningen, men man skal indsamle mindst 20 scanninger (fortrinsvis flere), før prøven er sedimenterede til bunden af ​​cellen. Det er bekvemt at overlejre de sidste flere scanninger (udført i indstillingsmenuen) for at overvåge udviklingen af ​​kørslen og kontrollere for potentielle problemer såsom utætte celler. Overvåg de første par scanninger for at sikre korrekt drift.

5.. Redigering og analysere Sedimentation Velocity data

Rationale: Rå sedimentationshastighed data skal analyseres af et program, der giver en diffusionsåben korrigeret sedimentationskoefficient distribution. Denne information gengæld angiver den brøkdel af en rekonstitueret prøve, der indeholder en given mætning niveau, fx

  1. Brug AUC dataanalyse software som UltraScan redigere dataene 26. Redigering af scannede data skal gøres for hver celle og skaber et datasæt til efterfølgende analyse. Korrekt redigering af scanninger indebærer definere prøven menisken, hvilket reducerer data til en region af interesse, og definere baseline samt plateau regioner (figur 2). Uønskede scanninger kan også fjernes fra datasættet på dette punkt. Da det er muligt at fjerne uønskede scanninger under analysen, anbefales det dog, at alle scanninger holdes på dette punkt.
  2. Vi anbefaler kraftigt, at den styrkede van Holde-Weischet metode bruges til at analysere de data, 27. Denne analyse metode korrigerer for effekten af ​​diffusion i løbet af kørslen og giver integreret fordeling af sedimentering koefficienter. Navnlig, Den forbedrede van Holde-Weischet metoden (som implementeret i UltraScan) vil gøre det muligt for optagelse af scanninger, som mangler stabile plateauer, eller som indeholder grænse fraktioner, som ikke har ryddet menisken i analysen 28.
  3. Bestem fordelingen af ​​bundfældningstanke koefficienterne for de forsamlede arrays. Repræsentative resultater for 601-12 (207bp, 12-mer) nukleosomal arrays er vist i figur 3..
  4. Hvis en af ​​mindre omfang prøver de indeholder arrays med det ønskede område af sedimentering koefficienter, derefter gentage processen ved en øget målestok starter med § 3. Stk. Hvis ingen af ​​i lille skala prøver de har en ordentlig fordeling af bundfældningstanke koefficienter derefter gentage lille skala test med en ny R serie starter ved § 3. Stk.

6.. Visualisering nukleosomal Arrays Brug Atomic Force Mikroskopi (AFM)

Rationale: AFM tillader visualisering af niveauet for mætning af nucleosomal arrays. Denne teknik supplerer sedimentering hastighed ved AUC og restriktionsenzymspaltning som en kvalitetskontrol assay.

