Summary
La protéine de nucléoïde mitochondrial de la levure, Mgm101, est une protéine de recombinaison Rad52 type qui forme des gros anneaux oligomères. Un protocole est décrit pour préparer Mgm101 recombinant soluble avec la protéine de liaison du maltose (MBP)-tagging stratégie couplée avec échange de cations et la chromatographie d'exclusion stérique.
Abstract
Le gène a été identifié MGM101 il ya 20 ans pour son rôle dans le maintien de l'ADN mitochondrial. Études réalisées dans plusieurs groupes ont suggéré que la protéine Mgm101 est impliqué dans la réparation par recombinaison de l'ADN mitochondrial. Des études récentes ont indiqué que Mgm101 est lié à la famille des protéines de recombinaison Rad52 type. Ces protéines forment des anneaux oligomères et de promouvoir l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Cependant, la caractérisation des Mgm101 a été entravée par la difficulté à produire la protéine recombinante. Ici, une procédure fiable pour la préparation recombinante de Mgm101 est décrite. Protéine liant le maltose (MBP) étiquetée Mgm101 est d'abord exprimé dans Escherichia coli. La protéine de fusion est d'abord purifié par chromatographie d'affinité en amylose. Après avoir été libéré par clivage protéolytique, Mgm101 est séparée de MBP par chromatographie d'échange cationique. Monodispersé Mgm101 est alors obtenuepar chromatographie d'exclusion de taille. Un rendement de ~ 0,87 mg de Mgm101 par litre de culture bactérienne peut être obtenue régulièrement. Le Mgm101 recombinante a un minimum de contamination de l'ADN. Les échantillons préparés sont utilisés avec succès pour biochimiques, structurelles et unique analyse d'images de particules de Mgm101. Ce protocole peut aussi être utilisé pour la préparation d'autres grandes protéines liant l'ADN oligomères qui peuvent être mal repliées et toxique pour les cellules bactériennes.
Introduction
La recombinaison homologue est important pour la réparation des cassures double-brin (CDB) et interbrins réticule, et pour la reprise de la réplication de l'ADN à partir des fourches de réplication effondrées 1. En recombinaison homologue conventionnelle, la réaction central est catalysée par les recombinases ATP-dépendants dont RecA chez les procaryotes et Rad51 et Dmc1 chez les eucaryotes 1-3. Ces recombinases former des filaments nucléoprotéiques sur ssDNA, qui sont essentiels pour initier recherche d'homologie et l'invasion de brin au sein de matrices d'ADN duplex (figure 1, cadre de gauche) 4-7. En plus du schéma classique, la recombinaison homologue peut également avoir lieu d'une manière RecA/Rad51-independent (figure 1, cadre de droite). Par exemple, la levure RAD52 et Rad59 protéines peuvent directement catalyser le recuit de brins d'ADN simple brin complémentaires qui sont exposées par la résection des pauses ADN double brin. Ce processus de recombinaison, connu sous le nom chanterLe fil recuit, généralement n'implique pas appariement homologue des modèles ADN double brin. Après recuit, les queues hétérologues sont éliminés par des exonucléases et pseudos sont ligués pour restaurer 8-10 continuité du génome. Réparation par le mécanisme de recuit simple brin est souvent accompagnée de suppressions de séquences génomiques entre les régions directement répétées.
Rad52 appartient à un groupe diversifié de protéines de recombinaison qui sont répandues parmi les bactériophages 11. Ces protéines sont également connus comme simples protéines recuit Strand (SSAP), en fonction de leur activité dans la promotion de l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Les meilleurs SSAP de bactériophages sont caractérisés Redβ et Erf du bactériophages λ et P22, RecT du prophage rac et la protéine Sak du phage lactococcal UL36. Les SSAP sont structurellement caractérisées par un pli β-β-β-α typique, bien similitude est pratiquement indétectablepouvoir dans leurs séquences primaires. Tous ces pays sont de grands anneaux homo-oligomères de 10-14 symétrie in vitro 12-14. Les conséquences fonctionnelles de cet ordre organisation structurelle plus caractéristique n'est pas bien comprise.
