Summary
Vi rapporterer om en effektiv og enkel metode for å isolere embryoer på tidlige stadier av utviklingen fra
Abstract
I blomsterplanter, utvikler embryo innenfor en nærende vev - den endosperm - omgitt av mors frø integuments (eller frø pels). Som en konsekvens, er isolering av anlegget embryoer på tidlige stadier (en celle til globulær stadium) teknisk utfordrende på grunn av deres relative utilgjengelighet. Effektiv manuell disseksjon på tidlige stadier er sterkt svekket av den lille størrelsen av unge Arabidopsis frø og klebrighet embryoet til omkringliggende vev. Her beskriver vi en fremgangsmåte som tillater effektiv isolering av små Arabidopsis embryo, noe som gir opp til 40 embryoer i 1 time til 4 timer, avhengig av den anvendelse nedstrøms. Embryoet blir sluppet ut i isolasjon buffer med litt knusing 250-750 frø med en plast stampe i en Eppendorf tube. Et glass microcapillary festet til enten en standard laboratorium pipette (via en gummislange), eller hydraulisk microinjector brukes til å samle embryoer fra dråpene plassd på en multi-brønn glir på en invertert lysmikroskop. De tekniske ferdigheter som kreves er enkle og lett omsettelige, og grunnleggende oppsett krever ikke kostbart utstyr. Innsamlede embryoer er egnet for en rekke nedstrøms applikasjoner som RT-PCR, RNA sekvensering, DNA-metylering analyser, fluorescens in situ hybridisering (FISH), farging og reporter gen analyser.
Introduction
Embryo av blomstrende planter er omgitt av stivelse, en næringsverdi vev avledet fra en annen befruktning hendelsen. Både embryo og endosperm er omgitt av flere cellelag av frøhylsteret. Kollektivt disse vev danne et frø, som utvikler seg inni frukten. Dermed er vev-og celle-spesifikke analyser av Arabidopsis embryoer sterkt svekket på grunn av sin utilgjengelighet. Likevel, embryo på de sene globular eller senere stadiene er relativt godt mottagelig for manuell disseksjon ved å bruke fine Tungsten nåler under stereomikroskop, eller ved å trykke lett på frøet med tang for å pakke dem ut. Slike teknikker ble brukt med hell for transcriptome eller epigenome profilering analyser som microarray hybridisering, bisulfite sekvensering, eller RNA-sekvensering (f.eks 1-3). I kontrast, studier av embryo ved zygote til tidlig globular stadium forbli teknisk utfordrende. Til dags dato, bare noen få studier har reported transkriptom analyser på unge embryo ved hjelp av enten laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) av embryonale vev fra faste frø § § 4 eller manuell ekstraksjon av individuelle embryoer fra innen frø med gode verktøy fem. Imidlertid er LCM utstyr ikke allment tilgjengelig og manuell embryo utvinning på tidlige stadier er tidkrevende og krever gode disseksjon ferdigheter som ikke er lett omsettelige. I tillegg til genome-wide analyser, in situ genuttrykk analyser er også vanskelig å utføre på unge, hel-mount embryoer fra Arabidopsis. Til en viss grad, kan unge embryo bli utgitt på objektglass ved forsiktig press på frøene og brukes til reporter gen analyser eller protein deteksjon ved farging (se for eksempel 6,7). Denne teknikken er imidlertid ikke tillater høy gjennomstrømming embryo isolasjon, og dermed hindrer kvantitative analyser.
Derfor har vi utviklet en effektiv og rask protokollfor tidlig embryo isolasjon fra Arabidopsis frø som er enkel å sette opp, lett omsettelige, og egnet for en rekke nedstrøms applikasjoner. Det grunnleggende prinsippet er å forsiktig knuse frøene - dissekert fra unge siliques i en Eppendorf rør ved hjelp av en plast stampe i en passende isolasjon buffer. Frøet pakke er plassert i dråper på en multi-brønn lysbilde og er skjermet for tilstedeværelse av frigjorte embryoer på ønsket tidspunkt ved hjelp av et invertert mikroskop. Embryoene er samlet ved hjelp av et glass microcapillary festet til en microinjector eller en standard laboratorium pipette. For molekylære programmer, er embryoer vasket to ganger etter gjentatte utslipp til dråper ny isolasjon buffer før du overfører dem til bestemmelsesstedet buffer i et minimalt volum. For cytologiske applikasjoner (reporter analyser, farging, fisk), kan vasketrinnene utelates.
