Summary
Il lievito mitocondriale proteina nucleoide, Mgm101, è una proteina di ricombinazione RAD52-tipo che forma grandi anelli oligomeriche. Un protocollo è descritto da preparare Mgm101 solubile ricombinante utilizzando la proteina legante il maltosio (MBP)-tagging strategia accoppiato con scambio cationico e cromatografia ad esclusione dimensionale.
Abstract
Il gene è stato identificato MGM101 20 anni fa per il suo ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale. Studi condotti in diversi gruppi hanno suggerito che la proteina Mgm101 è coinvolta nella riparazione ricombinazione del DNA mitocondriale. Recenti indagini hanno indicato che Mgm101 è legato alla famiglia RAD52-tipo ricombinazione proteica. Queste proteine formano grandi anelli oligomeriche e promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. Tuttavia, la caratterizzazione di Mgm101 è stata ostacolata dalla difficoltà di produrre la proteina ricombinante. Qui, una procedura affidabile per la preparazione di Mgm101 ricombinante è descritto. Il maltosio Binding Protein (MBP)-tag Mgm101 è prima espressa in Escherichia coli. La proteina di fusione è inizialmente purificato mediante cromatografia di affinità amilosio. Dopo essere stato rilasciato da clivaggio proteolitico, Mgm101 è separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Monodisperso Mgm101 è quindi ottenutoper cromatografia ad esclusione dimensionale. Una resa di ~ 0,87 mg di Mgm101 per litro di coltura batterica può essere ottenuta routine. Il Mgm101 ricombinante ha la contaminazione minima di DNA. I campioni preparati sono utilizzati con successo per biochimici, strutturali e singola particella analisi dell'immagine di Mgm101. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di altri grandi oligomeriche proteine che legano il DNA che possono essere mal ripiegate e tossici per le cellule batteriche.
Introduction
Ricombinazione omologa è importante per la riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) e interstrand legami crociati, e per la ripresa della replicazione del DNA da forche di replicazione crollate 1. Nel convenzionale ricombinazione omologa, la reazione è catalizzata centrale dalle ricombinasi ATP-dipendenti comprese RecA nei procarioti e Rad51 e Dmc1 negli eucarioti 1-3. Questi ricombinasi formano filamenti nucleoproteici sul ssDNA, che sono essenziali per l'avvio ricerca di omologia e invasione filone all'interno dei modelli di DNA duplex (Figura 1, pannello di sinistra) 4-7. Oltre alla schema convenzionale, ricombinazione omologa può avvenire anche in maniera RecA/Rad51-independent (figura 1, pannello di destra). Per esempio, il lievito e RAD52 Rad59 proteine possono catalizzare direttamente la ricottura del complementari ssDNA filamenti che sono esposti per resezione di dsDNA pause. Questo processo di ricombinazione, noto come cantareLe filone ricottura, generalmente non comporta omologa l'abbinamento con i modelli di DNA a doppia elica. Dopo la ricottura, code eterologhe vengono rimossi da esonuleasi e nick sono legatura a ripristinare genoma 8-10 di continuità. Riparazione da parte del singolo meccanismo di ricottura filo è spesso accompagnata da delezioni di sequenze genomiche tra regioni ripetute direttamente.
RAD52 appartiene ad un gruppo eterogeneo di proteine di ricombinazione che sono diffuse tra i batteriofagi 11. Queste proteine sono conosciute anche come singolo filamento Proteine ricottura (SSAPs), in base alla loro attività nel promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. I migliori SSAPs batteriofagi sono caratterizzati Redβ e Erf dal batteriofagi λ e P22, rect dal profago RAC e la proteina Sak dal Lactococcal fago ul36. Le SSAPs sono strutturalmente caratterizzate da una tipica piega β-β-β-α, sebbene somiglianza è praticamente undetectgrado nelle loro sequenze primarie. Essi ogni forma di grandi anelli omo-oligomeri di 10-14 volte simmetria in vitro 12-14. Le implicazioni funzionali di questa caratteristica organizzazione strutturale ordine superiore non è ben compreso.