  1. Anvendelse af fremgangsmåder beskrevet ovenfor, opnå en godt mættet nukleosom array (figur 5A).
  2. Forbered APTES behandlet glimmer objektglas ved at placere ~ 30 ul 1:1000 fortynding af kommercielt (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl) triethoxysilan A3648-100 ml) i 0,22 um filtreret nanorent vand i 30 minutter.
  3. Efter 30 minutter skylles APTES off med filtreret vand og forsigtigt tørre dem i en nitrogenstrøm.
  4. Placer passende fortyndet nukleosom vifte prøve (~ 1,5 ng / ul) på diaset, og inkuberes dækket ved stuetemperatur i 15 min.
  5. Skyl prøve off med filtreret prøve buffer, tør som før, og sted slide på scenen af ​​AFM (i dette tilfælde en asyl Research MFP-3D Atomic Force Microscope).
  6. Start af imaging 2 x 2 mM scanninger med 512 scan linier. Tæl antallet af nukleosomer at fastslå omfanget af satvangsægteskaber (figur 5B).
  7. Ideelt set bør du billedområder på diaset med godt adskilt nukleosom arrays.
  8. For billeder i højere opløsning, kan en 500 x 500 nm scanning opnås (Figur 5C).
  9. Billeder kan fladtrykt og analyseres ved hjælp af MFP-3D software leveret af asyl.
  10. Hvert billede kan opdeles i fire kvadranter og zoomet ind digitalt at få et klarere billede af godt adskilte arrays og flere frie hånd linjer kan trækkes gennem arrays og højde profiler opnået for nukleosomer (figur 5C, højre panel højde spor og 5D).
  11. Adskillige sådanne billeder skal analyseres for hver type matrix omfatter flere hundrede nukleosomer. Højde profiler registreres, kategoriseres og plottet i MS Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere den protokol, vi rekonstituerede nukleosomal arrays fra rekombinante Xenopus kerne histoner og DNA, der består af 12 tandem 207 bp gentagelser af 601 positioneringsforløbet (601 207 x 12). Vi først samles native octamerer fra lyofiliserede kerne histoner og renses de octamerer ved FPLC ved anvendelse af en S200 søjle (figur 1A). Større komplekser elueres tidligere fra S200 kolonne. Histoner generelt elueres i denne rækkefølge: uspecifikke histon aggregater, histon octamer, H3/H4 tetramer, og H2A/H2B dimer (figur 1A). Toppene fra S200 kolonne blev analyseret ved SDS-PAGE. Gelerne rensede octamer fraktioner skal angive ækvimolære mængder af de fire histon-proteiner (figur 1B). Bemærk, at Xenopus H2A og H2B har molekylvægte, der adskiller sig ved kun omkring 200 Da og dermed de optræder som et enkelt bånd på SDS-geler. H3/H4 tetramere og H2A/H2B dimerer vil eluere efter, men very tæt histon octamer top. Når du vælger, hvilke fraktioner til at holde det klogt at kassere fraktioner optræder mod slutningen af ​​oktamer top i kromatogrammet. Disse fraktioner kan have en øget mængde af ikke-octamer histon komplekser. I dette tilfælde fraktioner 64-67 blev puljet og gemt til nukleosomal matrix rekonstitution (figur 1).

Inden UltraScan der er to forskellige måder at se diffusionsåben korrigerede fordeling af bundfældningstanke koefficienter, der er opnået fra den forbedrede van Holde-Weischet analyse. Den røde linje repræsenterer den integreret fordeling af sedimentering koefficienter. For et givet punkt på grafen, y-aksen viser den del af prøven, der har en sedimentationskoefficient lig med eller mindre end den værdi, der er angivet på x-aksen. Således er en lodret linje, er tegn på en homogen prøve, mens en heterogen prøve vil have en kurve med positiv hældning. Den grønne linje er deafledte af integralet distribution. Arealet under en top er proportional med den del af prøven, der har at sedimentationskoefficient. Helt mættede 601 207 x 12 nukleosomal arrays har en sedimentationskoefficient på 29S 29. For prøven vist i figur 3, viser dataene, at ca 70% af grupperingerne er mættede og 30% er over mættet.

Atomic force mikroskopi er gået fra en ny teknik til en populær komplementær tilgang til at studere kromatin organisation in vitro. Her har vi brugt AFM sammen analytisk ultracentrifugering at fastslå omfanget af skabelon mætning efter rekonstitution. I figur 6 størstedelen af ~ 27S arrays (figur 4A), der anvendes til billeddannelse indeholdt 10-11 nukleosomer (figur 4B), viser glimrende aftale mellem AFM og AUC-resultater. AFM opnåede resultater her således validere dettenærme sig og gøre det til en pålidelig teknik til at karakterisere nukleosomal arrays.

Histon Protein Σ276, udfoldet Proteiner cm -1 M -1 Molekylær Vægt Da
H2A 4.350 13.960
H2B 7.250 13.774
H3 4.640 15.273
H4 5.800 11.236
Octamer 44.080 108.486

Tabel 1. Ekstinktionskoefficienter og molekylære vægte af Xenopus laevis kerne histoner og renatureret histon octamer.

