Summary
We beschrijven een zeer reproduceerbare werkwijze voor de permanente occlusie van een knaagdier grote cerebrale bloedvat. Deze techniek kan worden bereikt met zeer weinig perifere schade minimaal bloedverlies, een hoog percentage overleving op lange termijn en consistente infarct volume evenredig met de klinische populatie.
Abstract
Beroerte is een belangrijke oorzaak van overlijden, invaliditeit, en sociaal-economische schade wereldwijd. De meerderheid van alle beroertes gevolg zijn van een onderbreking van de bloedstroom (ischemie) 1. Middelste cerebrale slagader (MCA) levert een grote meerderheid van het bloed naar het laterale oppervlak van de cortex 2, is de meest voorkomende plaats van de menselijke beroerte 3, en ischemie op zijn grondgebied kan leiden tot uitgebreide disfunctie of dood 1,4,5. Overlevenden van ischemische beroerte lijden vaak verlies of verstoring van motorische capaciteiten, sensorische gebreken, en infarct. In een poging om deze belangrijke kenmerken van een beroerte vast te leggen, en daarbij effectieve behandeling te ontwikkelen, is een veel nadruk gelegd op dierlijke modellen van ischemie bij MCA.
Hier presenteren we een werkwijze voor het permanent afsluiten van een corticaal oppervlak bloedvat. We zullen deze methode presenteren met behulp van een voorbeeld van een relevante vatocclusie dat modelleert het meest voorkomende type, de locatie, en de uitkome van de menselijke beroerte, permanente midden cerebrale slagader occlusie (pMCAO). In dit model, we chirurgisch MCA bloot in de volwassen rat en vervolgens af te sluiten via dubbele ligatuur en doorsnijding van het schip. Dit pMCAO blokkeert het proximale corticale tak van MCA, waardoor ischemie in alle MCA corticale gebied, een groot deel van de cortex. Deze methode van occlusie kan ook worden gebruikt om meer distale delen van corticale vaartuigen afsluiten om meer focale ischemie gericht op een kleiner gebied van de cortex bereiken. De belangrijkste nadelen van pMCAO zijn dat de chirurgische procedure enigszins invasief kleine craniotomie is nodig voor MCA, maar dit resulteert in minimale weefselbeschadiging. De belangrijkste voordelen van dit model zijn echter: de occlusieplaats goed gedefinieerd, de mate van verminderde doorbloeding is consistent, functioneel en neurologische stoornis treedt snel, infarctgrootte is consistent, en de hoge overleving maakt lange term chronische evaluatie.
Introduction
Om ischemische condities die effectief na te bootsen menselijke ischemische beroerte veroorzaken, worden diverse dierlijke takt modellen op grote schaal toegepast, met wisselende volumes infarct als gevolg. In de fototrombotisch model, de hersenen bestraald door de intacte schedel met laser belichting na intraveneuze injectie van een lichtgevoelige stof (zoals rose-bengal), resulterend in fotochemische coagulatie, verstopping van de bestraalde schepen en ischemie in het omringende weefsel 6, 7. Photothrombosis kunnen zeer kleine, geïsoleerde gebieden van infarct en wordt typisch als een modelmatig "mini-beroerte" of "micro-slagen".
De meer algemeen aanvaarde methode voor het induceren van ischemische beroerte, in het bijzonder middelste cerebrale slagader (MCA), is de intraluminale monofilament model 8, waarin een filament wordt operatief ingebracht in de uitwendige halsslagader en voortbewogen totdat het uiteinde afsluit basis van MCA. Een primary uitdaging van intraluminale filament occlusie is het hoge sterftecijfer (70% bij MCA wordt afgesloten voor 3 uur, een relevante tijdstip voor slagonderzoek) 9. Andere problemen met de methode opgenomen mogelijke subarachnoïdale bloeding, onvolledige occlusie, en variabele infarctvolume 10,11. Dit model resulteert in een uitgebreide mate van infarct zowel in de cortex en Subcortically 12, en modellen een enorme menselijke beroerte.
Hoewel zowel micro-en zware beroerte modellen zijn belangrijk, menselijk slagen zijn meestal ergens tussenin. In grote klinische studies, beroerte infarct varieert in grootte 28-80 cm 3, wat zich vertaalt naar 4,5-14% van de ipsi-ishemic halfrond 9. In vergelijking, onze rat pMCAO infarct grootte varieert van ongeveer 9-35 mm 3, die 3 tot 12% van de ipsi-ishemic halfrond vormt. Onze pMCAO model, dus sterk lijkt op de menselijke ischemische beroerte infarct volumes op percentage van de hersenenvolume.
Naast het modelleren van de structurele beschadiging van beroerte, pMCAO resulteert in functionele en afwijkend gedrag vergelijkbaar met de menselijke conditie. Op minimum, een effectief model van een beroerte leidt tot tekorten beweging contralateraal aan slagschade 13-15, verlies of verstoring van motorische en sensorische functie 16,17, verlies of verstoring van opgewekte neuronale activiteit 16,18, vermindering van de cerebrale bloeddoorstroming 19, 20, en infarct 21,22. Dienovereenkomstig, onze pMCAO modellen een ernstige occlusie van de MCA resulteert in lichamelijke handicap, verlies van functie binnen de sensorische cortex (en naburige cortex), verstoring van de neuronale activiteit, een ernstige vermindering van de MCA bloedstroom, en infarct-keurmerk attributen van ischemische beroerte 23 -25 daarom dienen als een effectief model van menselijke beroerte.
Procedureel pMCAO gaat om een kleine craniotomie waarin wij verwijder voorzichtig de schedel en dura uiteen 2 x 2 mm "chirurgische venster" via eerste (M1) segment van MCA, net voor de primaire splitsing van MCA in de anterieure en posterieure corticale takken (Figuren 1A en 1B). We passeren een half-bocht achteruit snijden hechtdraad naald en draad (6-0 zijde) door de pial laag van de hersenvliezen, onder MCA en boven de corticale oppervlak (zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur voor de chirurgische leveringen nodig voor het uitvoeren van pMCAO ). We binden dan een dubbele ligatuur, draai de twee knopen rond MCA, en doorsnijden het schip tussen de twee knopen. De dubbele ligatuur en doorsnijding door M1 komt net distaal van de vertakking lenticulostriate, zodanig dat alleen de corticale takken van MCA zijn getroffen-dus alleen corticale infarct (geen subcorticale schade) ontstaat 26,27 (figuur 2). Hoewel de menselijke beroerte gaat vaak gepaard met subcorticale infarct, het modelleren van deze bij knaagdieren vereist meer invasieve (afsluitende cerebrale bloedvaten vóór corticale Branching vereist toegang slagaders via de halsslagader in de nek en vereist extra afsluitingen) in techniek en verhoogde variabiliteit in infarctgrootte. Het hier beschreven model kan niet meer proximaal worden uitgevoerd als de toegang tot eerdere takken van MCA is niet mogelijk via een eenvoudige craniotomie. Terwijl het chirurgisch mogelijk is om een subcorticale infarct via pMCAO induceren, zou occlusie een zeer invasieve procedure omvat en dus niet ideaal.
Effectiviteit van occlusie kan worden bevestigd via laser Doppler of laser speckle imaging 12,24,25 (figuur 3), of post-mortem histologisch (Figuur 2). Opgemerkt moet worden dat het vorige onderzoek heeft aangetoond dat sensorische stimulatie een belangrijke rol kan spelen in de evolutie en de uitkomst van infarct; verlening van bescherming tegen beschadiging bij toediening binnen 2 uur van pMCAO en het veroorzaken van een toename van de beroerte schade wanneer toegediend op 3 uur na pMCAO 24,25,28. Wij hebben bevestigd dat ten 5 uur na pMCAO, stimulatie niet langer invloed heeft op resultaat (ongepubliceerde gegevens). Daarom moet sensorische stimulatie van de proefpersonen worden geminimaliseerd voor 5 uur na pMCAO aan infarct volumes te verkrijgen met minimale variabiliteit. Dienovereenkomstig onze groep heeft "onbehandelde" van dit type door hem ratten verdoofd gedurende 5 uur na pMCAO, in het donker, met minimale sensorische stimulatie en uitdrukkelijk geen whisker stimulatie.
Voorts zij opgemerkt dat af variatie in MCA structuur, waaronder overmatige vertakking, verschillende primaire segmenten, of de afwezigheid van communicatie slagaders optreden met een frequentie van 10 tot 30% in volwassen mannelijke Sprague Dawley ratten 29,30. Als abnormaliteiten in MCA worden waargenomen, is het raadzaam dat niet specifiek als toevoeging dieren zoals vasculaire abnormaliteiten infarct variabiliteit toenemen.
Daarnaast zijn er verschillende praktische aspecten van our procedure die deze occlusie methode voordelig voor beroerte onderzoek te maken. Ten eerste kunnen hechtingen rond de slagader worden geplaatst zonder aangescherpt om een nulmeting, gevolgd door post-ischemische beoordeling na ligatuur en doorsnijding verzamelen. Op deze wijze wordt chirurgisch preparaat zodat het occlusie effectief gecontroleerd binnen onderwerpen. Omdat patiënten stationair kan blijven of in een stereotaxisch frame in occlusie, is het mogelijk experimentele beoordeling van elk onderwerp voor voeren, tijdens en na occlusie zonder bewegende objecten of experimentele apparatuur storen gebruikt 25,28. Bovendien, deze procedure resulteert in een zeer lage sterfte, zelfs in oude knaagdier onderwerpen 21-24 maanden (overeenkomend met een oudere mens) 31, en wordt gebruikt om een beroerte behandelingen bij ratten te evalueren die beter voorspellen van de meest voorkomende leeftijdscategorie van CVA-patiënten 25,28. Schip transection dient ook een aantal praktische doeleinden. De afwezigheid van bloeden na doorsnijding bevestigt dat het vaartuig volledig werd afgesloten aan beide ligatuur sites. Daarnaast doorsnijding staat doorlopend verstoring van de bloedstroom. Tot slot, doorsnijding zorgt ervoor dat elke bloedstroom gedetecteerd in de distale delen van het afgesloten bloedvat moet komen van een alternatieve bron.
Tenslotte, hoewel wij specifiek beschrijven occlusie techniek MCA in dit manuscript en video, dezelfde dubbele ligatuur doorsnijding techniek kan worden toegepast op elke cerebrale schip dat toegankelijk via craniotomie. Ons laboratorium, bijvoorbeeld pMCAO gebruikt in combinatie met verscheidene bijkomende permanente occlusie van de MCA distale takken om zowel primaire en collaterale bloedstroom 24 blokkeren op een wijze die vergelijkbaar technieken om selectief ischemie induceren in de primaire somatosensorische cortex 32.
Concluderend, tzijn methode voor permanente occlusie zoals toegepast op MCA nauw modellen drie primaire facetten van het menselijk herseninfarct: de meest voorkomende locatie (MCA), type (ischemie), en de mate van beschadiging (infarct) in verband met de menselijke klinische literatuur van een beroerte. Verder kan deze werkwijze occlusie toegepast op een of meerdere occlusie locaties in de hersenen en kan worden uitgevoerd in oude patiënten met een hoge mate van overleving. Gezien de dynamische, permanente en relatief niet-invasieve karakter van deze occlusie, deze techniek vormt een extra instrument voor preklinische onderzoekers evalueren van nieuwe benaderingen voor de bescherming van en de behandeling van een beroerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aan de slag: Vereist Chirurgische Instrumenten
Zie figuur 4
- Tandboor (Kavo Dental Equipment, Model: UMXL-TM), 2-bit boor, en 3-bit boor
- Twee ~ 30 gauge injectienaalden
- Getande pincet, gebogen punt optioneel (kan nuttig zijn, maar niet noodzakelijk)
- Twee fijne punt pincet
- draadtang
- Hechtdraad
- Microscharen
2. Het creëren van de Chirurgische Window
- Anesthesie: Procedures zijn in overeenstemming met NIH richtlijnen en zijn goedgekeurd door UC Irvine Animal Care en gebruik Comite. Proefpersonen zijn 295-400 g mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) en de volgende narcose procedure moet worden toegepast:
- Injecteer rat intraperitoneaal met een bolus natriumpentobarbital (55 mg / kg lichaamsgewicht) gevolgd door een intramusculaire injectie van atropine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht) in de hind been, en toegediend 3.0 cc van 5% dextrose in water subcutaan.
- Supplement natrium pentobarbital (27,5 mg / kg lichaamsgewicht) injecties nodig. Dien een ofthalmische antibiotische zalf op de ogen om het hoornvlies te beschermen tijdens de volgende procedures. Dien 5% dextrose (3 ml) en atropine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht) om de zes uur af luchtwegsecreties tijdens anesthesie. Meet lichaamstemperatuur via een rectale sonde en onderhouden van de lichaamstemperatuur op 37 ° C door een zelfregelende thermische deken.
- Zoek de MCA door een van beide:
- Uitdunnen een 2 x 2 mm beeldvorming / visualiseren venster over de somatosensorische cortex met een omvang HP 3 boor tot de schedel is bijna transparant en vervolgens verdunnen tot volledige transparantie met een omvang van HP 2 boor. MCA locatie kan vervolgens worden gezien door het venster en het proximale wijze voor het benaderen van de plaats van de oorspronkelijke segment. MCA zal lopen over het algemeen schuin tegenover dezeraam in een rostrale om caudale / ventraal naar dorsaal (bijvoorbeeld van links naar rechts / onder naar boven bij het bekijken linkerhelft van het standpunt van de chirurg). De chirurgische raam kan dan boven worden gecreëerd waarin de waarnemer schat de M1 segment (proximaal corticale vertakking) te bevinden op basis van de distale takken zichtbaar door het eerste venster. Om de hoeveelheid schedel die staat minimaliseren om toegang te krijgen MCA moet de beeldbewerking / visualiseren venster dicht worden geplaatst, maar gescheiden van de chirurgische venster.
Of - Een kleine chirurgische venster moet ca. 3 mm anterior en 1 mm lateraal van de foramen ovale of mandibulaire zenuw, dichtbij de boog rostrum 30,33,34. Om effectief toegang tot de stam van de MCA (ook bekend als de M1-segment), wordt de temporalis spier tijdelijk afwezig gereflecteerd door de schedel oppervlak. (Opmerking: In het geval van lange-termijn overleving operaties, heeft de ervaring ons lab's tha geweestt doordat de temporalis spier bevestigd aan het anker blijft, zal de spier opnieuw annealen de schedel oppervlak zodat gezond eetgedrag en effectief onderhoud van het lichaamsgewicht.
- Uitdunnen een 2 x 2 mm beeldvorming / visualiseren venster over de somatosensorische cortex met een omvang HP 3 boor tot de schedel is bijna transparant en vervolgens verdunnen tot volledige transparantie met een omvang van HP 2 boor. MCA locatie kan vervolgens worden gezien door het venster en het proximale wijze voor het benaderen van de plaats van de oorspronkelijke segment. MCA zal lopen over het algemeen schuin tegenover dezeraam in een rostrale om caudale / ventraal naar dorsaal (bijvoorbeeld van links naar rechts / onder naar boven bij het bekijken linkerhelft van het standpunt van de chirurg). De chirurgische raam kan dan boven worden gecreëerd waarin de waarnemer schat de M1 segment (proximaal corticale vertakking) te bevinden op basis van de distale takken zichtbaar door het eerste venster. Om de hoeveelheid schedel die staat minimaliseren om toegang te krijgen MCA moet de beeldbewerking / visualiseren venster dicht worden geplaatst, maar gescheiden van de chirurgische venster.
- Volg MCA aan de rostrale, ventrale hoek van de imaging-venster (als u deze als referentie) in te schatten wanneer deze aanvankelijk corticale tak ligt.
- Maak een nieuwe thin-skull regio (we noemen dit de chirurgische venster) iets rostraal en ventraal van de imaging-venster (als u deze als referentie) waar het M1-segment (pre-corticale vertakking) van MCA moet zijn. BELANGRIJK: Laat ongeveer een 2 mm tussen de imaging-venster (als u deze als referentie) en de chirurgische venster.
- Zoek de steel van het MCA (ook bekend als M1 segment) net voor corticale vertakking van de slagader zoals getoond in figuren 1A en 1B.
- Met behulp van een omvang HP-3 boor, dun de schedel boven de geschatte M1-segment locatie. Wanneer deschedel wordt enigszins transparant, overschakelen naar de meer delicate omvang HP-2 boor en dun de schedel tot het volledig transparant. Controleer visueel als chirurgische raamoppervlak wordt dun genoeg om vasculatuur bekijken en beoordelen van de locatie van M1 op dit punt en vul het raam zodat er 2-3 mm aan weerszijden van de lengte van de M1 segment (dit laat ruimte voor insertie en uitgang van de hechtdraad naald aan weerszijden van MCA).
Belangrijk: Stop dunner als de dikte van de schedel is vergelijkbaar met die van plastic wrap. Het schip zal scheuren als de boor breekt door de schedel en dura. Als de schedel niet dun genoeg anderzijds, verwijderen de occlusie moeilijk zijn en kan resulteren in beschadiging van de cortex of slagader.
- Neem een 30 gauge (30 G) injectienaald en buig de punt van de naald, met getande pincet.
- Gebruik de 30 G naald te prikken de schedel zorgvolledig uit een gebied direct boven een slagader. Gebruik dit gaatje om pincet om de schedel te begrijpen en verwijder voorzichtig de verdunde gebied van de chirurgische venster.
- Neem een nieuwe 30 G behoefte, buig de punt als in stap 6, en verwijder voorzichtig de dura.
OPMERKING: Het snijden van de dura zal veroorzaken te pellen en MCA zal prominenter worden, als gevolg van een verminderde druk.
3. Occlusie van de MCA
- Gebruik kniptang om een half-bocht achteruit snijden Hechtnaald (ronde 3/8, 16 mm hechtdraad naald) tot ongeveer 3-5 mm trimmen.
- Rijg de bijgesneden hechtdraad naald zoals getoond in de afbeelding in figuur 4E. BELANGRIJK: Het is belangrijk dat de naald is voorzien van schroefdraad zodat de beide uiteinden van de hechtdraad zijn van equivalente lengte. Dit maakt het trekken van beide draadeinden onder M1 tegelijkertijd, de naald kan dan vrijmaken waardoor twee stukken draad naar twee knopen rond MCA binden.
- Gebruik de gekartelde het pincet zet de hechtdraad naald onder M1. Steek met ongeveer 0,5-1 mm afstand van de MCA, een verblijf zo ondiep mogelijk om zo schade aan de cortex te minimaliseren, maar het vermijden van te veel spanning op MCA ook.
- Wanneer de hechtnaald komt de andere kant, zodanig dat het onder MCA, met een fijne punt pincet (zie hieronder) aan het uiteinde van de hechtdraad naald te trekken van de andere kant en tegelijkertijd te voeden of duwen van het andere uiteinde van de hechtdraad naald met de gekartelde tip pincet.
- Zodra de hechtdraad naald volledig gepasseerd onder MCA en is uitgetrokken, verder trekken aan de hechtdraad naald of draad tot de lengte van de draad is gelijk aan beide zijden van MCA. Het indrukken van de draad als het wordt geleid naar de belasting van MCA minimaliseren kan nuttig zijn om breuk te voorkomen als de draad onder de slagader.
- Knip de draad dicht bij de hechtdraad naald.
- Gebruik beide fijne punt pincet om de twee resulterende hechtdraad ontwarrens, zodat er twee onafhankelijke draden geregen onder MCA die niet raken. Idealiter de draden zal ongeveer 1 mm van elkaar waar ze passeren onder MCA.
- Gebruik beide fijne punt pincet om twee aparte knopen (twee ligaturen) binden met de discussies rond MCA probeert vol te houden dat ~ 1 mm ruimte tussen de knopen om ruimte voor transection toestaan.
OPMERKING: Als een interne schijnvertoning controle gewenst is, bereiden de occlusie verlaten van de occlusie knopen los, zodat ze niet vernauwen MCA bij allen en het verzamelen van gegevens voorafgaand aan het aanscherpen van de knopen en het snijden van het schip. Knip de draad te voorkomen dat voorafgaand aan occlusie vangen op alles maar laat genoeg draad om aanscherping van de knopen later. Op deze manier kan iedere initiële beeldvorming of het verzamelen van gegevens worden uitgevoerd met alle van dezelfde chirurgische invasie als de occlusie en de knopen aangescherpt op het juiste tijdstip met weinig vertraging.
- Zodra de knopen hebben zijnnl strak getrokken, gebruikt u de micro schaar om M1 doorsnijden tussen de twee knopen.
- In het geval van lange termijn overleving studies:
- Hechtdraad ingesneden hoofdhuid flap weer op zijn plaats met steriele chirurgische draad of beveiligen van het weefsel met steriele wond clips.
- Dien antibiotica lokaal om de wond (zoals bacitracine zalf) en systemisch door profylactische injectie van ampicilline (150 mg / kg IM).
- Terwijl het onderwerp nog verdoofd toedienen van een oftalmische antibiotische zalf voor de ogen.
- Dien aanvullende atropine (0,05 mg / kg IM) om sputum te verminderen tijdens anesthesie.
- Injecteer flunixin meglumine (1,1 mg / kg) subcutaan aan het einde van chirurgie en opnieuw de volgende ochtend (~ 12 uur later) voor pijnbestrijding.
- Plaats het dier op een droge, warme, hellend oppervlak zodanig dat de dieren neus is boven zijn staart op de helling (dit vergemakkelijkt de ademhaling totdat het dier is wakker). </ Li>
- Bewaken van het dier tot het wakker en veilig bewegen op zijn eigen.
- Zodra het dier is terug in het terrarium, de activiteit van het dier, het uiterlijk, vocalisatie, en het voeden en drinkgedrag moet worden dagelijks gecontroleerd.
4. Euthanasia
- Aan het einde van elk experiment zijn ratten worden gedood met natrium pentobarbital (2-3 ml intraperitoneaal).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle occlusie van een vat kan worden bevestigd met laser speckle imaging (LSI) onder bloedstroom beeldvormingstechnieken. De bloedstroom in de belangrijkste corticale takken van MCA moet dalen tot ~ 25% van de uitgangswaarde of minder na een occlusie afhankelijk van het niveau van ruis in het opnamesysteem en de gevoeligheid van de techniek. Zie Figuur 3 voor een representatieve LSI beeld van een segment van een corticale tak van MCA voor en na MCA occlusie. Wanneer de occlusie beschreven techniek wordt toegepast op de MCA M1 segment, blokkeren van alle corticale MCA takken en sensorische stimulatie belet ~ 5 uur na een occlusie, het resultaat is een corticaal infarct van 28,4 ± 2,4 mm 3 (voor een representatieve coronale schijfje een 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchloride [TTC] gekleurd hersenen met de beschreven schade, zie figuur 2; bleke ongekleurde gebied komt overeen met infarct) 25.
Figuur 1. Gele pijlen geven geschatte locatie van pMCAO bij de M1-segment. Dit occlusie voorbeeld betreft het afsluiten van MCA net distaal van de lenticulostriate vertakking, voorafgaand aan alle corticale vertakking, waardoor het afsnijden van de bloedtoevoer naar alleen corticale takken. (A) Schematische weergave van MCA op laterale corticale oppervlak. (B) Coronale weergave van geschatte MCA corticale en subcorticale filialen. Merk op dat occlusie van de MCA proximale naar lenticulostriate vertakking zal resulteren in corticale en subcorticale infarct, al is de toegang tot dit gebied vereist een relatief invasieve chirurgische procedure. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Single vertegenwoordiger coronale slice van een rat hersenen tonen infarct als gevolg van pMCAO (met zorg genomen om beschermende sensorische stimulatie minimaliseren voor 5 uur na een occlusie). 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchloride (TTC) oplossing vlekken gezond weefsel roodachtig en laat gebieden van celdood of infarct (aangegeven met de pijl) bleek. Merk op dat als gevolg van de locatie van de occlusie (voorafgaand aan alle MCA corticale takken maar distaal naar subcorticale takken) alleen corticale infarct wordt waargenomen, en zeer myelinated gebieden van de hersenen nemen niet de TTC-oplossing en zal dus wit van kleur blijven, ondanks die structureel intact.
Figuur 3. Image toont stroming in een gedeelte van een corticale tak van MCA voor en eenfter pMCAO zoals afgebeeld met behulp van laser spikkel imaging (LSI). Warmere kleuren geven sterkere stroming. De beschreven MCA tak is duidelijk zichtbaar de basislijn afbeelding (links) doorkruisen van de linker naar de rechter bovenhoek en verdwijnt na pMCAO. Opmerking: af en toe wat minimale bewijs van stroming blijft in een bepaalde branche, maar na pMCAO niveaus moeten dalen tot 20% of minder van de basislijn stroom naar occlusie succes te bevestigen.
. Figuur 4 Chirurgische Benodigd gereedschap voor pMCAO (A) Extra Fine Graefe pincet -.... 0.5 mm Tips Slight Curve (B) Keramische gecoate Dumont # 5 tang (C) Extra Fine Bonn Schaar, recht (D) Ronde 3/8 (16 mm) hechtnaalden (E). OPMERKING: Hechtnaalden kan shortened via wire cutters volgens de voorkeur van de gebruiker. Na het inkorten met draad cutters, moet hechtnaalden worden gesteriliseerd. (F) 6-0 gevlochten zijden hechtdraad. (G) 30 gauge naald, ½ in lengte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol werd ontwikkeld om ischemie te induceren binnen het knaagdier cortex, en wel met een minimale impact op perifere proefpersonen. De dubbele occlusie en doorsnijding methode zorgt voor visuele bevestiging dat het schip is definitief afgesloten, en kan worden uitgevoerd zonder overmatige invasie of weefselschade, en met een hoge overlevingskans. Dit occlusie protocol kan worden toegepast op elke corticale vaartuig dat toegankelijk via craniotomie teneinde ischemie bij een bepaalde corticale domein induceren. Bovendien kunnen dergelijke occlusies worden uitgevoerd terwijl een dier in een stereotaxische inrichting waarmee het gelijktijdig gebruik van verschillende experimentele technieken, zoals functionele beeldvorming of elektrofysiologische opname. Dit maakt deze occlusie techniek toepasbaar op een breed scala van experimentele ontwerpen, met inbegrip van onderzoek binnen-onderwerp. Bijvoorbeeld, kan de beoordeling bij aanvang worden uitgevoerd hechtingen in plaats rond de Artery (maar voorafgaand aan het veiligstellen van de hechtingen en doorsnijden), tijdens ischemische onset, en op elk post-occlusie tijdstip nodig.
Succesvolle uitvoering van deze occlusie is afhankelijk van twee kritische stappen. Ten eerste, een goede visualisatie van het beoogde bloedvat is cruciaal voor het induceren van ischemie. Occlusie op een locatie proximaal of distaal van de gewenste locatie (in ons typisch geval, net proximaal van de primaire anterieure / posterieure corticale splitsing van MCA) kan resulteren in een grote mate van variabiliteit infarct volume moet dus worden gezorgd voor het bevestigen juiste plaats van occlusie en doorsnijding. Ten tweede, het passeren van de hechtdraad naald rond het doel slagader vereist een zorgvuldige en nauwkeurige techniek. Door de noodzaak, de hechtdraad door de meest oppervlakkige laag van de cortex direct onder de slagader. Zorg moet worden genomen om te duiken diep voorkomen in het corticale oppervlak, omdat dit kan resulteren in vat scheuren, bloedingen of schade aan de hersenen bij de occlusion website. Terwijl vele soorten bloedvat occlusie chirurgische instrumenten zijn beschikbaar, heeft ons lab had het meeste succes met de helft curve hechtnaalden, afgekapt volgens experimentator voorkeur. Gebruikt in combinatie met ultra-fijne tang, deze tool kan de gebruiker hechtdraad onder een slagader en boven de corticale oppervlak met slechts minimale weefselschade passeren.
Na succesvolle voltooiing van een occlusie, infarct is beperkt tot de cortex alleen (Figuur 2). In het kader van het gebruik van deze occlusie methode om model MCA beroerte, kan dit hebben belangrijke implicaties voor onderzoekers gezien het feit dat veel MCA CVA-patiënten ondersteunen infarct binnen zowel de cortex en de basale ganglia. Echter, ons laboratorium begunstigt deze occlusie methode zoals toegepast op MCA dan technieken zoals intraluminale hechtdraad gezien de recente bevindingen dat verminderde kauwen, slikken functie en verminderde motorische prestaties optreden in 47% van alle onderwerpen die intralumi ondergaannal hechtdraad 35; verminderde cerebrale perfusie en verminderde spontane motorische activiteit als gevolg van verminderde voedsel-en wateropname ook bijdragen tot slechtere neurologisch herstel bij ratten na intraluminale hechtdraad 36-40. Trueman et al.. 2011 hebben ook gemeld abnormale eten, verminderde drinkgedrag, en sensomotorische handicap (zoals gekwantificeerd door de lijm taak verwijderen) na deze procedure 11. Kritisch, zagen we hetzelfde gedragstekorten in sham intraluminale hechtdraad dieren 11. Daardoor kan intraluminale hechtdraad ernstig verstorende factoren toe te voegen aan preklinische CVA studie-waarvan vele direct toerekenbaar zijn aan de chirurgische procedure en niet om cerebrale ischemische beroerte.
Het is onmogelijk om de variabele etiologie en pathologie van menselijke ischemische beroerte model - in feite een dergelijke hoge mate van variabiliteit ongewenst in een experimenteel model zijn. Beroerte onderzoek bij dieren moet instead richten op het produceren van een resultaat meer analoog aan de menselijke beroerte schade en tekorten tijdens een poging om model etiologie zo goed mogelijk. We stellen voor dat de minimaal invasieve aard, occlusie van MCA resulteert in ischemie, infarct volume dat vergelijkbaar menselijke MCA ischemie en mogelijkheid om meerdere experimentele technieken naast pMCAO nemen deze methode een aantrekkelijk alternatief voor enkele preklinische beroerte onderzoekers kunnen maken. Bovendien, de occlusie werkwijze hier gemodelleerd pMCAO een alternatief, minimaal invasieve, effectieve middelen voor het afsluiten van elk oppervlak corticale vat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen op dit moment.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association predoctorale Fellowship 788808-41910, de NIH-NINDS NS-066001 en NS-055832, en het Center for Hearing Research NIH Training Grant 1T32DC010775-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) | Fine Science Tools | 11151-10 | |
| Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Round 3/8 (16 mm) Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| 6-0 Braided Silk Suture | Fine Science Tools | NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461 |
|
| 30 gauge needle, ½" length | Fine Science Tools | NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL |
References
- Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. , 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
- Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. , Sinauer Associates. (2002).
- Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2011).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
- Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
- Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang , Spring Science & Business Media. New York. (2010).
- Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123 (Pt. 5), 940-953 (2000).
- Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
- Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
- Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
- Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
- Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
- Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
- Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os , Oxford Scholarship Online. (2006).
- Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
- Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
- Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. , (2012).
- Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
- Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. , CRC Press. 17-30 (2009).
- Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
- Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A.
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
- Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