Siamo interessati a capire il meccanismo di ricombinazione omologa nel genoma mitocondriale. Abbiamo precedentemente identificato il gene MGM101 che è essenziale per il mantenimento del mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 stato successivamente trovato per essere associato con nucleoidi mitocondriali ed è necessario per la tolleranza del mtDNA ad agenti che danneggiano il DNA 16. Tuttavia, lo studio di Mgm101 è stata frenata nell'ultimo decennio dalla difficoltà di produrre Mgm101 ricombinante. Abbiamo recentemente riusciti a produrre Mgm101 solubile in grandi quantità da E. coli usando la strategia di MBP-fusion. Questo ci ha permesso di dimostrare che Mgm101 azionisimilitudini biochimiche e strutturali con il RAD52-famiglia di proteine 17,18. In questo rapporto, una procedura di purificazione in tre fasi è descritta, che produce Mgm101for analisi biochimiche e strutturali omogenee (Figura 2).
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Protocol
Precedenti studi hanno dimostrato che i primi amino-terminali 22 residui di Mgm101 sono spaccati dopo l'importazione in mitocondri 19. Per l'espressione in Escherichia coli, la cornice di lettura aperta MGM101 mancano i primi 22 codoni viene amplificato mediante PCR e collocato a valle della sequenza codificante la proteina MASCHIO legante il maltosio (MBP) in una versione modificata del vettore di espressione pMAL-c2e. Questo genera la fusione MBP-Mgm101 con un linker che contiene un sito di taglio per la proteasi prescissione (Figura 3). Il plasmide viene costruito selezionando E. trasformanti coli senza l'IPTG e selezione blu / bianco Xgal. Il plasmide risultante pMAL-C2E-MGM101 viene poi introdotto nella E. coli ceppo BL21-CodonPlus (DE3)-RIL selezionando ampicillina e colonie resistenti cloramfenicolo.
1. Espressione, induzione, Cell Lysis e DNasi Trattamento io
- InocUlate trasformanti freschi in 10 ml di terreno LB (1% Bacto triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% di NaCl) addizionato con glucosio (0,2%), ampicillina (100 pg / ml) e cloramfenicolo (50 mg / ml). Incubare a 37 ° CO / N con agitazione a 200 rpm.
- Inoculare il ml precoltura 10 in 2 litri di terreno LB integrato come sopra. Crescere le cellule a 37 ° C con agitazione fino a OD 600 raggiunge 0,5.
- Indurre l'espressione della proteina di fusione MBP-Mgm101 aggiungendo isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,3 mM. Crescere le cellule in agitazione a 30 ° C per 5 ore.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione utilizzando una Beckman JA-10 rotore (5.500 xg, a 4 ° C, 10 min). Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 1 mM EDTA, pH 7,4) contenente inibitori delle proteasi (25 pM leupeptina, 1 pM pepstatina A e 1 mM PMSF).
- Sonicare sospensione cellulare in ghiaccio per 20sec utilizzando un processore ad ultrasuoni (Sistemi di calore; modello W-385) al duty cycle del 50%, lasciare raffreddare in ghiaccio per 30 secondi, e ripetere 2x.
- Aggiungere 1 ml di DNAse 1 magazzino a 2 mg / ml. Rock il lisato cellulare a 4 ° C per 2 h.
- Regolare NaCl ad una concentrazione finale di 500 mm.
- Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C per 30 min.
2. Purificazione con amilosio Affinity Chromatography
- Equilibrare 1,5 ml di resina amilosio (50% slurry) nel tampone di lisi. Aggiungere la resina amilosio equilibrata al lisato cellulare. Agitare delicatamente a 4 ° CO / N.
- Caricare il mix lisato-resina su una colonna cromatografica Econo-colonna installata in una stanza fredda. Lasciare le proteine non legate al passaggio della colonna per gravità.
- Lavare la resina con amilosio 300 ml di tampone di lavaggio I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF).
- Ripetere il lavaggio con 150 ml di tampone di lavaggio II (20 mm tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF).
- Aggiungere 5 ml di tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF, 10 mM maltosio) alla colonna, incubare a 4 ° C per 10 min, raccogliere l'eluato e ripetere per più volte.
- Combinare gli eluati, determinare la resa e la purezza di MBP-Mgm101 caricando una aliquota dell'eluato su un gel SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie (Figura 4).
3. Prescissione proteasi Decolleté e cromatografia a scambio cationico
- Aggiungere 50 unità di prescissione proteasi per l'eluato MBP-Mgm101. Eseguire la scissione a 4 ° CO / N e lasciarlo continuare durante la dialisi contro il tampone di dialisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF)
- Controllare l'efficienza della fenditura su un gel SDS-PAGE (Figura 5A).
