Summary
췌장암 생물학의 개선 이해는 매우 췌장암을 치료하는 더 나은 치료 옵션의 개발을 가능하게하기 위해 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 사용하여 암 진행의 비 침습 모니터링을 허용 췌장암의 동소 모델을 보여
Abstract
Introduction
췌장암 4-6 %의 5 년 생존율, 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인이다. 환자의 1,2 단지 15 %는 수술을받을 수 질병 조기에 진단하고, 종양이 재발된다 >에서 그 환자의 80 %가. 3,4 젬시 타빈은 췌장 선암의 치료에 사용된다, 그러나, chemoresistance는 일반적이고 자주 약물 생존율에 거의 영향을 미친다. 췌장암을 치료하는 새로운 5 약리 전략이 매우 필요합니다. 그들의 개발은 치료 적 개입에 민감 할 수 있습니다 질병의 진행의 주요 단계를 크게 향상 이해에 따라 달라집니다.
췌장암의 동소 모델은 췌장암의 생물학을 공부 그들을 이상적인 도구를 만드는 인간의 질병의 주요 측면을 모방. 췌장암 세포 행동의 체외에서 세포 기반 분석과는 달리 6-9췌장암의 생체 내 모델에서 D 피하는 동소 모델은 췌장의 미세와 종양 세포의 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 질병 진행의 반응 속도는 동소 모델에서 높은 재현성하고 잘 새로운 치료제의 전임상 시험에 적합하게 짧은 시간 프레임 (주)에 발생합니다. 이 질병의 발병이 더 많은 변수 기간 (개월 1 년) 10. 더 공격적인 세포 라인과 함께 사용을 통해 발생 형질 전환 모델 대조적입니다, 췌장암의 동소 모델에서 본 것과 유사한 자연 전이의 패턴을 가지고 환자는. 같은 반딧불 루시 페라로 발광 리포터 유전자의 8 발현 종양 성장의 종 모니터링, 전이성 보급, 재발 및 치료에 대한 반응을 용이하게합니다. 6,11
여기에 우리가 MATR을 활용 췌장암의 동소 모델을 설명종양 진행의 비 침습 모니터링을위한 지역화 된 세포 전달 및 생체 내 생물 발광 이미징에 대한 이젤. 췌장암이 동소 모델은 질병의 진행 및 syngenic 또는 이종 이식 모델에서 치료 개입에 대한 응답의 비 침습 분석을 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
증명되는 프로토콜은 저자의 기관의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다. 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행됩니다.
1. 췌장암 세포 라인을 transducing에
- 앞에서 설명한대로 형질 도입 췌장암 세포는 루시 페라 제 표현. 12,13 테드 스티븐스 - 1 Capan-1 췌장암 세포주 반딧불 루시 페라로 형질 여기에 사용됩니다.
참고 : Renilla의 루시 페라 나 세균 루시퍼도 사용할 수 있습니다.
2. 췌장암 세포의 준비
- 문화가 70 % 합류 할 때까지 췌장암 세포를 형질.
- 췌장 세포를 올리고 가능성 90 % 이상되어 있는지 확인합니다.
- 냉장 마트 리젤의 3:2 혼합물에서 2 × 10 7 세포 / ML에 resuspend을 : 인산 염은 버퍼오프라인 (PBS).
- 이전 췌장에 주입 얼음 마트 리젤 세포 현탁액을 유지합니다.
참고 : 마트 리젤의 빠른 응고을 보장하기 위해, 세포 펠렛의 양을 고려하여 PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다. 이전 주입 응고를 방지하기 위해 항상 얼음처럼 차가운 악기와 주사기를 사용하여 마트 리젤을 처리합니다. 제안 된 휴대폰 번호는 가이드와 각 세포주에 대해 경험적으로 결정되어야한다.
3. 마우스 준비
- 2-3% isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취. 부드러운 발가락 핀치에 페달 반사의 부족에 의한 마취의 깊이를 결정합니다.
- 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바릅니다.