Metoden gir flere fordeler: (i) det gir 25-40 embryoer i ~ 45 min for cytologisk applications eller i 3-4 timer for molekylær applikasjoner (inkludert vaske trinn), (ii) det tillater isolering av spesifikke embryonale stadier, (iii) det er lett overførbar til andre personer og laboratorier på grunn av sin enkle oppsett, (iv) det krever rimelig utstyr for den grunnleggende konfigurasjon som er mottagelig for oppgradering, og (v) det ble med hell brukt for ulike nedstrøms applikasjoner som RNA 8 sekvensering, gen-spesifikke DNA-metylering analyse 9, reporter assays (10 og Raissig et al. in prep.) og FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux upublisert, se figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåten er oppsummert i flytskjemaet vist i figur 1.. Den microcapillaries og den instrumentelle oppsettet er vist i figur 2 og figur 3, og typiske fremgangsmåten for embryoet isolasjon er vist i figur 4..
En. Materiale og Buffer Klargjøring
1.1 Silicon belegg av glass microcapillaries
- Plasser microcapillaries i et 15 ml Falcon rør med ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) og invertere flere ganger.
- Ta løsningen, plasserer Falcon røret som inneholder kapillærer i en aluminiumfolie og bake dem i 3 timer ved 60 ° C. Oppbevar ved romtemperatur.
1.2 Skaffe ~ 50-100 mikrometer diameter microcapillary tips
- Trekk en mm-diameter glass kapillærer enten manuelt over en gassbrenner eller ved å bruke en kommersiell avtrekker (vertikal glødetråd avtrekker eller mikropipette avtrekker).
- Bruk en diamant-spiss eller penn blad for å kutte spissen av den kapillære trukket å skape den ønskede åpning. Velg det beste-formet blodårer under en stereo mikroskop. Åpningen bør være 50-100 um (figur 2).
1.3 Slide forberedelse
- Siliconize rene lysbilder ved å dekke alle brønnene med Sigmacote (~ 1 ml / lysbilde) for 5 min, fjerne. Bake 3 hr i aluminiumsfolie. Oppbevar ved romtemperatur.
- Vask flerbrønns glass mikroskopiske objektglass i 10 min i 10% SDS, 2 x 2 min i nuclease-fritt vann (autoklavert DEPC-DDH 2 O), 2 min i 70% etanol, 2 min i 100% etanol, luft- tørke. Alle trinnene er gjort i autoklaveres Coplin krukker. Lysbilder kan brukes om igjen flere ganger gi grundig rengjøring mellom hver bruk.
- Like før embryoet isolasjon spredning ~ 0,5 pl av 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) med en pipette over hele flaten av hver brønn og luft-tørk.
1.4 mikroskop og kapillær setup
<ol>1,5 buffere
Tabell 1 viser isolering og destinasjon buffere avhengig nedstrøms applikasjoner.
- Forbered ~ 1 ml isolasjon buffer per prøve nystekte før bruk og oppbevar den på is.
- Forbered målbufferen i en 0,5 ml Eppendorf lav-bindende tube på is (molekylære applikasjoner) eller på et objektglass (cytologiske applikasjoner) i et fuktig kammer.
2. Seed Dissection og Embryo Extraction
2.1 Synkronisering av Seed Development
- Kastrere blomster og holde dem to dager i veksten kammeret samtidig unngå kontakt mellom de eksponerte støvbærere med andre blomster, så pollinere dem (f.eks 11).
- Test utviklingstrinn under din vekstvilkår ved mikroskopisk undersøkelse av ryddet frø. Med våre vekstvilkår (16 hr lys ved 21 ° C, 8 timers mørkt ved 18 ° C og 70% luftfuktighet) frø samlet inn 2,5 dager etter pollinering (DAP) ga i hovedsak 2-4 celle embryoer og frø samlet inn 3,5 til 4 DAP ga kuleformet embryoer.
2.2 Seed Dissection og Rupture
- Fjerne seeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) under en stereomikroskop med pinsett og insulin nåler.
- Fordype frøene i 20 ul isolasjon buffer i en 2 ml rund bunn Eppendorf rør plasseres på is.
- Forsiktig knuse frøene med en plast stampe (pre-rengjøres med 10% SDS, skylles med DEPC-DDH 2 O og vasket med 70% etanol) for å frigjøre embryoene til seedet pakke er overskyet. Kraften til å søke er å bli bestemt av hver bruker på rettssaken.
- Skyll stampe med 300 mL av isolasjon buffer å vaske støter og fortynne prøven.
- Spin-down ekstraktet ved 5000 xg i 5 sek. Forsiktig resuspender pelletert ekstrakt ved pipettering opp og ned 2-3 ganger.
- Filtrere ekstrakt med en 30 mikrometer nylon mesh (montert på tube adaptere, for eksempel fra PartecCelltricks). Skyll mesh med en ytterligere 200 ul buffer isolasjon.
3. Embryo Isolation
3.1 Slide forberedelse
- <li> Sett en ren, BSA-belagt og silikonisert multi-brønn skyv på scenen av invertert mikroskop, resuspender filtrert frø ekstrakt ved pipettering forsiktig opp og ned og pipette to dråper av 40-50 ul seedet pakke inn en eller to brønner . Screening bare 1 eller 2 dråper på et tidspunkt hindrer fordampning av prøven.
- Plasser 50 pl frisk buffer isolasjon (1 st vask dråpe) i en brønn med et annet lysbilde fremstilt som før. Hold dette lysbildet i en overbygd, fuktig kammer for å hindre fordamping.
3.2 Screen, rense, samle
- Skjerme dråper av frø ekstrakt for embryoer på ønsket scene med 10x forstørrelse målet. Bekreft om nødvendig scenen med 20x forstørrelse. Embryoene vanligvis synke til bunnen av lysbildet.
- Manuelt fjerne rusk rundt embryo med en tungsten nål, en insulin nål eller lignende utstyr.
- Flytt glasskapillær nær embryo med micromanipulator, tAKE opp embryoet med så lite som mulig løsning.
- Samle flere embryoer (f.eks alle av en dråpe) og slipp dem i en st vask dråpe (molekylær program) eller i målbufferen (cytologiske programmer). Hver samle rund bør holdes i løpet av 5-10 minutter og befruktede egg bør samles opp i et minimalt volum (det totale volum av alle samle runder skal være <5 ul).
- Gjenta screening og innsamling til ønsket mengde av befruktede egg er samlet i en st vask dråpe (sentralt, om mulig, å legge til rette for erindring).
- Minnes alle embryoer på en gang fra vaske slipp (hvis rusk blir med videre, fjerne dem med en nål før erindring).
- Slipp embryoene inn i en 2 nd vask dråpe 50 pl. Gjenta pkt. 3.2.6.
- Slipp embryoene i målbufferen. Overføringen bør involvere bare en kontakt, og ikke nedsenking, av kapillær tips.
- Erstatte microcapilLary for den neste prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår embryo isoleringsprosedyre (figur 1) gjør det mulig for isolering av inntil 40 embryoer i 4 timer hvis vaskinger blir utført, for eksempel for molekylær applikasjoner, eller i mindre enn en time hvis vaskinger er utelatt, for eksempel for cytologiske anvendelser. Figur 2 viser høy og lav kvalitet microcapillary tips og Figur 3 viser oppsettet av embryo isolasjon maskin. Figur 4 viser prosessen med embryo isolasjon på invertert mikroskop.
Vi hell brukt vår prosedyre for ulike applikasjoner publisert i flere nyere artikler. Metoden ble opprinnelig utviklet for å analysere foreldrenes bidrag til tidlig embryonal transcriptome. Hybrid embryoer som genereres gjennom krysser mellom to forskjellige Arabidopsis tiltredinger (Landsberg erecta (L er) og Columbia (Col-0)) ble isolert på 2-4 celle scenen. Total RNA ble trukket ut, cDNAbibliotekene ble produsert ved hjelp av lineær forsterkning og sekvensert på en solid plattform. De allel-spesifikke transcriptomes ble generert basert på SNP analyse 8.. Å kontrollere våre embryonale cDNA biblioteker før sekvensering vi forsterket embryo-spesifikke transkripsjoner, 2 WUSCHEL-homeobox, 8 og 9 (WOX2, WOX8, WOX9) og ACTIN 11 (13,14, figur 5A).
I tillegg ble denne metoden anvendt for isolering av små embryoer for å analysere de embryonale DNA-metylering mønstre ved bestemte geometriske steder i genomet. Embryoer ble isolert og vasket i 1x TE-buffer. Småskala bisulfite sekvensering ble utført som beskrevet 9,15.
Tilsvarende har embryo isolasjon vist seg svært nyttig i reporter gen analyser med lav embryonale uttrykk, og der mors frø pels forundrer påvisning eller er maskert av reporter uttrykk i vevet som omgir fosteret (endosperm, frø pels). Embryoer carr ying reporteren transgene er farget (ß-glucuronidase; GUS) eller direkte analysert (grønn eller rød Florescent Protein, GFP, RFP) etter isolasjon. Et eksempel er gitt i figur 5B for embryoer som uttrykker GUS et reportergen under kontroll av den MEDEA promoteren (p MEA) 10. Den relativt enkle som mange embryoer kan isoleres gir også mulighet for kvantitative analyser (for eksempel antall embryoer farget i ulike genetiske bakgrunn, Raissig, Grossniklaus et al. Under forberedelse).
Til slutt, vi får brukt Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH) og farging teknikker for å studere kjernefysiske arkitektur i isolerte embryoer innebygd i akrylamid pads på lysbilder. Et eksempel på FISH bruke prober mot Centromere gjentar og nucleolar organisering regioner er vist i figur 5C.
En "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
Figur 1. Flytskjema over embryo isolasjon prosedyren Protokollen er delt i tre deler: 1 - Materiale forberedelse, 2 - Seed disseksjon, 3 - Embryo isolasjon..
Figur 2. Microcapillary tips. A. Høy kvalitet microcapillary tips med en jevn åpning på rundt 100 mikrometer. B. Lav kvalitet microcapillary tips med bredere åpning og uregelmessig kontur (disse tipsene er akseptabelt for cytologiske applikasjoner). Scale bar: 2 mm.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Figur 3. Satt opp av embryoet isolasjon mikroskop. A. og B. Screening er utført på objektglass under en invertert mikroskop. Befruktede egg er samlet ved hjelp av en glass microcapillary festet på en mikromanipulator for å presist kontrollere dens stilling (se også figur 4) og knyttet til enten et microinjector (A) eller standard laboratorie-pipette (B). A. Glasset microcapillary er knyttet til en hydraulisk kontrollert microinjector (f.eks Eppendorf Cell Tram Vario) for en nøyaktig kontroll under embryo samling B. Glasset microcapillary er festet til en standard P-200 pipette med en gummistropp flex rør. Embryo innsamling og utgivelse styres ved å vri på kalibrering hjulet av pipetten. Cut-end pipettespisser brukes som kontakter og overgangene er forseglet med parafilm. The microcapillary er fast på micromanipulator via isopor blokker, Falcon rør og tape.
Figur 4. Embryo isolert prosess. A. A 2-4 cellers embryo (pil) ble identifisert i seed extract (screening dråpe) og er omgitt av vrakgods (seed coat fragmenter). B. omkringliggende gjenstander ble fjernet manuelt ved hjelp av en nål. C. Glasset kapillær ble flyttet rett ved siden av embryo (pil). D. Embryoet ble samlet inn og er nå innenfor kapillær (pil). E. Flere embryo i den siste dråpe etter vask. Skala = 50 mikrometer.
F igur 5. Nedstrøms anvendelser av embryo isolasjon A. genuttrykk analyser:. PCR forsterkning av WOX9, WOX2, WOX8 og ACTIN11 13,14 på cDNA biblioteker (generert som beskrevet 8) 2-4 celle embryo vasket 1x ganger (første felt), og på genomisk . DNA (andre felt) B. Reporter analysen: Et 8-cellers embryo isolert fra planter bærer ap MEA :: GUS konstruere var farget på et lysbilde i en standard GUS flekker løsning (gjengitt fra Raissig et al, 2011 etter tillatelse fra. Plant Cell, ASPB copyright). C. Fluorescent In-Situ Hybridisering (FISH): en 8-cellers embryo ble hybridisert med prober mot centromeric repetisjoner (rød), og 45S rDNA gjentar (grønn) før indirekte immunodetection 16. Den tofargede FISK bildene ble kledde med DAPI kontrafarging og DIC bilder (DM6000B epifluorescence mikroskop, Leica, Tyskland).
| Søknad | Isolasjon buffer | Målbufferen |
| RNA ekstraksjon (f.eks for forsterkning og transcriptomics) | 1x First-Strand buffer (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | RNA ekstraksjon buffer |
| DNA-ekstraksjon (f.eks for bisulfite sekvensering) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA-ekstraksjon buffer eller 1x TE buffer |
| GFP reporter analyse | 1 M glycin i 0.5x MS 1 | 1 M glycin i 0.5x MS |
| GUS reporter analyse | flekker buffer to uten X-Gluc (substrat) | farging buffer med X-Gluc (substrat) |
| FISK & farging | 100 mM fosfatbufret saltvann (PBS) | aktivert Akryl: Bisacryl mix (33:3) på en Superfrost Plus slide-polymerisere i 30 min |
Tabell 1. Isolation ankomststed buffere for ulike nedstrøms applikasjoner. Bufferne kan tilpasses spesifikke eksperimentelle krav. En Murashig & Skoog medium. 2 f.eks Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet et embryo isolasjon protokoll som er rask, effektiv, og kan enkelt overføres til andre laboratorier.
Utstyret som beskrives her, består av et invertert mikroskop, en mikromanipulator, glass microcapillaries, en vertikal filament avtrekker og en microinjector (figur 3A). Oppsettet er lik den som er beskrevet for enkelt dyr celleisolasjon for transcriptomics analyser 17. Vi har også lykkes i arbeidet med en mer grunnleggende oppsett der glass microcapillaries ble manuelt strukket over en flamme (og kuttet med en diamant-blad) og drives via en standard laboratorium pipette (Pipetman P-200) i stedet for en microinjector (Figur 3B). I så fall microcapillary var festet til pipette via en gummislange. 10 mL filtertips ble brukt til å gjøre veikryss, som ble pakket med parafilm å gjøre dem lufttett. Kapillæret - holdt av pipette tips - ble festet på micromanipulator arm ved hjelp av isopor blokker og tape (Figur 3B). Denne grunnleggende oppsett viste seg å være effektiv og pålitelig åtte. Likevel var en av de største vanskelighetene å opprettholde av luft-tett veikryss mellom microcapillary og pipette, spesielt når du endrer kapillær. Kontrollere og justere trykket i kapillær - for å sikre en finjustert embryo samling i et minimalt volum - kan være tidkrevende å bruke denne grunnleggende oppsett. Den forbedrede oppsett med en hydraulisk styrt micromanipulator og en vertikal glødetråd avtrekker er en betydelig forbedring og sparer tid.
De ferdigheter som kreves for vellykket bruk av denne metoden er lett omsettelige. Fem brukere i vårt laboratorium med hell lært metoden i løpet av relativt kort tid. Noen forenklinger av protokollen er mulig, avhengig av brukerens letthet i manipulasjon. For eksempel er det mulig å hoppe over trinn 2.2.5 og 2.2.6, mensdissekere bare 5 siliques (i stedet for 15) og rengjøring av embryo omgivelsene grundig for rusk med en tungsten nål (denne prosedyren ble brukt i 8). Synkronisering av frø utvikling gjennom emasculation og forsinket pollinering er fakultativ, men anbefales å øke antall embryoer på samme utviklingsstadiet, særlig på tidlige stadier. I tillegg kan embryoet isolasjon fremskyndes hvis vasketrinnene er utelatt, for eksempel for cytologiske anvendelser. Videre er lysbilde siliconization (trinn 1.3.2) ikke nødvendig for brukere som jobber raskt, er slik at embryoer som klistrer seg til glasset overflaten over tid ikke et problem.
Enten filtrering eller manuell rengjøring er brukt, er det ekstremt viktig å unngå overheng av vev rusk som skaper potensiell forurensning nedstrøms RNA eller DNA-applikasjoner. Dette problemet ble tatt opp nylig i en transkriptom profilering studie ved hjelp av en annen metode for embryo isolasjon18. I motsetning til mesteparten embryo isolasjon protokollen beskrevet her, forfatterne dissekert Arabidopsis embryoer manuelt innenfra individuelle frø med fine nåler, en lang prosedyre som krever gode disseksjon ferdigheter. Denne prosedyren tilsynelatende kreves to eller flere vasker for å unngå overheng av mulige forurensende celler fra omkringliggende frø vev, en situasjon sannsynligvis støtt når du bruker denne metoden gitt den lille størrelsen av embryoene, vanskelighetene med å få tilgang dem med disseksjon nåler, og adhesiveness av omkringliggende celler. I motsetning til dette tillater vår fremgangsmåte (i) fortynning av embryoene-ekstrudert fra frøene ved knusing og omkringliggende gjenstander i et stort volum (500 ul) før fosteret samling, (ii) den visuelle utvalg av embryoer blottet for klebemiddel, forurensende rusk, og (iii) fortynning av mulig forurensning RNA-lekker fra brutte celler-ved vasketrinnene. Mens det er mulig å bruke bare ett vasketrinn dersomembryoer vises veldig ren og er samlet i mindre enn 5 pl 8, en andre vask trinnet er anbefalt, spesielt for første gang brukere som kan samle embryoene i flere runder (dvs. med additiv volum). Embryoer bør samles i så lite som mulig løsning, slik at den maksimale fortynning av mulige forurensninger i hvert vasketrinn. Hver samle runde bør holdes kort (innen 5-10 min) for å tillate maksimal utvinning ved løslatelse i vask dråpe (lengre tilstedeværelse i kapillær tendens til å redusere utvinningsgraden). Videre bør overføring av de innsamlede embryoer i ekstraksjonsmediet (ved å følge vasketrinnet) bare involverer en kontakt med åpningen av den microcapillary spiss og ikke nedsenking av spissen, da dette kan like godt overføre rusk stikker på den microcapillary vegg ovenfor åpningen. Endelig bør kapillær endres mellom hver ny seed extract.
Vår protokollen åpner for flere nedturerTREAM applikasjoner ved å bruke en passende isolasjon buffer som bevarer molekylær integritet av RNA, DNA, kromatin, enzym eller fluorescerende reporter. Vi lyktes i å isolere embryoer i RNA-beskyttelsesadskillelse buffer for RNA ekstraksjon og transcriptomics analyser 8, 1x TE-buffer for DNA-metylering analyser 9, 100 mM fosfat saltløsning (PBS) for fisk og farging (Jaenisch, Grossniklaus og Baroux, upublisert, figur 5C), og beising løsning uten substrat for GUS reporter assays (19, figur 5B). Søknaden mest følsomme for isolasjon vilkår / embryo kvalitet er RNA absolutt utvinning og forsterkning. Mengden av ekstrahert RNA fra isolerte embryoer var ganske lav. Fra ~ 30 embryoer på 2-4 cellestadiet (dermed 60-120 celler totalt) vi anslått et beløp på ~ 1NG av total RNA basert på både Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) og Qubit (Invitrogen) målinger. Følgende områderng RNA ekstraksjon, ble RNA kvalitet bekreftet på en Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Imidlertid er den lave mengden av RNA ekstrahert ikke alltid tilstrekkelig til å gi en pålitelig profil. Dermed må flere tester gjøres på den forsterkede materiale (cDNA) (f.eks PCR påvisning lav-uttrykt, embryo-spesifikke gener og / eller en Bioanalyzer profil).
Til slutt, er evnen til å isolere embryoer av visuelle kriterier i protokollen vår en stor ressurs. Embryoer fra samme silique (Arabidopsis frukt) utvikler ikke synkront. Dermed gjør jobber med hele silique ekstrakter (f.eks for RT-PCR-analyser eller kvantitative reporter analyser) ikke tillate en perfekt korrelasjon med en gitt utviklingsstadiet. Isolere embryoer på et bestemt utviklingsstadiet løser dette problemet. I tillegg presenterer et lignende problem når du arbeider med heterozygote mutanter der siliques inneholder forskjellige embryo genotyper. Isolere embryoer basert på visuelle kriterier til distinguish f.eks vill-type fra mutant embryo fenotyper kan samkjøre nedstrøms analyser med genotype. Vi har gjort dette med hell å analysere DNA metylering ved bestemte loci i ulike genotyper 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Tal Nawy og Martin Bayer for sine råd om embryo isolasjon. MTR, VG, UG og CB utviklet embryo isolert utstyr. MTR, VG og CB utviklet embryo isolasjon protokollen. MTR, VG og CB etablert protokollen, isolert embryoene, og genererte embryo cDNA, VG utførte PCR, MTR den GUS flekker, JJ fisken eksperimenter. MTR, VG, CG og UG skrev manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Zürich, en Brorskap Roche Research Foundation (til MTR), og tilskudd fra den sveitsiske National Foundation (til UG og CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