- Caricare il spaccati MBP-Mgm101 da iniettare multiplaioni su una cartuccia Mini Macro-Prep Alta S Bio-Scale collegati ad un sistema biologico FPLC doppio passaggio Bio-Rad.
- Avviare la cromatografia a scambio cationico mediante l'applicazione di un gradiente passo sale di 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm e 1000 mm di NaCl che viene creato da tampone di miscelazione A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2; 1 mM PMSF) e tampone B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 mM PMSF). Impostare la velocità di flusso a 0,5 ml / min. Raccogliere la frazione Mgm101 e controllare la purezza della proteina su un gel SDS-PAGE (Figura 5B).
4. Size Exclusion Chromatography
- Unire le frazioni proteiche da cromatografia a scambio cationico. Dializzare la proteina in tampone di equilibrazione GF (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM di 2-mercaptoetanolo, 0,2 mM PMSF).
- Concentrare la proteina con Vivaspin 15R colonnine ultrafiltrazione a ridurre il volume a ~ 1 ml mediante filatura a 3000 xga 4 ° C.
- Caricare Mgm101 ona calibrato Superose 6 prep grade colonna equilibrata con il tampone di cromatografia (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF).
- Avviare la dimensione del buffer con esclusione cromatografia funzionare ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min.
- Raccogliere le frazioni di purificate Mgm101 picchi. Caricare aliquote delle frazioni su un 12% SDS-PAGE per il controllo della qualità finale della proteina.
- Concentrato della proteina con Vivaspin 6, poi congelare rapidamente i campioni in N2 liquido e conservare a -80 ° C.
- Utilizzare i campioni Mgm101 entro 6-12 mesi per i test ssDNA-binding (Figura 8) e per la visualizzazione strutturale di microscopia elettronica a trasmissione (Figura 9).
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Representative Results
Mgm101 è una proteina di ricombinazione RAD52-correlati nei mitocondri. RAD52 è stato ampiamente studiato per il suo ruolo nella ricombinazione del DNA mitocondriale (Figura 1). Ricombinante Mgm101 può essere preparato da una procedura in tre fasi (Figura 2). Ciò è facilitato dall'utilizzo della strategia MBP-tagging che permette Mgm101 essere espressi in una forma solubile e successivamente rilasciato dal tag da taglio proteolitico (Figura 3).
In una preparazione tipica, circa 2-3 mg di MBP-Mgm101 fusione può essere recuperata da 1 litro di coltura batterica dopo amilosio cromatografia di affinità. Su un gel SDS-PAGE, MBP-Mgm101 viene rilevato come un importante banda di ~ 70 kDa (Figura 4). Contaminazione da altre proteine è minimo se la resina è opportunamente lavata prima eluizione. Dopo la scissione da prescissione proteasi, MBP e Mgm101 sono separati e mostrati come bande di 42 kDa e 28 kDa rispettivamente suSDS-PAGE (Figura 5A). Nel caso della digestione incompleta, come indicato dalla presenza di una banda di ~ 70 kDa, si consiglia una digestione con proteasi aggiuntivo estesa prescissione.
Per la cromatografia a scambio cationico di spaccati MBP-Mgm101, MBP non è trattenuta dalla colonna prima dell'applicazione del sale (Figura 6). Tipicamente, Mgm101 viene eluito con 500 mm di sale senza contaminazioni evidenti di MBP (Figura 5B). Un piccolo picco a 300 mM è talvolta visibile, che corrisponde a una traccia quantità di uncleaved fusione MBP-Mgm101. È possibile che Mgm101 in questa frazione è vincolato da DNA contaminante, che riduce l'affinità di legame alla colonna. Così, di scambio cationico è un passo necessario per ridurre al minimo la contaminazione del DNA.
La figura 7 mostra la fase finale di Mgm101 purificazione mediante cromatografia ad esclusione sterica. Le Mgm101 oligomeri tipicamente eluiscano in un picco monodispersodi ~ 400 kDa. Alcune forme mutanti di Mgm101 sono spesso visti con maggiori dimensioni tra V0 (volume vuoto) e il picco di 400 kDa. La ragione di questo è ancora sconosciuta. Mutazioni che interessano l'oligomerizzazione di Mgm101 possono indurre la formazione di aggregati che eluiscono nelle frazioni V0. Tuttavia, non abbiamo mai visto picchi corrispondenti ai Mgm101 monomeriche. Mgm101 monomeri sono suscettibili instabili in soluzione.