Nous sommes intéressés à comprendre le mécanisme de recombinaison homologue dans le génome mitochondrial. Nous avons déjà identifié le gène MGM101 qui est essentielle pour le maintien de l'ADNmt dans Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 a ensuite été trouvée associée avec nucléoïdes mitochondriales et est nécessaire pour la tolérance de l'ADNmt à des agents endommageant l'ADN 16. Cependant, l'étude de Mgm101 a été retenu dans la dernière décennie par la difficulté de produire Mgm101 recombinant. Nous avons récemment réussi à produire Mgm101 soluble à de grandes quantités de E. coli en utilisant la stratégie de fusion MBP. Cela nous a permis de démontrer que Mgm101 actionssimilitudes biochimiques et structurales avec la Rad52-famille de protéines 17,18. Dans ce rapport, une procédure de purification en trois étapes est décrite, qui produit Mgm101for analyses biochimiques et structurales homogènes (figure 2).
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Protocol
Des études antérieures ont montré que les 22 premiers résidus amino-terminaux de Mgm101 sont clivés après l'importation dans les mitochondries 19. Pour l'expression chez Escherichia coli, le cadre de lecture ouvert MGM101 dépourvue des 22 premiers codons est amplifié par PCR et placé en aval de la séquence malE codant pour la protéine de liaison du maltose (MBP), dans une version modifiée du vecteur d'expression pMAL-C2E. Ceci génère la fusion MBP-Mgm101 avec un élément de liaison contenant un site de clivage pour la protéase de PreScission (figure 3). Le plasmide est construit d'abord en sélectionnant E. transformants coli sans IPTG et la sélection bleu / blanc Xgal. Le plasmide pMAL-C2E-MGM101 résultant est ensuite introduit dans le E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL en sélectionnant l'ampicilline et les colonies résistantes au chloramphénicol.
1. Expression, Induction, lyse cellulaire et DNase I Traitement
- Inoculer transformants fraîches dans 10 ml de milieu LB (1% Bactotryptone, 0,5% d'extrait de levure, NaCl 1%) additionné de glucose (0,2%), l'ampicilline (100 pg / ml) et le chloramphénicol (50 pg / ml). Incuber à 37 ° CO / N avec agitation à 200 rpm.
- Inoculer le 10 ml de préculture dans 2 litres de milieu LB supplémenté comme ci-dessus. Cultiver les cellules à 37 ° C avec agitation jusqu'à DO600 atteigne 0,5.
- Induire l'expression de la protéine de fusion MBP-Mgm101 en ajoutant isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,3 mM. Cultiver les cellules avec pendant 5 heures sous agitation à 30 ° C.
- Recueillir les cellules par centrifugation à l'aide d'un Beckman JA-10 rotor (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Après élimination du surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 et 1 mM EDTA, pH 7,4) contenant des inhibiteurs de la protéase (25 pM de leupeptine, 1 pM de pepstatine A et 1 mM PMSF).
- Soniquer suspension cellulaire sur la glace pendant 20sec à l'aide d'un processeur ultra-sons (Systèmes de chaleur; modèle W-385) au cycle de service de 50%, laisser refroidir sur glace pendant 30 secondes, et répétez 2x.
- Ajouter 1 ml de DNAse 1 stock à 2 mg / ml. Basculer le lysat de cellules à 4 ° C pendant 2 heures.
- Ajuster NaCl à une concentration finale de 500 mM.
- Retirer les débris cellulaires par centrifugation à 10 000 xg à 4 ° C pendant 30 min.
2. Purification avec amylose chromatographie d'affinité
- Equilibrer 1,5 ml de résine d'amylose (50% suspension) dans le tampon de lyse. Ajouter la résine d'amylose équilibrée au lysat cellulaire. Balancer doucement à 4 ° CO / N.
- Chargez le mélange lysat résine sur une colonne de chromatographie Econo-Colonne installé dans une chambre froide. Laisser les protéines non liées au passage de la colonne par gravité.
- Laver la résine amylose avec 300 ml de tampon de lavage I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF).
- Répétez le lavage avec 150 ml de tampon de lavage II (20 mM TRis-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF).
- Ajouter 5 ml de tampon d'élution (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) à la colonne, incuber à 4 ° C pendant 10 min, recueillir l'éluat et répéter pour plus de fois.
- Combinez les éluats, déterminer le rendement et la pureté de MBP-Mgm101 en chargeant une aliquote de l'éluat sur un gel SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie (Figure 4).
