Summary
Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.
Abstract
Aquí se presenta un flujo de trabajo para analizar los perfiles metabólicos en muestras biológicas de interés, incluyendo: células, suero o tejido. La muestra se separa primero en fracciones polares y no polares por una extracción en fase líquido-líquido, y se purificó parcialmente para facilitar el análisis aguas abajo. Ambas fases acuosas (metabolitos polares) y metabolitos orgánicos (no polares) de la extracción inicial se procesan para medir un amplio rango de metabolitos. Los metabolitos se separaron mediante diferentes métodos de cromatografía de líquidos en base a sus propiedades de la partición. En este método, presentamos microflow ultra-desempeño (UP) los métodos de LC, pero el protocolo es escalable a los flujos más elevados y presiones más bajas. La introducción en el espectrómetro de masas puede ser a través de cualquiera de las condiciones generales de origen optimizadas o compuesto. La detección de una amplia gama de iones se lleva a cabo en el modo de barrido completo tanto en modo positivo y negativo en un amplio rango de m / z usando alta resolución en una recientemente calibrated instrumento. Etiqueta libre de análisis diferencial se lleva a cabo en las plataformas bioinformáticas. Las aplicaciones de este enfoque incluyen la detección vía metabólica, el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de fármacos.
Introduction
Debido a los recientes avances tecnológicos en el campo de HRMS, no focalizados, generador de hipótesis metabolómica enfoques se han convertido en un enfoque viable para el análisis de muestras complejas. 1 espectrómetros de masas capaces de facilitar la resolución 100000 de rutina bajo parte por millón (ppm) de masa de precisión han sido ampliamente disponible de varios proveedores. 2,3 Esta masa de precisión permite una mayor especificidad y la confianza en una asignación preliminar de la identidad del analito, reconocimiento de patrones isotópicos, y la identificación aducto. 4 Cuando se combina con un procedimiento de extracción adecuado y de alto rendimiento LC o UPLC, mezclas complejas puede ser analizado con especificidad adicional derivada de los datos de tiempo de retención. 5 UPLC posee una mayor eficiencia cromatográfica y permite tiempo mayor sensibilidad, resolución y análisis que expresa una mayor cobertura de la metaboloma posible. 6 Los grandes conjuntos de datos resultantes se pueden integrar en cualquierde software de análisis diferencial múltiple y extraídos de los patrones de útiles individuales o analitos de interés. 7,8,9,10,11 impacta putativos se pueden identificar inicialmente utilizando una combinación de algoritmos de detección de picos, basada en la predicción exacta fórmula química masa, la predicción de la fragmentación, y químico búsqueda de base de datos. Este enfoque permite la priorización de los objetivos de tiempo de identificación estructural completo o para el desarrollo de la dilución del isótopo estable más sensible y más específica UPLC / seleccionado o múltiples reacción monitoreo / estudios de MS, que son los actuales métodos estándar de oro para la cuantificación. 12
La naturaleza variable de las muestras biológicas ha conducido a la optimización de protocolos de extracción de orina 13, 14 células, suero de 15, 16 o tejido. Este protocolo de extracción de características para las células, el suero, y el tejido. En su caso, las observaciones y referencias adicionales se han incluido modificacionesción del procedimiento para abordar la inclusión de los isótopos estables, o la inclusión de metabolitos especialmente inestables.
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Protocol
1. Extracción de muestras a partir de células
- Para una placa de 10 cm de células: recolectar 1,5 ml de suspensión de células levantado en los medios de comunicación en un tubo de centrífuga de 10 ml de vidrio previamente etiquetado. Para las líneas de adherentes, las células deben ser levantadas con raspado suave en 1,5 ml de medio mantenido en hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una alícuota adecuada en este paso.
Comentario: enfriamiento del metabolismo celular es crucial para ciertos metabolitos. Para el análisis de los metabolitos sensibles al tiempo, se deben considerar los procedimientos tales como extracción con metanol frío. 17 - Añadir 6 ml de cloroformo (CHCl3) / metanol (CH3OH) (02:01, v / v) a cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen las muestras. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min. Después de agitar, se centrifugan las muestras con un nivel bajo de aceleración / desaceleración en 1935 xg durante 10 min a 4 ° C para separar completamente las fases.