- 37 ° C 가열 패드의 뒷면에 마우스를 놓고 조심스럽게 복부의 왼쪽을 높이기 위해 마우스를 켭니다.
- 10 % 포비돈 요오드 용액으로 복부를 준비합니다.
참고 : Injectab르 마취 흡입 마취 대신 사용할 수 있습니다. 수술 전 금식이 필요하지 않습니다.
4. 개복술
- 불임 수술기구를 사용하면 대략 1 센티미터 정중선에서 옆 왼쪽으로 피부에 1.5 cm의 절개를합니다.
- 기본 복부 근육에 1.5 cm의 절개를합니다.
- 집게를 사용하여 비장을 찾아 부드럽게 복강에서 비장을 제거합니다. 기본 췌장을 노출하는 멸균 면봉에 따라서 비장을 보호합니다.
- 비장에 인접한 췌장의 꼬리를 찾습니다.
- 29 G 0.3 ML 인슐린 주사기 사용, 췌장에 마트 리젤 세포 현탁액의 20 μl를 주입.
- 마트 리젤이 응고 할 때까지 주입 후, 30 ~ 60 초 동안 췌장에 주사기를 누릅니다. 이 중요한 단계는 세포의 누출을 최소화합니다.
- 누설이 발생하지 확인하기 위해 주사 부위를 검사합니다.
- 복강에 비장과 췌장을 반환합니다.
참고 : 얇은 될 수있는 췌장의 등쪽면을 펑 쳐링 않도록주의하십시오.
5. 복부 벽 마감
- 연속 스티치를 사용하여 원형 바늘로 흡수 꼰 4-0 봉합사와 마우스의 복부 근육을 닫습니다.
- 연속 스티치를 사용하여 절단 바늘 비 흡수성 필라멘트 6-0 봉합사로 외부 피부를 닫습니다.
- 흡입 마취제 및 피하 주입 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀에서 마우스를 제거합니다.
- 마우스가 음식과 물을 무료로 이용할와 37 ° C 가열 패드에 배치의 새장에 복구 할 수 있습니다. 쥐 같은 hunching 또는 감소 이동성 고통의 흔적을 보여 경우, 부 프레 노르 핀은 36 시간에 걸쳐 매 12 시간을 부여 할 수 있습니다.
- 상처 치유 (7-10 일) 후, 마우스를 마취와 외부 봉합을 제거합니다.
6. 췌장 Canc의 발광 추적어 진행
- isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취.
- 꼬리 정맥을 통해 150 ㎎ / ㎏ D-루시페린을 주입.
- 발광 생물 이미징 시스템에 마우스를 놓고 앞에서 설명한대로 백색 빛과 생물 발광 영상을 캡처합니다. 14,15가
- 흡입 마취에서 마우스를 제거하고 그것의 홈 케이지에 복구 할 수 있습니다.
참고 : 바이오 루미 네 센트 영상은 비 침습적이며, 종양의 성장 속도론을 조사하기 위해 정기적으로 실시 할 수 있습니다. 췌장 꼬리의 이미지 종양에 그것의 왼쪽에 마우스를두고하는 것이 중요합니다, 카메라를 향해 종양 점 때문에. 주파수 전에 FOV 12.5 비닝 (binning) 4와 함께 살고 이미징 4.3.1 소프트웨어를 실행하는 루미나 II 이미징 시스템 (퍼킨 - 엘머, 이전 캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 실험 끝점에 일주일에 세 번까지 증가로 우리는 일주일에 한 번 군데 F-스톱 1, 노출 1-60 초 (높은 경험치에 의해 결정픽셀의 채도없이 osure).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법은 마취 유도, 개복술, 마트 리젤 및 복부 폐쇄 (그림 1A)에서 암 세포의 주입 등의 수술 절차를 사용하여 췌장암의 동소 모델을 설명합니다. 주입 된 세포는 췌장의 표면에 거품 (그림 1B)를 형성한다. 췌장암의 진행은 비 침습적 암 세포 증식 및 보급 (그림 2)를 추적하는 생체 생물 발광 이미징에 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 간 전이는 수술 적 절제시 간 생물 발광의 관찰로 표시 (그림 2)와 조직학 (그림 4B)에 의해 생체을 확인 하였다. 기본 종양 이식로부터 6 주에 췌장의 꼬리와 비장 절제 하였다. 이 동소 주입 모델에서 종양의 성장 역학 재현성과 밀접하게 PA의 동소 이식 모델의 동역학과 유사 ncreatic 암 (그림 3). 췌장 종양의 성장은 로컬 침략과 간 (그림 4) 등의 장기에 전이.
그림 1. 췌장암의 진행 동소 마우스 모델입니다.)에게 전. 마취 마우스 테이프를 사용 장소에 고정되어 복부 소독합니다. II. 멸균 면봉에 세로 개복 후 비장과 췌장 꼬리 부드럽게 exteriorized하고 장소에서 개최. III. 마트 리젤 - 임베디드 췌장 종양 세포가 췌장의 꼬리에 주입된다. IV. 복부는 두 개의 층으로 닫힙니다. B) 확대 된 이미지를 exteriorized 비장과 췌장을 표시합니다. 주입 된 세포는 거품 (화살촉)를 형성한다. ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 동소 췌장 종양의 생물 발광 영상 (A) 십일 주사 후, (B) 삼십일일 주사 후, 그리고 (C) 종양 절제술 오일 다음.
그림 3. PANC-1과 Capan-1 세포주의 생체 기본 종양의 성장에 생물 발광 영상 (n은 = 4)에서 시간 (일 주사 후)을 통해 측정 하였다. 종양의 성장 속도론은 마트 리젤 임베디드 췌장 종양 세포를 주입 한 후 췌장 종양 조각의 이식을 사용하여 동소 모델과 비슷합니다.
_upload/50395/50395fig4.jpg "고도 ="그림 4 "/>
그림 4. 헤 마톡 실린과 (A) PANC-1 기본 췌장 종양 및 테드 스티븐스 - 1 차 췌장 종양 (B) 간 전이의 에오신 염색 섹션을 참조하십시오. 주변 장기로 췌장암 세포의 * 현지 침공.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에서 우리는 췌장 종양 개발 및 진행의 경도 평가를위한 동소 모델을 설명합니다. 기본 종양의 성장 속도론을 재현 할 수있다 (그림 3)과 새로운 안티 - 췌장암 치료에 대한 종양 반응의 분석 예 : 루시 페라 제 태그가 세포의 생물 발광 영상을 사용하여 비 침습적으로 모니터링 할 수 있습니다. 인간의 질병과 일치 모델은 췌장의 미세와 종양 세포의 상호 작용을 조사 할 수 있습니다 현지 췌장의 침략 (그림 4A)를 보여줍니다. 루시 페라 제 태그가 세포주의 사용은 전이성 보급의 빈도, 위치 및 동역학 분석을 할 수 있습니다. 그들은 시각적으로 분명하게하고 전이의 조직 현지화가 생체 이미징 및 조직 학적으로 확인 할 수 있습니다 전에 루시 페라 제 태그가 세포주의 사용은 전이의 검출을 용이하게합니다. 임상 상황으로, 모델은 조직으로 전이를 보여줍니다장간막 림프절, 간, 위장관 및 복막 캐비티 (그림 4). 8 생물 발광 영상 등 ANS는 또한 성공적으로 절제하고, 빈도 및 기본 종양 재발의 속도론 (그림 2C)를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 16
주의 준비와 췌장암 세포의 처리 모델의 재현성을 위해 필수적입니다. PBS에 마트 리젤의 비율은 주사 후 세포 펠렛의 빠른 응고에 최적화되어 있습니다. 펠렛 세포 (10 7 종양 세포에 대한 약 35 μL)의 볼륨 마트 리젤의 최종 3:2 위해 PBS의 볼륨에서 제외되어야 세포 + PBS. 주사하는 동안, 세포 누설 마트 리젤 (그림 1) 응고 될 때까지 30 ~ 60 초 동안 현장에서 바늘을 유지하여 방지합니다. 누수가 발생하는 경우 리겔은 색이기 때문에 그것은 쉽게 감지하고 그 마우스는 F를 제외 할 수 있습니다롬 더 분석. 종양 세포의 누출을 방지하기 전이 오히려 사출 기술의 유물로보다 종양 세포의 확산에서 발생하는 것을 보장합니다.
종양 발달의 동역학은 셀 번호를 주입하고 각 세포주에 대해 경험적으로 결정되어야 의해 영향을받을 것입니다. 우리는 4 × 10 5 PANC-1 또는 Capan-1 세포 (그림 3) 주사 후 재생 종양의 성장 패턴을 발견했다. 전이 발광 검출을위한 임계 값은 구성이 발기인 강도와 코돈 최적화 루시 페라 제의 사용을 포함하여 사용되는 표현의 특성에 의해 영향을받을 것입니다. 여기에 설명 된 이종 이식 모델뿐만 아니라, 기술은 면역 환경에서 췌장암의 진행을 검토 할 syngenic 췌장 세포 라인을 사용할 수 있습니다. 비슷한 종양의 역학은 남성 또는 여성 마우스 (데이터 표시되지 않음)에서 관찰되었다.
이 방법은 기술 그다시는 췌장암의 동소 이식 모델에 수정되었습니다. 이 모델에서, 종양은 다음 1mm 3 조각이받는 마우스의 췌장 꼬리에 작은 포켓에 이식되어, 기증자 마우스에 피하 성장하고 있습니다. 6-8,17 차 종양의 성장은 기증자 종양을 사용하여 생물 발광 영상을 사용하여 모니터 할 수 있습니다 루시 페라 제 태그가 종양 세포에서 유래. 여기에 설명 된 동소 모델에 대조적으로, 이식 모델은 추가 시간 (최대 1 개월 분) 및 기증자 종양의 생성에 대한 추가 마우스가 필요합니다. 이식 모델을 사용하여 결과는 이식 종양 조각의 이기종 구성에 의해 영향을받을 수 있습니다. 우리는 마트 리젤 임베디드 세포를 주입 한 후 반응 속도가 이식 모델에 유사하다는 것을 여기에서 보여 주었다. 이식 모델은 임상 환자 샘플을 연구하고 확장하는 데 사용되었습니다. 18-21
여기에 설명 된 동소 모델은 형질 전환 M을 보완사전 침입 및 침입 췌장암 odels. 10,22,23 형질 전환 모델은 종양 유전자의 돌연변이 등 인간의 췌장암의 주요 측면을 요점을 되풀이하지만, 질병의 발병 (> 1 년 7 개월)에 상당한 변화를 보여줍니다. 10,23 대부분의 형질 전환 모델 할 루시 페라 제 표현하지 그래서 질병의 진행의 생체 내 생물 발광 영상에 적합하지 않습니다. 반면, 췌장암의 동소 모델은 종양의 진행으로 재현 속도론을 보여주고 그들이 잘 전 임상 치료 연구에 적합하고, 비 침습 모니터링 할 수 있습니다.
새로운 치료 접근 방법이 매우 췌장암 매우 낮은 생존율을 방지하기 위해 필요합니다. 전이성 및 재발 성 질환의 시각화를 허용함으로써, 췌장암의 동소 모델은 대부분 현재의 치료는 완화되어 임상에 관련된 여기서 설명했다. 또한, 동소 일부 모델에췌장 종양 생물학을 조사하고 생체 설정에 새로운 치료 전략을 평가하는 매우 가치가있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건 의학 연구위원회, 호주 (1,008,865), 호주 연구위원회 (LE110100125), 국립 암 연구소 (CA138687-01), 에리카 슬론은 국립 유방암의 초기 경력 원정대에 의해 지원됩니다에 의해 지원되었다 재단, 호주. 코리나 김 푹스는 스위스 암 리그와 제약 과학의 모나 쉬 대학에서 HDR 장학금의 친교에 의해 지원됩니다. Eliane의 불안은 베른 암 리그에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L.
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M.
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