3. PreScission clivage de la protéase et Chromatographie d'échange de cations
- Ajouter 50 unités de protéase PreScission à l'éluat MBP-Mgm101. Effectuer le clivage à 4 ° CO / N et lui permettre de continuer pendant la dialyse contre le tampon de dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 100 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF)
- Contrôler l'efficacité de clivage sur un gel SDS-PAGE (figure 5A).
- Chargez le clivage MBP-Mgm101 par multiple injecterions sur une cartouche S Mini Macro-Prep Haute Bio-Scale connectés à un système FPLC DuoFlow biologique Bio-Rad.
- Lancer la chromatographie d'échange de cations en appliquant un gradient par étape en sel de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM et 1,000 mM de NaCl qui est créé par le mélange tampon A (NaCl 5 mM, 10 mM de phosphate de Na, pH 7,2; 1 mM PMSF) et le tampon B (1 M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH 7,2, 1 mM PMSF). Régler le taux de débit de 0,5 ml / min. Recueillir la fraction Mgm101 et contrôler la pureté de la protéine sur un gel SDS-PAGE (figure 5B).
4. Chromatographie d'exclusion stérique
- Réunir les fractions protéiques de la chromatographie d'échange de cations. Dialyser la protéine dans le tampon d'équilibrage GF (MOPS 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 5 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,2 mM PMSF).
- Concentrer la protéine avec colonne de centrifugation ultrafiltration 15R VIVASPIN de réduire le volume de ~ 1 ml par centrifugation à 3000 xg à 4 ° C.
- Chargez Mgm101 ona calibré Superose 6 prep colonne de qualité équilibrée avec le tampon de chromatographie (20 mM MOPS, pH 7,0, NaCl 150 mM, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
- Lancer l'exclusion de taille avec le tampon de chromatographie fonctionner à un débit de 0,5 ml / min.
- Recueillir les fractions des pics Mgm101 purifiés. Charger des aliquotes des fractions sur un 12% SDS-PAGE pour vérifier la qualité finale de la protéine.
- Concentré de la protéine avec VIVASPIN 6, puis congeler rapidement les échantillons dans N2 liquide et conserver à -80 ° C.
- Utilisez les Mgm101 échantillons dans les 6-12 mois pour le dosage de fixation d'ADNss (Figure 8) et pour la visualisation de structure par microscopie électronique à transmission (figure 9).
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Representative Results
Mgm101 est une protéine de recombinaison Rad52 liée dans les mitochondries. RAD52 a été largement étudié pour son rôle dans la recombinaison de l'ADN mitochondrial (Figure 1). Recombinant Mgm101 peut être préparé par une procédure en trois étapes (figure 2). Ceci est facilité par l'utilisation de la stratégie MBP-tagging qui permet Mgm101 pour être exprimé sous une forme soluble et ensuite libéré de l'étiquette par clivage protéolytique (figure 3).
Dans une préparation typique, environ 2-3 mg de fusion MBP-Mgm101 peut être récupéré à partir de 1 litre de culture bactérienne après chromatographie d'affinité amylose. Sur un gel SDS-PAGE, MBP-Mgm101 est détectée comme une bande majeure de ~ 70 kDa (figure 4). La contamination par d'autres protéines est minimale si la résine est lavée de manière appropriée avant l'élution. Après clivage par la protéase PreScission, MBP et Mgm101 sont séparés et présentés comme des bandes de 42 kDa et 28 kDa, respectivement surSDS-PAGE (figure 5A). Dans le cas de digestion incomplète, comme indiqué par la présence d'une bande ~ 70 kDa, une digestion avec une protéase étendue de PreScission supplémentaire est conseillée.
Pour la chromatographie échangeuse de cations des clivé MBP-Mgm101, MBP ne sont pas retenus par la colonne avant que l'application du sel (figure 6). Typiquement, Mgm101 est élue avec 500 mM de sel sans contamination notable par MBP (figure 5B). Un petit pic à 300 mM est parfois visible, ce qui correspond à une quantité infime de fusion MBP-Mgm101 clivée. Il est possible que Mgm101 dans cette fraction est liée par l'ADN contaminant, ce qui réduit l'affinité de liaison à la colonne. Ainsi, l'échange de cations est une étape nécessaire pour minimiser la contamination de l'ADN.