Opcional CHCl3, se pueden realizar extracciones con diclorometano (CH 2 Cl 2) 18,12. - El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1.
- Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno. Continuar 2.6.2 para desalación fase acuosa o continuar hasta el 4,1 para el análisis directo.
2. Extracción de muestras de suero
- Transferir 20 l de suero en un tubo Eppendorf de 2 ml de plástico Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una parte alícuota apropiada en este paso.
- Añadir 190 l de CH 3 OH y agitar durante 10 segundos.
- Añadir 380 l de CHCl3 y agitar durante 10 seg.
- Añadir 120 l de H 2 O para inducir la separación de fases. Vortex las muestras durante 10 segundos y permitir que se equilibre a temperatura ambiente durante 10min.
- Centrifugar las muestras a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C para separar las fases.
- Pasar la fase orgánica inferior en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Continúe 4.1.
- Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno.
- Vuelva a suspender la muestra en 200 l H 2 O. Reactivos de ácido o base (0.1% de ácido acético, ácido fórmico o hidróxido de amonio al 0,1%) pueden ser utilizados para extraer preferentemente metabolitos sensibles al pH. Someter a ultrasonidos durante 20 min en hielo para volver a suspender la muestra completamente.
- Active las columnas giratorias C18 con 500 l CH 3 OH.
- Equilibrar la columna de centrifugación con dos lavados de 500 l H 2 O y luego cargar la muestra. Si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado.
- Lavar con 500 l H 2 O para desalar la muestra. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en el lavadopasos.
- Eluir con dos volúmenes de 200 l 80% CH3OH en H 2 O en un 2 ml tubo Eppendorf limpio previamente etiquetado. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado. Continúe 4.1.
3. Extracción de muestras de tejido
- Dependiendo del tejido, utilizar entre 10-100 mg de tejido congelado. Añadir toda la pieza de tejido a un 2 ml bajo tubo Eppendorf de retención de pre-marcado con 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) en un baño de hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir en la memoria intermedia, antes de añadir el tejido.
- Se homogeneiza el tejido en hielo con un triturador de tejidos eléctrico durante 30 segundos en cada Eppendorf. Entre las muestras, limpiar el triturador de tejidos en dos tubos separados que contienen CH 3 OH y H 2 O, respectivamente.
- Transferir el homogeneizado de tejido con una pipeta de plástico de 10 ml en un tubo de centrífuga de vidrio previamente etiquetado. Después de la transferencia, enjuague cada tubo Eppendorf2x con 1 ml de CH3OH y añadir los lavados a la homogeneizado de tejido en los tubos de vidrio.
- Añadir 4 ml de CHCl3 para cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen el homogeneizado de tejido y CH 3 lavados OH. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min.
- Después de agitar, centrifugar las muestras con un nivel bajo de aceleración / deceleración a 1935 xg durante 10 minutos para separar completamente las fases Opcional:. Para evitar el uso de cloroformo, extracciones se han desarrollado con CH 2 Cl 2.
- El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1.
- El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transferir la fase acuosa a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Ir a la 2.6.2 de desalación o continuar 4.1.
4. Re-suspensión y filtración de las muestras para la UPLC
- Se evapora el samples bajo gas nitrógeno.
- Reconstituir secó abajo muestras en un volumen apropiado de la solución de partida para el método UPLC deseada (véase la Tabla 1). 50-100 l es por lo general un volumen de re-suspensión deseable. Vórtice suavemente y / o una pipeta la muestra hacia arriba y hacia abajo para ayudar a disolver los analitos.
- Transferir la muestra en un tubo de 0,22 micras filtro de nylon y giran a hasta 14.000 xg hasta que la muestra ha pasado completamente a través del filtro (~ 5 minutos). Asegúrese de que no hay precipitados visible que queda en la muestra.