Figur 1
Figur 1. A. Elueringsprofil fra S200 kolonne som beskrevet i afsnit 2.. Den lille top på omkring 44 ml skyldes store histon aggregater. Den fremtrædende toppe på 67 ml er histon octamerer. Den brede skulder 76-90 ml indeholder H3/H4 tetramere og H2A/H2B dimerer. B. 20% SDS-PAGE af udvalgte fraktioner fra S200 kolonne. Tidlige fraktioner fra octamer peak skal indsamles, da de er mindst tilbøjelige til at blive forurenet med ikke-octamer histon komplekser. I dette tilfælde fraktioner 64-67 blev samlet og gemt til nukleosomal vifte rekonstituering. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. A. ProteomeLab software skærmbillede af en enkelt scanning indsamlet ved 3.000 rpm (med labels tilføjet). Bemærk, at prøven ikke sediment ved denne lave hastighed. Den enkelt scanning bruges til at indstille den række af målinger for AUC celle scanning (trin 4.6). B. Skærmbillede af en række sedimentationshastighed scanninger opnået ved anvendelse af UltraScan programmet (med etiketter tilføjet) 26. Denne serie af scanninger er redigeret for at generere et datasæt for analyse (se trin 5.1).

Figur 3
Figur 3.. Et screen capture fra UltraScanII. De røde og grønne linjer er to forskellige metoder til visning af fordelingen af bundfældningstanke koefficienter i UltraScan. Den røde linje er en integreret fordeling af sedimentering koefficienter, mens den grønne er differentialkvotienten. Ekstra information om tolkning kan findes i afsnittet om resultater.


Figur 4.. AFM. A. sedimentationshastighed profil til 601 207 x 12 arrays samlet med muse octamer angiver den gennemsnitlige sedimentationskoefficient er 27S. B. De samme arrays i A blev afbildet ved AFM og antallet af nukleosomer talt i flere billeder blev plottet i MS Excel. Plottet viste, at et flertal af arrays havde 10-11 nukleosomer der bekræfter AUC data. C. En 500 x 500 nm scanning af 601 207 x 12 nukleosom arrays med linker-DNA klart synlige. Den øverste højre panel er amplituden spor og den midterste højre panel er den fase spor for array er vist i C. Den nederste højre panel er den samme højde spor vises til venstre, men med en fri hånd linje trukket gennem nukleosomer at bestemme højden profil nukleosoms. D. Højde profiler af de nukleosomer i ovenstående billede påvise, at alle nukleosomer spænder 1,5-2,5 nm højde som tidligere rapporteret 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Model nukleosomal arrays er et meget nyttigt redskab for in vitro-undersøgelse af kromatin struktur og funktion. For eksempel er de blevet bredt anvendt til at undersøge mekanismen for kromatin fiber kondensation i opløsning fra 30 til 34, og gjorde det muligt at finde en x-ray struktur af en tetranucleosome 35. For nylig har de vist sig nyttige i at decifrere de strukturelle effekter af specifikke kerne histon varianter, mutanter og posttranslationelle modifikationer 14-16,36. Her beskriver vi en generel metode til samling af model nukleosomal arrays fra nukleosom positionering DNA og rekombinante kerne histoner.

Rekonstituering af nukleosomal arrays fra oprensede octamerer og 601 207 x 12 DNA er ligetil, der involverer flere dialyse trin, sekventielt sænke NaCl-koncentration fra 2 M til 2,5 mm. Den sværeste del af protokollen er at bruge en r-værdi, der giver den ønskede templade mætning niveau. Den relevante R-værdi først bestemmes empirisk på en lille skala, og derefter gentaget på en større skala til at generere de nukleosomal arrays anvendes til forsøg. I vores tilfælde var vi forsøger at opnå 601 207 x 12 DNA-templates meste mættet med 12 nukleosomer pr DNA. Den sedimentationskoefficient af en fuldt mættet 601 207 x 12 nukleosomal array er 29 S, mens den samme DNA-template med kun 11 nucleosomes pr DNA sedimenter på ~ 27S 29. Således sedimentering hastighed i den analytiske ultracentrifuge giver en meget følsom metode til bestemmelse af nucleosome mætning niveau efter rekonstitution. Vi analyserede vores data ved hjælp af den forbedrede van Holde-Weischet metode, som giver en diffusionsåben korrigeret sedimentationskoefficient distribution. Denne information er afgørende, fordi det fortæller en hvordan homogen eller heterogen prøven er efter rekonstitution. Med andre ord, for en 601 207 x 12 DNA-skabelon, er detangiver den brøkdel af prøven, der har 12 nukleosomer per DNA, 11 nukleosomer per DNA, osv. Figur 3 viser resultaterne af den forbedrede van Holde-Weischet analyse af 601 207 x 12 nukleosomal arrays rekonstitueres en r på 1,1, hvor groft 30% af arrays er over mættet. Anvendeligheden af ​​prøven er normalt bundet til den procentdel af mættede arrays, men er afhængig af de eksperimenter arrays vil blive anvendt i. Nogle applikationer kan kræve meget homogene og / eller mættede arrays. En række metoder til at forbedre homogeniteten og mætning af nukleosomal arrays.