La figure 7 montre la dernière étape de Mgm101 purification par chromatographie d'exclusion stérique. Les Mgm101 oligomères s'éluent généralement dans un pic monodisperséede ~ 400 kDa. Certaines formes mutantes de Mgm101 sont souvent vus à l'augmentation des tailles comprises entre V0 (volume de vide) et la pointe 400 kDa. La raison en est encore inconnue. Mutations affectant l'oligomérisation de Mgm101 peuvent induire la formation d'agrégats qui s'éluent dans les fractions V0. Cependant, nous n'avons jamais vu pics correspondant aux Mgm101 monomères. Mgm101 monomères sont probablement instables en solution.
La purifié Mgm101 a une forte affinité de liaison à ADN simple brin (Figure 8). L'affinité de liaison pour ssDNA peut être estimée sur la base du titrage de l'ADN simple brin libre sur le gel. Le complexe Mgm101/ssDNA migre peu hors des puits. Une explication possible est que Mgm101 est chargée positivement et la liaison de plusieurs sous-unités de Mgm101 à ssDNA neutralise ses charges négatives qui rend les complexes de protéines / ADN immobile dans les conditions d'électrophorèse. Lorsqu'il est préparé de façon appropriée, Mgm101 lie ssDNA avec un Kd de ~ 200 nm.
La figure 9 montre la visualisation directe de la structure Mgm101 purifié par microscopie électronique à transmission coloration négative. Mgm101 fraîchement préparé est essentiellement présent sous forme de grandes plaques oligomères ayant un diamètre de ~ 20 nm. Au lieu de cela, les personnes âgées Mgm101 échantillons former des filaments compressés. Ces filaments sont pas formées par le simple empilement des anneaux. Il ya clairement une configuration hélicoïdale dans les filaments. Les conditions qui modulent le processus de filamentation sont actuellement sous enquête. Il est souhaitable que la qualité des protéines est vérifiée sur SDS-PAGE après l'incubation à 4 ° C pour les échantillons vieillis avant d'être analysés par microscopie électronique.
Figure 1. Du schéma simplifié montrant que Rad52 sert de médiateur pour le chargement de la recombinase Rad51 sur le site de recombinaison dans un cacanonique homologue voie de recombinaison (à gauche), et favorise simple brin recuit indépendant de Rad51 (panneau de droite).
Figure 2. Schéma général pour la préparation de Mgm101 recombinant. Mgm101 est d'abord exprimé dans E. coli dans une forme de MBP-condensé. Les cellules bactériennes sont lysées par sonication. DNAse I digestion est appliqué pour réduire la contamination de l'ADN. La fusion MBP-Mgm101 est ensuite purifié à partir du lysat de l'ADN appauvrie en utilisant une colonne d'amylose. Après clivage protéolytique, Mgm101 est libéré et séparé de MBP par chromatographie d'échange de cations. Cette étape est nécessaire pour réduire la contamination par de l'ADN. Le Mgm101 fraction éluée est ensuite purifié jusqu'à homogénéité par passage dans une colonne de Superose prep grade 6.
Figure 3. Carte physique du Mgm101 plasmide exprimant pMAL-C2E-MGM101. Le site de clivage pour la protéase PreScission entre MBP et Mgm101 est indiquée. Le clivage protéolytique rendements MBP et Mgm101 avec un poids moléculaire de 42 et 28 kDa respectivement.
La figure 4. SDS-PAGE montrant la pureté de la protéine de fusion MBP-Mgm101 après chromatographie d'affinité en amylose. La concentration en protéines est déterminée par mesure de l'absorbance à 280 nm et environ 5 pg de Mgm101 est chargée sur le gel. Le gel est coloré au bleu de Coomassie.
Figure 5. D'analyse SDS-PAGE de Mgm101. A) La libération de Mgm101 de la protéine de fusion MBP-Mgm101 après clivage avec la protease PreScission. Après digestion par la protéase O / N, une aliquote contenant environ 5 pg de protéine est chargée sur le gel. Le gel est coloré par le bleu de Coomassie. Mgm101 migre légèrement plus lente que la taille attendue de 28 kDa, en raison de la charge positive globale de la protéine sous la condition standard SDS-PAGE. B) Mgm101 après séparation de MBP par chromatographie d'échange de cations.
Figure 6. Chromatogramme montrant la séparation des Mgm101 de MBP par chromatographie d'échange de cations. Le clivé MBP-Mgm101 est injecté dans la cartouche d'un Bio-Scale Mini Macro-Prep haut à plusieurs reprises. Un gradient par étape en sel de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mm et 1000 mm de NaCl est ensuite appliqué. Cliquez ici pour voir la figure larer .
Figure 7. Chromatogramme montrant le profil d'élution de Mgm101 oligomères sur une colonne 6 de qualité calibré Superóse prep. Une chromatographie est effectuée par un taux d'écoulement de 0,5 ml / min. Le Mgm101 élue est observée comme un sommet de ~ 400 kDa. V0: volume vide. Cliquez ici pour voir la figure larer .
Figure 8. D'essai de décalage de mobilité électrophorétique montre que le Mgm101 purifiée a une activité de liaison robuste à ADN simple brin. L'1,25 x 10 -3 MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, 10% de glycérine, 1 mM DTT, 50 pg / ml de BSA et 1 mM PMSF. Après incubation à température ambiante pendant 30 min, les échantillons sont chargés sur un gel d'acrylamide natif de 6% et exécutés dans un tampon TBE 0,5 X à 4 ° C.
Figure 9. Des micrographies électroniques montrant que l'organisation structurelle des frais (panneau de gauche) et âgés (à droite) Mgm101. Microscopie électronique en transmission de coloration négative est réalisée en utilisant un JEM-2100 microscope électronique à transmission (JEOL) fonctionnant à 200 kV. Pour négative tache d'âge Mgm101, la protéine est conservé à 4 ° C dans le tampon GF (MOPS 20 mM, pH 7,0; 1NaCl 50 mM, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF) pendant 4 semaines avant d'être analysés. (Gracieuseté du Dr Stephan Wilkens).
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Discussion
Il a été un défi pour produire une protéine stable, native recombinante Mgm101 de E. coli peut-être en raison de son insolubilité dans les cellules bactériennes. Dans ce rapport, nous montrons que la stratégie MBP-fusion permet à la protéine d'être exprimée à un niveau raisonnablement élevé. En utilisant une coloration microscopie électronique à transmission négative et la chromatographie d'exclusion stérique, nous avons précédemment montré que la protéine MBP-fusion forme des oligomères uniformes in vitro 18. Il est possible que le pliage et l'oligomérisation de Mgm101 peuvent être plus lente dans les cellules bactériennes par rapport à la matrice mitochondriale. Le unoligomerized Mgm101 peut se former rapidement des agrégats qui sont toxiques in vivo. MBP-tagging peut garder Mgm101 dans une conformation soluble qui permet oligomérisation productive et réduit sa toxicité.
Un critère important pour une bonne préparation Mgm101 de la qualité est d'avoir un minimum de contamination par de l'ADN. L'A 280 / A
Nous avons précédemment montré que le stockage des Mgm101 à 4 ° C pendant quelques semaines induit la formation de filaments hélicoïdaux longs 17. Le mécanisme de formation des filaments n'est pas bien comprise. Plus-filamentation affecte la solubilité de la protéine. Par conséquent, il est fortement conseillé de portions de protéines Mgm101 fraîchement préparés sont rapidement congelés dans l'azote liquide suivie d'un stockage à -80 ° C. L'activité de liaison à l'ADN de la protéine reste inchangée après 6 à 12 mois de stockage uous ces conditions.
Ce protocole peut également être utilisé pour préparer des protéines mutantes de Mgm101. L'état d'oligomérisation et la stabilité de Mgm101 sont fréquemment touchés par les mutations. Mutations bénignes peuvent provoquer une précipitation partielle des protéines purifiées sur le clivage de MBP. Dans ces cas, l'augmentation du volume de culture à 6 litres peut permettre un rendement suffisant des protéines purifiées stables de chromatographie d'exclusion stérique. Mutations graves affectant oligomérisation peut autoriser la production des protéines dans une forme MBP fusionnée, mais la protéine peuvent ne pas être stable après le retrait de MBP.
En résumé, le protocole actuel est fiable qui permet l'expression de haut niveau des grandes Mgm101 anneaux oligomères dans E. coli. Ce protocole peut être adapté à la production de Mgm101 orthologues 20, 21 et d'autres protéines oligomériques, en particulier lorsque la solubilité de ces protéines est faible dans les cellules bactériennes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Wilkens Stephan à l'aide de la microscopie électronique à transmission. Ce travail a été financé par les Instituts de Grant Santé R01AG023731 nationale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
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