- Transferir el sobrenadante de la muestra filtrada en un vial de UPLC de pre-marcado con inserto. Tapa del vial, a continuación, chasquear el vial para eliminar las burbujas de la parte inferior del vial de muestra. Colocar la muestra en el inyector automático refrigerado (4-5 ° C).
5. Configuración UPLC
- Utilizando el software de control para el cromatógrafo de líquidos, crear una carrera por la muestra orgánica con sede fuera de las condiciones enumeradas en
- Deje que la UPLC se equilibre adecuadamente. Esto debe incluir un cebado completo de disolventes antes de colocar una columna, y siguiendo las instrucciones del fabricante para el volumen de equilibrio de una nueva columna (generalmente 3-5 volúmenes de columna). Mantener un registro de iniciar de nuevo la presión para ayudar a diagnosticar problemas en el futuro.
6. Configuración espectrómetro de masas
- Usando el software de control para el espectrómetro de masas de alta resolución, crear un método de modo positivo usando las condiciones que se indican en la Tabla 2. Luego, utilizando las mismas condiciones, crear un método de modo negativo Opcional:. Si un conjunto conocido de los analitos de interés son de alta interest, fuente de optimizar y condiciones óptica utilizando la pesada etiqueta analógica de estos compuestos, y generar un método que utiliza estas condiciones.
- Limpiar y calibrar el instrumento, establecer un aerosol estable en el espectrómetro, y dar tiempo para la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica. Estabilidad aceptable de aerosol debe dar un 3-5% RSD de la intensidad sobre al menos 100 exploraciones con la inyección de solución de calibración a la misma velocidad de flujo como se utiliza el método de LC.
- Establecer la secuencia de todas las muestras, ajustar el volumen de inyección adecuada y ejecute un espacio en blanco antes de la primera muestra. Si se sospecha de remanentes o matriz efectos entre las muestras, ejecute blancos / lavaderos adecuados. Las muestras deben ser configurado de una manera al azar utilizando un generador de números aleatorios y una clave para evitar los efectos introducidos por lotes por el análisis.
Comentario: las muestras de control de calidad, incluidas las normas de isótopos estables o estándares analíticos de posibles objetivos pueden serextremadamente valioso en la solución de problemas y asegurar resultados fiables y reproducibles y válidos. Una técnica de reproducir de una única muestra estándar seguido por un blanco de disolvente se puede utilizar para accesos de desviación de intensidad de la señal y tiempo de retención, así como el arrastre en el ensayo en blanco. - Comienza la secuencia y seguimiento periódico de problemas, incluyendo las fluctuaciones de presión o pérdida de intensidad de la señal a través de la ejecución. Si se detectan problemas graves, detener la carrera, y repetir de 6.2.
7. Análisis diferencial
- Dos flujos de trabajo se presentan en este protocolo. La primera es a través del tamiz 2.0, el software de análisis diferencial libre de marca patentada vendido por Thermo Fisher. El segundo flujo de trabajo es a través de XCMS Online, una plataforma gratuita a través del Instituto de Investigación Scripps. 11 Antes de comenzar el análisis diferencial, comprobar manualmente las TICs o mirar cromatogramas filtrados para cualquier compuesto conocido en la muestra para asegurar la reproducibilidad de las carrerasy la inyección / estabilidad UPLC / aerosol a través de todas las muestras.
- CRIBA
- Transfiera los archivos de datos brutos. Desde el espectrómetro de masas en el disco duro de la estación de trabajo donde está instalado tamiz. (Nota: correr tamiz con los datos almacenados en una unidad conectada en red o el puerto USB no es recomendable, ya que puede limitar la velocidad de análisis.)
- Abrir TAMIZ, y comenzar un nuevo experimento.
- Cargue los archivos correspondientes en tamiz.
- Asignar los grupos de comparación y seleccionar un archivo de referencia único para permitir tamiz para generar los parámetros para el análisis.
- Siga las instrucciones y ajustar los parámetros según los requisitos de cualquier experimento individual. A menudo es aconsejable comenzar con parámetros estrictos, y luego ir hacia atrás y afloje los parámetros de configuración a medida que más generosos pueden alargar el tiempo de análisis.
- Cargue la lista aducto correcta para el modo positivo o negativo en los parámetros.
- XCMS Online
- Convertir archivosen un formato aceptable para XCMS línea. En nuestro caso, nos convertimos al formato mzXML. 19
- XCMS abiertas en línea, y crear empleo.
- Subir y nombrar los conjuntos de datos. Sólo dos conjuntos de datos (por ejemplo, control vs tratamiento) se pueden cargar como XCMS independientes se limita a comparaciones cara a cara.
- Seleccione los ajustes que desee de la lista desplegable. Parámetros pre-pobladas están disponibles para diferentes configuraciones de instrumentación, y estos pueden ser modificados aún más para las necesidades experimentales. En nuestro caso, utilizamos la configuración HPLC-Orbi2.
- Enviar y confirme trabajo.
- Análisis de Datos
- Para colador y XCMS una lista de marcos y características, respectivamente, se llenará una vez finalizado el análisis. Asegúrese de que la alineación LC superpone los picos emblemáticos. Si cualquiera de las carreras no alineados LC muestran gran desviación en los picos de señal esto puede indicar un problema con la muestra.
Opcional: Para tamiz, si se utilizan las normas internas, busqueel grupo pico correspondiente y normalizar el marco seleccionado. Para XCMS On-line, la normalización puede realizarse en una hoja de cálculo después de la exportación. - Representar gráficamente los datos por el coeficiente de variación (CV) dentro de una población de la muestra como (por ejemplo, muestras de control). Los grandes valores de CV pueden indicar un problema con uno o más de la muestra. Ordenar la lista en función de las características deseadas (por ejemplo, valor de p <0,05, doble cambio> 1,5, baja desviación estándar dentro de un grupo, etc.)
- Examine cada pico para una alineación apropiada pico entre los grupos, la integración de picos, pico gaussiano forma, intensidad de la señal, los isótopos y la asignación aducto.
- Exportar datos como se desee para su posterior análisis o para generar listas masivas dirigidas para confirmación y MS n experimentos.
- Para colador y XCMS una lista de marcos y características, respectivamente, se llenará una vez finalizado el análisis. Asegúrese de que la alineación LC superpone los picos emblemáticos. Si cualquiera de las carreras no alineados LC muestran gran desviación en los picos de señal esto puede indicar un problema con la muestra.
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Representative Results
Los resultados presentados muestran los datos seleccionados de un tratamiento de 6 h de células de glioblastoma SH-SY5Y con el pesticida y complejo mitocondrial I rotenona inhibidor. Por razones de brevedad, se presenta sólo los datos en modo de fase positivos orgánicos. Las muestras se procesaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 1, Tabla 1, Tabla 2) y se cargaron en dos plataformas de análisis diferencial de la etiqueta libre de cuantificación, colador y XCMS línea. Aunque un gran número de impactos (Figura 2, Figura 3) se identifican por los dos programas utilizados para el análisis diferencial de estas características son posibles artefactos, picos mal integrados, y otras características de valor analítico cuestionable. Esto puede ser juzgado por la detección de los golpes de intensidad de señal adecuada, baja variación entre muestras de un mismo grupo, los niveles de fondo y buenas formas de los picos cromatográficos (Figura 3).
Para demostrar la downstream confirmación de éxitos iniciales, aislamos una característica con una masa correspondiente a nuestra rotenona compuesto de tratamiento a menos de 3 ppm (Figura 3, Figura 4). Confirmamos la identidad de este analito con UPLC-HR/tandem espectrometría de masas (MS / MS) de la muestra y el compuesto puro (Figura 5). También identificamos una característica diferencial abundante reducido en el grupo tratado con rotenona, tentativamente identificado como D-pantethine de la documentación precisa la búsqueda de bases de datos en masa (Figura 3).
Figura 1. Esquema experimental general para la preparación de muestras y análisis por Microspray UPLC-HRMS. Un esquema general de preparación de la muestra, incluida la introducción opcional de las normas internas y las proteínas o lípidos / análisis de contenido de proteínas. La separación de fases, la cromatografía líquida, y el análisis de diferentes ion modos en el espectrómetro de masas se exponen.
Tabla 1. Condiciones UPLC. Generales y compuestos condiciones UPLC optimizadas. Para la fase orgánica 1, velocidad de flujo constante de 1,8 l / min a través de una columna Waters C18 nanoACQUITY BEH130 mantenido en una estufa a 35 ° C se utilizó. Disolvente A: 99,5% de acetonitrilo water/0.5% con ácido fórmico al 0,1%, Disolvente B: 98% de acetonitrilo / 2% de agua con ácido fórmico al 0,1% Para la fase orgánica 2, velocidad de flujo constante de 3,4 l / min a través de una columna C8 Acentis expreso mantiene en una estufa a 35 ° C se utilizó. Disolvente A: 40% agua y 20% acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% y formiato de amonio 10 mM, Disolvente B: 90% de acetonitrilo isopropanol/10% con ácido fórmico al 0,1% y formiato de amonio 10 mM Para la fase acuosa, la tasa de flujo constante de 1,2 μ l / min a través de una columna Waters C18 nanoACQUITY BEH130 mantiene en una estufa a 35 ° C se utilizó. Disolvente A: 95% de agua / 5% de metanol con 0,1% hidróxido de amonio, Disolvente B: 95% de metanol / 5% de agua con hidróxido de amonio al 0,1%.
Figura 2. Espejo Solar Generada con XCMS. Una parcela espejo que muestra las características diferencialmente abundantes según lo detectado y cuantificado a través XCMS en línea desde el modo de fase de análisis orgánico positivo UPLC-MS. Cada punto representa una "característica". Distinta Los puntos verdes son las características más abundantes (área integrada más grande) en el control, mientras que los puntos rojos son más abundantes en el tratamiento. El aumento de tamaño del punto indica el aumento de la magnitud del cambio veces entre los grupos, y la intensidad de color indica un p-valor decreciente con el aumento de la saturación de color.
Figura 3. Peaks analito. Cromatogramas muestran el modo de fase de análisis UPLC-MS de iones positivos orgánica. A) Corregido (alineados) corriente de iones totales (TIC) de tamiz de 2,0. B) extrajeron cromatograma de iones para la función tentativamente identificado como D-pantethine través XCMS. C ) Extraído cromatograma de iones para la función posteriormente identificado como la rotenona del tamiz. D) XIC para la función posteriormente identificado como la rotenona del tamiz normalizado a TIC. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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La Figura 4. Base de datos. Resultados de la búsqueda resultados de base de datos para A) Base de datos metaboloma Humanos ( http://www.hmdb.ca ) y B) Propiedades físicas / KEGG (a través de tamiz) (Propiedades físicas por sí sola también puede ser empleado - http://www.chemspider.com ) mediante determinaciones precisas de masa de las características mostradas en las figuras 3B, 3C y 3D correspondientes a los iones de m / z 555,2516 y 395,1481 basado en la identificación de estos iones como [MH] + especies. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 5. HR / MS / MS SConfirmación ESTRUCTURALES. Confirmación de la identificación de la función que corresponde a la de iones a 395.1481 m / z con un tiempo de retención de 23,22 min como rotenona basado en la comparación UPLC-MS/MS a un nivel comercial con A) el tiempo de retención similar y B) del mismo m / z (395.1481, ~ 0 error ppm) con la fragmentación casi idénticos. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
| La espectrometría de masa Parámetro | Ajuste | Comentario |
| Fuente | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Modelo | Positivo o Negativo | |
| Método Largo | Variable (~ 40-60 minutos) | |
| Resolución | 60.000-100.000 | |
| Aerosol (kV) | 1.75 | |
| Tube Lens (V) | 130 | Compuesto Objetivo Dependiente |
| Temperatura Capilar (° C) | 250 | Puede acortar la vida de la boquilla de pulverización |
| Capilar Voltaje (V) | 50 | Compuesto Objetivo Dependiente |
| Tipo de datos | Centroid | (Para los datos del perfil, ver Discusión) |
Tabla 2. Configuración de MS. Generales y compuesto optimizado los ajustes del espectrómetro de masas utilizados para el LTQ XL-Orbitrap con Thermo cautiva fuente ESI aerosol Avance Michrom.
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Discussion
Untargeted metabolómica ofrece una poderosa herramienta para la investigación de biotransformaciones endógenas o xenobióticos, o la captura de un perfil metabólico de una muestra de interés. La salida de las escalas técnica con la resolución y la sensibilidad de la tecnología utilizada para separar y analizar la muestra, la capacidad para hacer frente a los grandes conjuntos de datos generados, y la capacidad de extraer el conjunto de datos para obtener información útil (por ejemplo, precisa la búsqueda de bases de datos en masa). Recientemente, esto ha sido posible gracias a los avances en los espectrómetros de masas de alta resolución y cromatografía de alta o ultra rendimiento líquido. Software de análisis diferencial ha abordado el cuello de botella en el análisis, y puede llevar a cabo el ajuste de detección de picos para los turnos de tiempo de retención, filtrado, y el análisis estadístico con alto rendimiento. 20,21,22 Selección de la tubería informática adecuada debe incluir consideraciones como a los datos centroiding algoritmos, detección de pico, pico de la integración, alignment, capacidad de integrar datos de MS / MS, y su capacidad para tratar con isótopos o aductos. 23 Selección de bases de datos apropiadas cheminformatics también debe ser considerado. 24,25,26,27 La insuficiencia actual de cualquier base de datos en particular para identificar compuestos ampliamente e integrar datos de masa exacta, MS / MS datos o LC de datos sigue siendo un problema importante en el campo.
El flujo de trabajo que aquí se presenta integra la extracción líquido-líquido, cromatografía líquida de micro-circulación, y la espectrometría de masas de alta resolución con dos plataformas de software de análisis diferenciales distintos demostrado en un modelo de tratamiento de cultivo celular. Además, los protocolos de extracción se enumeran para el suero y el tejido, ya que éstos pueden servir como muestras útiles para análisis similar.
Aunque cualquier método utilizado para la metabolómica no orientados, debe ser optimizado para repetibilidad, UPLC condiciones estables, y la estabilidad fuente, alguna variación es inevitable. Tanto colador y XCMS asignaciónw corrección de desplazamiento de tiempo de retención, pero se debe prestar especial atención a asegurar que los parámetros establecidos en el experimento son adecuadas para corregir la variación. Además, isótopos estables marcado patrón interno (s) se puede integrar fácilmente en este procedimiento para reducir los artefactos y la variación entre muestras causado por las diferencias en las extracciones de muestras o análisis LC-MS. 12 Al igual que con todas las sensibles metodología LC-MS, es crucial utilizar reactivos de alta pureza, y asegurar que la preparación de la muestra elimina las partículas indeseables o agregado. Los artefactos pueden ser generados por la variación normal en los contaminantes, y que pueden ser deseables para confirmar que impacta putativo no son, de hecho, los contaminantes ubicuos de el proceso de extracción o análisis.
Por último, aunque el método se etiqueta como la metabolómica "no directo" o "imparcial", este es un nombre inapropiado parcial. La naturaleza de la extracción, separación, y el análisis favorecerá metabolitos con ciertas caractics, por ejemplo la estabilidad durante la extracción, la interacción con estacionaria y fases móviles durante la separación, y en la fuente de ionización del espectrómetro de masas. 28,29,30 Dependiendo de la instrumentación disponible, este procedimiento se pueden adaptar a diferentes extracciones, caudales, presiones LC , fuentes de iones, o espectrómetros de masas. Por lo tanto, se han incluido notas en el procedimiento en el que ciertas condiciones se pueden optimizar en base al conocimiento general o representante de los estándares internos de una clase de moléculas de interés.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo de subvenciones del NIH P30ES013508 y 5T32GM008076. También damos las gracias Thermo Scientific para acceder a SIEVE 2.0 y los Dres. Eugene Ciccimaro y Mark Sanders de Thermo Scientific útil para los debates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
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