I dette tilfælde overmættede arrays kunne fjernes ved selektiv præcipitation ved tilsætning af MgCI2 37. Mere homogene matrixer kan også opnås ved at oprense prøven under anvendelse saccharosegradientcentrifugering præparativ gelelektroforese og ionbytningskromatografi 10,13. En modificeret nucleosomal vifte rekonstituering metode opfordrer til at tilføje kort konkurrent DNA til prøverne før rekonstituering gennem salt dialyse 38,39. Dette gør det muligt at samle nukleosomal arrays med et overskud af histon octamer uden over at mætte DNA-skabelonen. Nukleosomal arrays rekonstitueres med konkurrent DNA vil sandsynligvis kræve en rensning skridt til fjernelse af konkurrenten DNA og ekstra histoner.

Selv efter små pilot-array forsamlinger, er det muligt at nukleosomal arrays rekonstitueret i stor målestok ikke bliver ordentligt mættet. For at undgå at spilde template DNA og histon octamer i prøven, er det muligt at fastsætte over eller under mættede arrays. Hvis arrays er over mættet, kan ekstra DNA tilsættes til prøven. Hvis arrays er under mættet, kan ekstra octamer tilføjes at rette det. Dog kan tilføje octamer til arrays allerede dialyseret i lav salt resultere octamer dissociation. Hvis tilføje ekstra octamer eller DNA til arrays, dialysere arrays tilbage i 2 M NaCl, før du tilføjer ekstra octamer eller DNA til bulkprøven. Gentag trin dialyse for faste prøver fra høj til lav salt pr trin 3.4. Mængden af octamer at tilføje for at rette arrays kan skønnes ud fra bundfældningstanke koefficienter for under mættede arrays 29. Efter justering prøven af ​​nukleosomal arrays bør målinger af mætning niveau ske igen.

Mens AFM er en kraftfuld metode til karakterisering nukleosomal arrays, det er kompliceret, og en arbejdskrævende proces. Dette gør det en dårlig teknik til screening lille skala rekonstitutioner, men en fremragende teknik til karakterisering af store prøver og for studiet af kromatin organisation. Tidligere har vi brugt AFM til at visualisere "makro"-partikler genereret af en macroH2A deletionskonstruktion der var "hyper-responsive" til selv lave MgCl2 koncentrationer. Likewise Montel et al. (2009) har vist, at H2A Bbd variant forårsager nukleosom arrays til at være mere "åben" i forhold til vildtype-arrays. Derfor AFM er en pålidelig teknik til kvalitetskontrol, samt til undersøgelse af kromatin fiberstruktur i almindelighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud GM45916 og GM66834 til JCH og et stipendium fra den internationale Rett Syndrom Foundation til AK Dette arbejde blev også støttet af NIH tilskud GM088409 og Howard Hughes Medical Institute bidrag til KL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Tags

Cellebiologi Kromosom Konstruktioner kromatin nukleosomer Histoner Microscopy Atomic Force (AFM) biokemi kromatin nukleosom nukleosomal Array histon Analytical Ultracentifugering Sedimentation Velocity
Montering af nukleosomal Arrays fra rekombinant Core Histoner og nukleosom Positioning DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A.,… More

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A., Muthurajan, U. M., Porter-Goff, M. E., Luger, K., Hansen, J. C. Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA. J. Vis. Exp. (79), e50354, doi:10.3791/50354 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter