Summary
两阶段方法建立Lewis大鼠慢性肾脏病（CKD），通过手术取出肾质量5/6th描述。结合的外科手术过程中，一氧化氮合酶抑制和高盐饮食导致类似人类的CKD的模型，允许因果机制的研究和发展新的治疗干预。
Abstract
慢性肾脏病（CKD）是一个全球性的问题。 CKD进展缓慢是一个主要的健康优先。由于慢性肾脏病的特点是复杂的动态平衡紊乱，综合性的动物模型是必需的研究开发和CKD恶化。要研究开发在CKD CKD和新的治疗干预，使用5/6th切除术，消融模型，一个众所周知的实验模型，进行性肾疾病，类似人类CKD的几个方面。肾质量的毛利减少，导致渐进性肾小球和肾小管间质损伤，损失残肾和发展的系统性和肾小球内高压。它也与渐进肾内毛细管损失，炎症和肾小球硬化。 CKD总是危险因素对血管内皮功能的影响。为了模仿这一点，我们结合5/6th去除肾质量与一氧化氮（NO）的枯竭和高盐饮食。抵达和驯化后，动物重新ceive一氧化氮合酶抑制剂（NG-硝基-L-精氨酸）（L-NNA）补充饮用水（20毫克/升），一个为期4周，随后右侧单侧肾切除。一个星期后，一个肾切除（SNX）的左侧。 SNX后，动物被允许恢复两天LNNA饮用水中（20毫克/升）为进一步为期4周其次。高盐饮食（6％），辅以地面州城（见时间线图1），继续在整个实验过程。通过测量血浆尿素，收缩压和蛋白尿，肾功能衰竭的进度之后随着时间的推移。通过SNX 6周后，肾功能衰竭发展。使用'黄金标准'菊粉和对氨基马尿酸（PAH）的间隙技术测定肾功能。这种模式的特点是CKD的减少，肾小球滤过率（GFR）和有效肾血浆流量（ERPF），高血压（收缩压> 150毫米汞柱），蛋白尿（> 50毫克小时）和轻度尿毒症（> 10毫米）。组织学特征包括炎症，肾小管萎缩，纤维化和局灶性肾小球硬化，导致残余人口健康肾小球内大量减少（<10％）反映了肾小管间质损害。后续SNX显示，直到12周后进一步CKD恶化。
Introduction
由于CKD的先进性，随后终末期肾脏疾病及相关心血管疾病的发病率和死亡率，是一个日益严重的公共卫生问题 。 CKD进展缓慢是一个主要的健康优先。由于慢性肾脏病的特点是复杂的动态平衡紊乱，综合性的动物模型是必需的研究开发和CKD恶化。肾脏由范围广泛的不同类型的细胞，彼此交互。这种复杂性，不能在体外模仿。
要研究新的治疗干预CKD中，我们使用的5/6th切除术烧蚀模型，一个著名的实验模型，进行性肾疾病，类似几个方面的人CKD 2,3。肾质量的毛利减少，导致渐进性肾小球和肾小管间质损伤，损失残肾和发展的系统性和肾小球内高压。这是与程序控制essive肾内毛细血管亏损4，炎症和肾小球硬化。危险因素CKD不约而同地影响内皮功能5。我们使用大鼠株（刘易斯），是比较耐CKD发展，因此，我们结合5/6th去除肾质量与一氧化氮（NO）枯竭6，7，8，高盐饮食9。抵达和驯化后，动物收到一氧化氮合酶抑制剂（L-NNA）一个为期4周的补充饮用水（20毫克/升），其次为右侧单侧肾切除（UNX）延续L-NNA两天后。一个星期后，在左侧肾切除（SNX）， 即去除肾质量分之二。 SNX后，动物被允许恢复为2天，然后再由20 mg / L的LNNA饮用水中的4个星期为一个周期。高盐饮食（6％），辅以地面州城（见时间线图1），继续在整个实验过程。 Ť他理由进行UNX的右侧，并在左侧的SNX是，肾血管长度的左侧，这使得它更易于访问未经拉伸的船只太多时身体外面的露出肾脏的肾。在文献中，模型是描述了其中的磁极的左肾首先被清除，UNX的右肾一个星期后10,11,12。在我们的手中，这个模型显示出更快速的发展，肾功能衰竭，也有更大的变化，肾功能丧失。通过测量血浆尿素，收缩压和蛋白尿，肾功能衰竭的进度之后随着时间的推移。通过SNX 6周后，肾功能衰竭发展，其特征在于由肾小球滤过率显着减少（69％）和有效肾血浆流量（62％）13高压（收缩压> 150毫米汞柱），蛋白尿（> 50毫克小时），轻度尿毒症（> 10毫米）。病理特征包括tubul的邻间质损害反映炎症，肾小管萎缩，纤维化和局灶性肾小球硬化，导致残余人口健康肾小球内大量减少（<10％）。 SNX显示随访，直到12周后进一步CKD进展，评价治疗干预的机会提供了一个窗口。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有的实验都根据动物实验的伦理导向线的乌得勒支的实验动物委员会执行。该协议是作者的机构的动物护理和使用委员会的指导和批准下进行。
CKD是诱发雄性近交系Lewis大鼠（查尔斯河，Sulzfeld，德国）在8周龄。大鼠被安置在标准条件下，光，温度和湿度控制的环境中。
1。术前准备
- 消毒手术器械：
- 1学生组织钳1-2齿12厘米
- 1学生标准模式钳
- 2 Semken钳
- 1梅奥剪刀
- 1学生虹膜剪刀
- 奥尔森有解用剪刀持针器
- 毯子
- 检查库存清单：
- 手术台变暖垫和灯
- Ø
- 组织
- 剃须刀
- 秤
- 无菌操作集
- 无菌纱布5X5和10x10
- 70％酒精
- 0.9％NaCl溶液
- 1ml注射器
- 针（25G）
- 凝胶海绵垫：spongostan
- 薇乔4.0和5.0
- 丁丙诺啡0.03毫克/公斤（1:10稀释在生理盐）
- 清洁笼大鼠手术后
2。右侧单侧肾切除
- 在表中，用70％的酒精消毒。
- 将大鼠感应盒，用4％的异氟醚和1升流量的O 2诱导麻醉。注：这取决于所用的大鼠株，前和围手术期镇痛所规定，这需要与当地的兽医讨论。
- 转入大鼠表和地方鼻锥。大鼠和鼻锥体被放置在一个加热垫维持大鼠的体温。鼠我Ş通风与2％异氟醚和1升O 2的混合物中。
- 剃须大鼠的侧面，并用酒精消毒。手清洗和消毒，穿无菌手术手套。戴头帽和口罩。 1 - 1.5厘米的切口平行于肋骨解剖钳和剪刀钝。背部肌肉钝性分离，暴露肾脏。
- 肾下极可见，小心地用小钝钳，夹住肾周脂肪组织。外部肾肾周脂肪用钳子轻轻拉动。在此过程中不干扰肾上腺照顾。肾上腺可以容易地除去，通过将上面的内侧部位在脂肪组织中的钳子，并轻轻地向上移动，肾上腺和图2中所示的肾之间。
- 上轻轻将肾脏周围的脂肪和结缔组织的纱布清晰。确定肾动脉和静脉，放置结扎（5.0薇乔）与血管周围单结，但不打领带结。
- 仔细将松散的结约0.5厘米，沿着朝向主动脉血管创造空间之间的肾脏和结。这样做是为了防止从切割后脱落结扎。
- 两个双结打结。如果停止灌注，肾的颜色会立即变为褐色。不要切断结扎线的两端。
- 切靠近肾脏的肾血管和肾脏排除。轻轻拉出长端结扎检查肾血管出血。结扎应该留在地方上的船只。切长两端结扎。请注意，残余肾血管会收缩，立即进入腹腔。
- 吸干切除肾脏干燥和称重。
- 关闭骨骼肌切开与薇乔5.0运行缝线。注射0.10毫升（0.03毫克/千克）丁丙诺啡IM后肢。关闭皮肤与薇乔4.0与皮内缝合。这可以防止将大鼠从开放的伤口。注：由于呼吸抑制Lewis大鼠，我们只给手术后的镇痛之前关闭异氟醚。
- 房子在一个干净的食物和水容易进入孤笼大鼠。将笼变暖垫O / N的一半，第二天仔细检查老鼠。当将伤口闭合和大鼠是积极的，这通常是在手术后6和12小时之间，大鼠可以被放置成组壳体的。
3。左侧肾切除
- 七天后，相同的制剂为从2.1至2.5所描述的右侧的左侧。在手术前，需要被移除对应约分之二的重量右肾的肾组织中的量的计算方法。术前准备小块泡沫凝胶（Spongostan，强生公司，新泽西州）。 左肾上极锋利的剪刀周围放置在一个冲程（剪刀的位置，参见图3），切除上极。立即盖上一块泡沫凝胶，并用无菌纱布施加温和的压力。
- 重复3.3肾脏下极。
- 提起肾脏皮肤上，以防止凝血。保持温和的压力，用无菌纱布都凝胶海绵垫，直到出血停止。当出血仍然存在，添加另一个泡沫垫。
- 将残肾腹部内贴壁凝胶海绵垫。关闭的肌肉和皮肤，并按照2.9-2.12。
4。假手术
- 假手术对照经过同样的过程，以揭露肾脏。而是肾脏摘除或切割的两极，一个星期后，两个肾脏被解封间隔一个星期，照顾不来打扰的肾上腺。伤口缝合手术后的护理是ID2.11及2.12 entical。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
肾切除后，约六分之一肾总质量被留下。 图4显示了与前两次实验的平均值和标准偏差右肾切除部分的重量。每个人都应该记住，在UNX一周后，左肾肥大发生，这表明的重量，计算上在5/6th去除小于右侧肾脏的重量的结果总是需要被移除。然而，由于它是不可能的左肾在手术过程中确定权重，这是最准确的方法，以消除约5/6th的原肾质量。
随着时间的推移，CKD大鼠发展高血压，尿毒症，贫血，蛋白尿和显着减少，GFR和ERPF。 6周后，建立了CKD的发展，一个合适的时间点来测试救援干预。随着时间的推移，高血压和蛋白尿进展强劲，同时观察血细胞比容肾功能（GFR和ERPF）显示轻度下降（ 图5）。其他症状，我们不专注于在我们的实验中，包括钙磷酸盐和脂质代谢紊乱，和其他许多人。根据对应变的影响，可以有显着的不同CKD发展14，15，2。我们增加了高盐饮食和NO阻滞剂诱发高血压和血管内皮功能障碍。
肾功能衰竭的进度跟踪收集尿液（用于测量的量的蛋白质和肌酐），血液（血浆尿素和肌酸酐）和收缩压。我们认识到，高血压的发展可以遵循使用遥测，而不是尾套体积描记法更精确。肌酐清除率可以计算出，但往往会低估GFR下降，由于广泛的肾小管肌酐分泌大鼠16金标法的重要性，强调以确定肾功能菊粉和PAH间隙17，18，19。 koeners 等 。描述完整的过程20。菊粉和PAH间隙从他们的尿液样本中的浓度（U），尿流率（V），和他们的血药浓度（P）计算。我们以前发现在这个模型中采用经典的间隙技术，GFR和ERPF明显减少，而这是不太明显的变化，血浆肌酐，血浆尿素，肌酐清除率13。
图1。 L-NNA的时间线，高盐饮食，UNX和SNX纵向测量，以确定肾功能和终止时间点表示。再走时需要SNX后，随着时间的推移，6％的NaCl饮食可以继续。
98fig2.jpg“/>
图2。肾上腺夹层不干扰，地方钳之间的脂肪，肾和肾上腺和从血管极向上移动到顶部由红线表示要删除肾上腺。图改编自格雷的解剖人体，1918年美国20版。
图3。大部切除 。红色线表示切削刃。图改编自格雷的解剖人体，1918年美国20版。
图4。去除肾组织在两个不同的实验大部切除后的百分比。 EXP 1，N = 16，EXP 2，N = 23。
图5。CKD大鼠肾功能衰竭的发展终止后6周SNX（sdashed线N = 5）与健康对照组（pdashed线N = 5）和CKD大鼠12周后终止SNX（£N = 8）与健康对照组（N = 8）。 CKD大鼠L-NNA直至终止（未显示在图），直到第4周和第1周的高盐饮食。 SNX诱发高血压（由tailcuff体积描记法测量）（A），尿毒症（B），贫血（C）和（D）蛋白尿，明显减少肾小球滤过率（E）和ERPF（F）13。 *控制P <0.05与健康对照组测试双向ANOVA与邦费罗尼图形A，B和 D的测试后，每个时间点。图C，E和F的双尾测试6周和12周的时间点t检验。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
手术切除5/6th Lewis大鼠肾的质量，再加上高盐饮食和临时NOS抑制剂导致的模型类似于人类CKD CKD，CKD的治疗干预的因果机制和疗效，并允许研究。
的5/6th肾切除模型是一个著名的和广泛的描述模型，用于CKD。然而，简单地删除5/6th肾质量不会导致立即肾功能衰竭大鼠品系。我们使用Lewis大鼠的影响进行研究基于细胞的疗法，在CKD的可用性GFP + Lewis大鼠21允许nonGFP跟踪管理的供体细胞在受体细胞（+）大鼠。 Lewis大鼠肾损伤的发展和CKD发展是比较耐其他22株，15个比较缓慢。因此，我们结合5/6th去除NO枯竭和高盐饮食肾质量，因为这类似于人类CKD的几个方面如高盐的摄入量和血管内皮功能障碍。读者应该牢记5/6th切除术相结合，高盐饮食和/或NO枯竭的，需要依赖于用于实验的大鼠株。
我们进行5/6th肾切除术中的两个步骤，而不是一个单步过程，因为这被视为负担的动物，与手术相关的死亡率较低，优选由我们的动物实验委员会。我们首选侧面切口，而不是开腹到达肾脏相关的剖腹手术伤口感染的风险较高，松动针，皮下症和侧面切口相比，肠子粘连。此外，如果涉及实验设计与开腹手术的干预 - 这是管理的骨髓细胞的情况下，我们的实验研究到肾动脉的残余肾进行剖腹手术SNX不预ferable反复剖腹手术应尽量避免。
5/6th手术切除肾肿块，可能发生的几个关键问题。 UNX期间可以有稳定的肾脏，因为周围的脂肪就会很容易分离的困难。两种方法可用于获取肾脏暴露。 1）使用较小的的握对肾血管钳轻轻地向下移动，从对血管的肾脏下极，小心地拉出，直到你能稳定肾脏。 2）使用钝钳小心地将肾脏的腹部。当肾脏被暴露，纱布可用于止血，在此过程中，可能会发生的。为了防止出血，开始拉动下极肾，脂肪十分肾脏脂肪。
重要的是要创造空间之间的结，绕肾血管和肾脏，防止出血切除肾脏后，作为结滑落由于传入的血流量，肾血管迅速填补了腹部血液。可用于去除血液和压力，应适用于止血纱布。使用镊子夹住肾和放置一个新的结扎。当肾血管不能追溯，有保有压，直到出血停止。加入1毫升生理盐由于在腹腔内的出血，以防止脱水，并等待约5分钟，然后再关闭的肌肉和皮肤层。随后几天的仔细监测大鼠额外。当结扎切除肾，但肾血管出血后还是很到位的，可用于长期的两端结扎，以配合船只。
当解剖后的两极，尽管持有凝胶海绵垫的压力，如果出血仍然存在，这可能是由于大的肾动脉或肾盂受伤。这种出血可停止放置新的凝胶海绵垫在伤口上，照顾不动在升降过程中的残余，因为其更大的船只靠近肺门，等待一段较长的时间的泡沫垫。
可以追溯到血液尿液中，直到手术后2天。当肾盂损坏或一个大的肾血管持续出血，将有一个持久的跟踪血尿。大鼠持续性血尿，手术后需要被安乐死，因为它是不可能达到止血的目的。如果血尿是在稍后的时间点观察到，它可以发生在手术后手术后2周，也应该被处死大鼠肾盂内，由于血液凝块，最终会堵塞输尿管和膀胱，导致梗阻。
当肾功能衰竭需要更快速的发展，该协议是可以逆转的， 即先删除单侧肾切除一个星期后的两极。这个颠倒的模型已被用于在其他的大鼠品系，例如Liu 等人看到。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢克丽斯塔：书房Ouden为她出色的技术援助。这项技术是由荷兰肾脏基金会，授予C06.2174财政支持。支持MCV是由荷兰科学研究组织（NWO）VIDI补助016.096.359。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| L-NNA | Sigma-aldrich | N5501 | |
| Spongostan dental: gel foam pads 1x1x1 cm | Johnson&Johnson | Ms0005 | |
| Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36 | Ethicon | V303H | |
| Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36 | Ethicon | V392H | |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Via local pharmacist ordered by Reckitt Benckiser pharmaceuticals | unknown | |
| Equipment | |||
| Student Tissue Forceps - 1x2 Teeth 12 cm | Fine Science Tools (FST) | 91121-12 | |
| Student Standard Pattern Forceps | FST | 91100-12 | |
| Mayo Scissors | FST | 14010-15 | |
| 2X Semken Forceps | FST | 11008-13 | |
| Student Iris Scissors | FST | 91460-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST | 12002-14 | |
|
|||
References
- AS, G. o, Chertow, G. M., Fan, D., McCulloch, C. E., Hsu, C. Y. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. N. Engl. J. Med. 351 (13), 1296-1305 (2004).
- Fleck, C., Appenroth, D., et al. Suitability of 5/6 nephrectomy (5/6NX) for the induction of interstitial renal fibrosis in rats--influence of sex, strain, and surgical procedure. Exp. Toxicol. Pathol. 57 (3), 195-205 (2006).
- Griffin, K. A., Picken, M. M., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A. K. Functional and structural correlates of glomerulosclerosis after renal mass reduction in the rat. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (3), 497-506 (2000).
- Kang, D. H., Kanellis, J., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Baylis, C. Nitric oxide synthase derangements and hypertension in kidney disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 21 (1), 1-6 (2012).
- Bongartz, L. G., Braam, B., et al. Transient nitric oxide reduction induces permanent cardiac systolic dysfunction and worsens kidney damage in rats with chronic kidney disease. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298 (3), 815-823 (2010).
- Fujihara, C. K., De N, G., Zatz, R. Chronic nitric oxide synthase inhibition aggravates glomerular injury in rats with subtotal nephrectomy. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (7), 1498-1507 (1995).
- Fujihara, C. K., Sena, C. R., Malheiros, D. M., Mattar, A. L., Zatz, R. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (3), F632-F640 (2006).
- Dikow, R., Kihm, L. P., et al. Increased infarct size in uremic rats: reduced ischemia tolerance? J. Am. Soc. Nephrol. 15 (6), 1530-1536 (2004).
- Elrashidy, R. A., Asker, M. E., Mohamed, H. E. Pioglitazone attenuates cardiac fibrosis and hypertrophy in a rat model of diabetic nephropathy. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 17 (3), 324-333 (2012).
- Haylor, J., Schroeder, J., et al. Skin gadolinium following use of MR contrast agents in a rat model of nephrogenic systemic fibrosis. Radiology. 263 (1), 107-116 (2012).
- Moriguchi, Y., Yogo, K., et al. Left ventricular hypertrophy is associated with inflammation in sodium loaded subtotal nephrectomized rats. Biomed. Res. 32 (2), 83-90 (2011).
- van Koppen, A., Joles, J. A., et al. Healthy bone marrow cells reduce progression of kidney failure better than CKD bone marrow cells in rats with established chronic kidney disease. Cell Transplant. , (2012).
- Baylis, C., Corman, B. The aging kidney: insights from experimental studies. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (4), 699-709 (1998).
- Szabo, A. J., Muller, V., Chen, G. F., Samsell, L. J., Erdely, A., Baylis, C. Nephron number determines susceptibility to renal mass reduction-induced CKD in Lewis and Fisher 344 rats: implications for development of experimentally induced chronic allograft nephropathy. Nephrol. Dial Transplant. 23 (8), 2492-2495 (2008).
- Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
- Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney Int. 38 (1), 167-184 (1990).
- Myers, G. L., Miller, W. G., et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin. Chem. 52 (1), 5-18 (2006).
- Hostetter, T. H., Meyer, T. W. The development of clearance methods for measurement of glomerular filtration and tubular reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287 (5), F868-F870 (2004).
- Koeners, M. P., Racasan, S., Koomans, H. A., Joles, J. A., Braam, B. Nitric oxide, superoxide and renal blood flow autoregulation in SHR after perinatal L-arginine and antioxidants. Acta. Physiol. (Oxf). 190 (4), 329-338 (2007).
- van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
- Kreutz, R., Kovacevic, L., Schulz, A., Rothermund, L., Ketteler, M., Paul, M. Effect of high NaCl diet on spontaneous hypertension in a genetic rat model with reduced nephron number. J. Hypertens. 18 (6), 777-782 (2000).
- Liu, Z. C., Chow, K. M., Chang, T. M. Evaluation of two protocols of uremic rat model: partial nephrectomy and. 25 (6), 935-943 (2003).
- Griffin, K. A., Picken, M., Bidani, A. K. Method of renal mass reduction is a critical modulator of subsequent hypertension and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 4 (12), 2023-2031 (1994).
- Meyer, F., Ioshii, S. O., et al.
