Summary
我们描述一个可重复的方法准备从小鼠小鼠胰腺腺泡细胞研究生理和病理相关刺激腺泡细胞钙信号和细胞损伤的目的。这些细胞中腺病毒感染的方法也被提供。
Abstract
胰腺外分泌胰腺细胞是主要的实质细胞，进入胰管和胰腺酶的分泌起着主要作用。这也是网站发起胰腺炎。在这里，我们介绍了如何腺泡细胞分离从整个胰腺组织及细胞内钙信号的测量。此外，我们描述的技术，与腺病毒构建体转染这些细胞，并随后测量乳酸脱氢酶，细胞损伤的标志物的泄漏，以及在体外诱导腺泡细胞损伤的条件。这些技术提供了强大的工具来表征腺泡细胞生理和病理。
Introduction
胞内钙离子的动态变化是必要的生理和病理腺泡细胞事件。这些不同的效果被认为是导致钙从不同的空间和时间模式的钙信号1。例如，从腺泡细胞分泌的酶和流体与钙尖峰其中分泌发生根尖极受限制的区域。与此相反，一个全球性的钙波强烈的非振荡钙信号与早期导致急性胰腺炎3,4的病态事件。这些措施包括腺泡内的蛋白酶激活酶的分泌减少，腺泡细胞损伤。我们的实验室使用孤立的胰腺腺泡研究这些早期病理事件，导致疾病在体内和体外 5-7。这里详细描述的方法为目的的测量CY隔离主要腺泡细胞tosolic钙水平和细胞的损伤。这些细胞中腺病毒感染的方法也被提供。
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Protocol
1。准备胰腺腺泡细胞钙成像
- 准备HEPES孵育缓冲液含有20mM的HEPES，95 mM氯化钠，氯化钾4.7毫米，0.6毫米MgCl 2，1.3毫米的 CaCl 2，10mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，1×最小的Eagle培养基非必需氨基酸。调整最终的pH值至7.4，用NaOH溶液。
- 准备一个BSA孵育缓冲液，HEPES培养缓冲液（如上所述），以25毫升，加入牛血清白蛋白（1％w / v的末期）。
- 准备胶原酶消化缓冲液中，加入1.1毫克/毫升（200单位/毫升）-4型胶原酶和1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂的6毫升BSA孵育缓冲液（如上所述）。
- 两部分硝酸和盐酸2小时的一部分浸渍酸洗22x22毫米的盖玻片。然后倒出使用去离子水并存储在70％的乙醇。
- CO 2窒息安乐死一个鼠标。东方动物在仰卧位，并准备在腹部表面由CLE70％乙醇aning。进行剖腹探查，腹腔暴露。胰腺解剖，在一个小的权衡船含胶原酶消化缓冲液6毫升，立即用清水冲洗。
- 解剖任何大块的脂肪或可见血管，然后取出5毫升胶原酶消化缓冲液，并将其重新添加到15毫升锥形管。
- 使用精细解剖剪刀切末胰腺小称量船胶原酶消化缓冲液含1毫升。剁碎，直到所得的溶液均匀地分散。
- 碎的产品转移到一个125毫升的锥形塑料烧瓶中，然后加入剩余的5毫升胶原酶消化缓冲液的容器中。确保组织被完全淹没在缓冲区。
- 将烧瓶放置在37℃水浴中，振摇30分钟90转。在这短短的停机时间，准备钙激活受体激动剂（ 如蛙皮素，卡巴）和冲洗22x22毫米酸洗盖DI水单。干燥，然后放置在平坦的表面上的顶部的实验室膜内衬。
- 30分钟的消化完成后，转让暂停回来到15毫升锥形管，使细胞定居。小心吸取胶原酶消化缓冲液和更换BSA孵育缓冲液6毫升。管用手大力摇晃，持续10秒，以使细胞分散成更小的簇。摇晃时立即删除任何大，漂浮物从悬而未决的媒体。
- 允许剩余的细胞来解决，新鲜BSA孵育缓冲和交换媒体。
- 重复步骤1.11两次，直至吊销只有细微到肉眼可见的小群组成。细胞应类似于图1A中所示的（顶行）。
- 删除了BSA的孵育缓冲和更换与HEPES孵化缓冲。
- 准备一个750微米，100X股票氟上午04时，在10％DMSO。
- 将细胞在15毫升锥形管中，将细胞悬浮液和无BSA-HEPES孵育缓冲液。要做到这一点，添加合适的音量（1:100稀释）的原液细胞悬液。然后板500微升这种悬挂到每一个22x22毫米盖玻片。
- 在室温下，在黑暗中保持盖玻片。以第一的Ca 2 +测量30分钟后加载。染料被自动起动时的灌注，发生30分钟后，染料吸附量，从培养基中除去。
2。测量胰腺腺泡细胞钙
- 用DI水冲洗每个灌注设置，并用适量的缓冲或激动剂。总理缓冲区或激动剂每个注射器，以确保适当的流量。夹注射器环站约1-2英尺以上的显微镜阶段。
- 用细镊子仔细掌握其边缘盖玻片含细胞悬液。盖倾斜滑45°，让多余的缓冲地跑了出去。顶部的橡胶垫圈与盖玻片上的细胞的盖玻片放置，装配腔（ 图2A和2B）。
- 灌注室固定在舞台上，并插入油管包含缓冲室进入第一入口（ 图2C）。将含有缓冲液的注射器上，并允许缓冲液灌注在整个表面上的盖玻片。一旦缓冲区已达到的腔室的另一端，插入了真空线到真空进样口。任何其他管（含激动剂，抑制剂等 ）插入到相应的位置沿室。
- 可视化的细胞，使用一个200X或400X，1.4数值孔径的目标和氩激光激发萤光上午04时的染料，在波长为488 nm（ 图1A，下图）。的激光的功率设置应进行调整，使光电倍增管（PMT）是不饱和的发射光。此外，PMT的两端的电压，需要进行优化，以最大的光检测。
- 大于515 nm的长通的发射信号被收集在帧速度为2-5秒/帧的可视化用于可视化的速度，全球钙波（ 图3和4）的缓慢振荡模式和0.2-0.3秒/帧。
- 成像完成后，关闭注射器和删除所有的管子。拆卸室，并重复步骤2.2-2.4。
- 荧光强度随着时间的推移和转移到图像J的数值（由美国国立卫生研究院免费提供的软件包，可以发现在http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）收集数据。
- 查看实时蜂窝图像识别地区的利益（投资回报， 即心尖，基底核等 ）
- 采集荧光强度，这些投资回报率和represent荧光强度/基线荧光强度（ 即 F/F0）的。
- 通过绘制F / F 0与生成描时间。除了描记，代表图像通常使用伪显示。
3。胰腺腺泡细胞制备细胞损伤分析
- 暖DMEM F-12媒体（不含酚红）至37°C。
- 添加BSA（0.1％w / v的末期），和HCl（50μM最终）的DMEM F-12介质中。
- 50毫升的DMEM培养液分装成一个圆锥形管。
- 准备一个缓冲区胶原酶IV型胶原酶0.5毫克/毫升（12单位/毫升），加入10毫升补充的DMEM F-12介质。
- CO 2窒息安乐死一个鼠标。东方动物在仰卧位，并准备用70％乙醇清洗腹部表面。进行剖腹探查，腹腔暴露。胰腺解剖，并立即用清水冲洗，一个小称量船Çontaining 6毫升胶原酶缓冲区中。
- 剁碎组织使用精细解剖剪刀3-5分钟或直到出现所得溶液均匀地分散。
- 碎组织转移到一个125毫升的锥形烧瓶中加入额外的的胶原酶缓冲区，然后将用5毫升到37℃水浴中振荡5分钟，以90 rpm。
- 从摇床中删除，使细胞简要定居，并交换用5毫升的新鲜胶原酶缓冲。然后孵育一个额外的35分钟，在37℃水浴振荡在90转。
- 大力悬浮消化，用移液管停牌，直至出现均匀无明显的细胞团块。然后轻轻移液管将细胞悬浮液通过一个预湿的尼龙网丝成锥形瓶中。
- 大力吸取额外的3毫升新鲜的DMEM F-12介质（用胶原酶），通过网孔，，以迫使任何剩余的细胞通过。
- 添加另一个6-10毫升的DMEM F-12媒体和LLOW细胞下沉2-3分钟。重复此步骤两次，最后一次洗涤后，去除上清。
- 新鲜的DMEM F-12介质，悬浮细胞，和板500μl的细胞悬浮液添加到48孔组织培养板的各孔中。的细胞应类似于图1B中所描述的那些。
- 允许坐板在37℃水浴90转5分钟，然后再添加激动剂。
- 刺激细胞不同激动剂2-4小时。
- 倾斜板成一角度，以使细胞沉淀，并仔细吸取介质（通常为100微升）的等分试样和闪光灯在液氮中冷冻。
- 闪光冻结剩余的细胞悬液。闪光冻结是没有必要为LDH测量。作为一种替代的样品可以保存在冰中，如果他们将被测定的当天，或储存在-20℃下长期贮存。
4。测量乳酸脱氢酶泄漏
- 每瓶12毫升测定缓冲液（试剂盒中提供的），乳酸脱氢酶（LDH）衬底（亦提供）。
- 解冻冷冻的细胞悬浮液和培养基样品在室温下在水浴中。
- 板50微升在96 - 孔板的每一个媒体样本。
- 在细胞悬浮液中，添加必要的10倍体积的裂解缓冲液，使最终浓度为1X。轻轻振荡后，在37℃60分钟。
- 溶解的样品在250×g离心4分钟，沉淀细胞碎片。
- 对于细胞裂解物，板加入50μl1:10稀释到96孔板的各孔中。
- 重组后的基板向每孔中加入50μl，在室温下在黑暗中孵育板30分钟。
- 停止反应，终止液（在试剂盒提供），向每孔加入50μl。
- 测量在490nm处的吸光度。
- 使用下列公式计算％LDH漏出。减去一个空白的OD值的读数从一个仅含有PBS中，衬底的下面的光的密度进行校正，并停止溶液。
LDH媒体=（OD492媒体）×（媒体稀释倍数）×（第一卷媒体）*由于它通常是不必要的媒体样本稀释，稀释因子将最经常equal1的。
总LDH =（（裂解液OD 490）×（裂解液稀释倍数）×（第一卷细胞悬液））+（（媒体外径490）×（稀释倍数）×（分装取样媒体第一卷））
5。胰腺腺泡细胞感染腺病毒
- 准备胰腺腺泡细胞在第3节。
- 步骤3.12，新增10 7传染性单位（IFUs）的腺病毒的细胞悬液孵育30分钟，在37°C
- 均匀板2 ml的细胞悬液，在6孔板中。
- 对于大多数表达结构，细胞应充分感染18小时内和一些荧光素酶的结构，只是在6小时内。
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Representative Results
腺泡细胞钙测量的生理刺激的反应的一个例子在图3中提供。腺泡细胞钙装有染料和荧光4灌注乙酰胆碱模拟氯化氨甲酰胆碱（CCh的1μM））8。细胞的反应中的钙波的形式，从而启动在顶端区域，并传播到在基底外侧区域3,9。 如图3B中所示的代表轨迹的呈现出的典型的峰值高原通常观察1μM的氯化氨甲酰胆碱的图案。相反，使用次最大剂量的胆囊收缩素类似物蛙皮素（晚上10点）产生振荡钙反应（ 图4）10。
胰腺炎诱导受体激动剂腺泡细胞的LDH漏出量， 如图5所示。在这里，我们展示了雨蛙，卡巴，或t的存在浓度依赖性增加LDH漏出他胆汁酸taurolithocholic的酸-3硫酸钠（TLCS）。诱导最大LDH漏出所需的浓度是一致的与那些需要诱导腺泡内蛋白酶激活和病理钙信号，表明这些事件可能会导致受伤。
一个道道的下游效应，核因子（NFAT的活化T细胞， 图6A）是由启动子驱动的荧光素酶报告基因的腺病毒，腺泡细胞感染了。我们提供了有代表性的数据，验证我们的感染方法，证明在TLCS（ 图6B和6C）的存在下的荧光素酶活性的NFAT-浓度和时间依赖性增加。
图1。胰腺腺泡细胞的代表图像FOL下列各种准备。 （一）编制的腺泡细胞Ca 2 +的测量，可视化在630X放大倍率。顶行示出亮视野显微镜，底行示出装有腺泡细胞的Ca 2 +染料氟-4可视化用荧光显微镜（B）制备的腺泡细胞的细胞毒性试验，可视化在400X放大倍率。
图2。表面培灌室（A）的腔室包括三层：金属基体材料的橡胶垫片;一个塑料盖（B）的橡胶密封垫被放置在金属基体的顶部和含有细胞被放置一个22×22毫米的盖玻片向上的顶部的橡胶垫圈。塑料盖螺合到金属基底，一个18×18毫米的盖玻片放置在顶部（C）上腔室，然后固定在显微镜载物台上。套管，含有缓冲区或激动剂，被送入进气口位于上腔的边缘（箭头）。独立管真空（箭头）。
图3。一个典型的峰值高原钙信号刺激后用卡巴（1微米）。 （A）从左至右，明亮的视场的腺泡标记（A）PICAL（B）asolateral的地区的兴趣腺泡细胞。加载与钙离子指示剂荧光4（5μM）细胞。与生理的卡巴（1微米; ACH模拟）刺激后，后续的图像显示在心尖区钙信号传播基底节区启动。（B）每个的镶板图像（1-4），对应到一帧沿有代表性的，为每个感兴趣区域的荧光随着时间的推移的变化的跟踪。图像表示在用彩色标度（右下）的伪彩色。左，右箭头显示时间分别在心尖和基底区第一血钙上升，。这个数字最初发表在生物化学杂志。 （艾哈迈德马哈茂德沙阿AU Orabi AI，K. Muili，罗华，SM，A.，里德A.，SZ乙醇侯赛因增强乙酰胆碱引起的蛋白酶激活和加速钙波离体大鼠胰腺腺泡。生物化学杂志 2 86，14090-14097（2011））。
图4。一个典型的钙振荡刺激后雨蛙（10分）。（A）全细胞胞浆钙测定每秒一次时间推移共聚焦显微镜使用的钙染料荧光4 / AM。伪彩色图像中表示一个颜色sCALE（右上）（B）代表的荧光随着时间的推移，情节从一个单细胞，治疗与蛙皮素（晚上10点）在pH值7.4。这个数字最初发表在生物化学杂志。 （里德AM，侯赛因SZ，运动员E.，亚历山大M.，沙阿A.戈雷利克FS，内桑森MH细胞外pH值低诱导损伤的加强钙信号胰腺细胞生物化学杂志，286，1919-1926（ 2011））。
图5。测量细胞损伤孤立腺泡细胞，乳酸脱氢酶（LDH）泄漏被用来作为一个双向从腺泡细胞与各种诱发胰腺炎激动剂治疗。辉化工损伤指标。孤立的腺泡细胞用不同浓度的（A）的蛙皮素（1〜100 nm）的（B）的氯化氨甲酰胆碱（1微米-1毫米）和（C）的薄层扫描法（50-500微米），和％LDH漏出后测量2小时。组（n = 3）。 ＃，*，P <0.05，相比于控制和单独TLCS。
图6。测量胰腺腺泡细胞感染腺NFAT荧光素酶的荧光素酶活性。 （一）感染了腺病毒NFAT荧光素酶（B）薄层扫描法（5-500微米）诱导NFAT-荧光素酶的活性。管理（C）时间当然展现发光积累TLCS初级小鼠胰腺腺泡细胞的架构（500微米）超过6HR期。组（n = 3）。 *，＃，P <0.05，相对于单独控制或薄层扫描，分别。
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Discussion
细胞分离方法和随后的分析这里描绘了强有力的工具来研究生理和病理的胰腺外分泌功能。隔离分散胰腺腺泡细胞的方法最早是由阿姆斯特丹和贾米森在1972年11。这里介绍的方法已经适应从更近的隔离方法由范·阿克尔和同事12。虽然这些技术是高度可重复性，也容易学习的，有几个重要的功能，必须进行精确的每个方法。了解这些技术的细节将允许更容易故障排除和改进应用。
制备的细胞对钙的测量，我们发现，年轻的啮齿动物的胰腺产生更多一致的结果。腺泡是分布比较均匀，可能是因为它们含有较少的纤维脂肪组织。为 Ca 2 +的测量，我们准备腺泡较小，最佳的单细胞成像。这需要较高的的胶原酶浓度（1.1毫克/毫升或200 U / ml的）比用于乳酸脱氢酶（LDH）的测量。 LDH测量，我们准备较大的腺泡，因为这种方法会导致不损伤基线。的制剂，因此，接收到一个较低的的胶原酶浓度（0.5毫克/毫升或91 U / ml的）。
Ca 2 +的测量，这是至关重要的细胞被镀酸洗盖玻片。的酸清洗的目的是提供一个清洁的表面，以及静电相互作用，将允许最大粘附腺泡。可用于细胞的德（BD Bioscience公司），以代替或除了该方法。此外，它的关键的钙2 +染料加载在一个无BSA孵育缓冲液，以便（1）中，以防止从与BSA结合的染料和（2），以允许腺泡，以最大限度地坚持用酸洗过的盖玻片。
T“灌注室定制设计。商会和流动系统，但是，可以通过华纳仪器除了灌注，设立适当的监管真空，是防止被吸入的腺泡细胞的一个关键因素盖玻片。胰腺腺泡细胞钙信号测量时，我们描述了使用共焦显微镜。共焦成像使用的针孔中的光电倍增管的前面，以消除光从上方或下方的焦平面。与此相反，宽视场成像检测的激发光在整个试样的路径，它允许的聚焦光（ 即光所需的焦点平面的上方和下方）污染试样的荧光图像。以上的宽视场共焦显微镜的优点是，它允许薄截面的样品成像，以及一起收集的光学切片的三维重建的Z轴。此外，激光共聚焦显微镜提供高速采集系统，可以采用旋转盘，行扫描，扫描器sweptfield，甚至缩小地区从一个点扫描器捕捉快速变化中的钙离子荧光。
空间和时间上的变化，如波浪和振荡，分别在钙信号模式，可以可靠地计量，使用F / F 0计算，但是这是不是一个真正的[Ca 2 +]指标。定量测量的[Ca 2 +]可以计算使用单一波长的激发和发射钙染料如荧光4，虽然可能会出现错误在这些测量中，由于漂白和染料损失13,14。的[Ca 2 +]可以更精确地测量通过使用成比例的染料，如Fura2 Indo1 15，但这是不切实际的，因为要求的UV激光激发的共聚焦显微镜。论另一方面，concomita的NT使用萤光-3或荧光4的Fura-红色可以允许使用488 nm激发线，是目前最共聚焦显微镜16比成像。
，LDH泄漏是一个敏感的工具，用于测量腺泡细胞损伤7,17。另一种互补的方法是碘化丙啶摄取18。腺病毒感染实现高感染率培养腺泡19。病毒的浓度，可能需要进行滴定。此外，它是有帮助的，以提供可比较的控制条件，在另一个不相关的腺病毒构建体也感染。大多数感染研究最后下12小时。然而，更长的时间，可以抗生素的DMEM-F12培养基，在一开始就加入。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生部授予DK083327 DK093491研究院（SZH）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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