La purificato Mgm101 ha un'alta affinità di legame per ssDNA (Figura 8). L'affinità di legame per ssDNA può essere stimata sulla base della titolazione del ssDNA libera sul gel. Il complesso Mgm101/ssDNA migra mal fuori dei pozzetti. Una possibile spiegazione è che Mgm101 è caricato positivamente e il legame di più subunità di Mgm101 a ssDNA neutralizza le cariche negative che rende le proteine / DNA immobile alle condizioni di elettroforesi. Quando adeguatamente preparato, Mgm101 lega ssDNA con una Kd di ~ 200 nm.
Figura 9 mostra la visualizzazione strutturale diretta della Mgm101 purificata dalla macchia microscopia elettronica a trasmissione negativo. Mgm101 preparati al momento è presente principalmente come grandi anelli oligomeriche con un diametro di ~ 20 nm. Invece, i campioni invecchiati Mgm101 formano filamenti compressi. Questi filamenti non sono formate dalla semplice sovrapposizione degli anelli. Esiste chiaramente un andamento elicoidale nei filamenti. Le condizioni che modulano il processo filamentazione sono attualmente sotto inchiesta. È consigliabile che la qualità delle proteine viene controllata su SDS-PAGE dopo l'incubazione a 4 ° C per i campioni invecchiati prima di essere analizzate mediante microscopia elettronica.
Figura 1. Schema semplificato che mostra che RAD52 funge da mediatore per il caricamento della Rad51 ricombinasi sul sito di ricombinazione in un cacanonica ricombinazione omologa pathway (pannello di sinistra), e promuove singolo filo ricottura indipendente Rad51 (pannello destro).
Figura 2. Schema generale per la preparazione di Mgm101 ricombinante. Mgm101 è prima espresso in E. coli in una forma MBP-fusa. Cellule batteriche vengono lisate mediante sonicazione. DNAsi I digestione viene applicata per ridurre la contaminazione del DNA. La fusione MBP-Mgm101 viene poi purificato dal lisato DNA-depleto utilizzando una colonna di amilosio. Dopo clivaggio proteolitico, Mgm101 viene rilasciato e separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Questo passo è necessario per ridurre ulteriormente la contaminazione da DNA. La frazione eluita Mgm101 viene poi purificato all'omogeneità mediante passaggio su una colonna di grado 6 Superose prep.
Figura 3. Mappa fisica della Mgm101 esprimono plasmide pMAL-C2E-MGM101. Il sito di taglio per la proteasi prescissione tra MBP e Mgm101 è indicato. Il clivaggio proteolitico rendimenti MBP e Mgm101 con un peso molecolare di 42 e 28 kDa rispettivamente.
Figura 4. SDS-PAGE mostra la purezza della proteina di fusione MBP-Mgm101 dopo amilosio cromatografia di affinità. La concentrazione proteica è determinata misurando l'assorbanza a 280 nm e circa 5 mg di Mgm101 è caricato sul gel. Il gel viene colorato con Coomassie blu.
Figura 5. Analisi SDS-PAGE di Mgm101. A) Il rilascio di Mgm101 dalla proteina di fusione MBP-Mgm101 dopo la scissione con la proteasi prescissione. Dopo digestione con la proteasi O / N, una parte aliquota contenente circa 5 pg di proteina è caricato sul gel. Il gel viene colorato con Coomassie blue. Mgm101 migra leggermente più lento rispetto alla dimensione prevista di 28 kDa, dovuta alla carica positiva complessiva della proteina condizione SDS-PAGE standard. B) Mgm101 dopo separazione da MBP mediante cromatografia di scambio cationico.
Figura 6. Cromatogramma mostra la divisione dei Mgm101 da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Il spaccati MBP-Mgm101 viene iniettato in un Bio-Scale Mini Macro-Prep Alta S cartuccia più volte. Un gradiente passo sale di 5 mm, 300 mm, 500 mm, 7Viene poi applicato 50 mm e 1000 mm di NaCl. Clicca qui per visualizzare la figura LARER .
Figura 7. Cromatogramma mostra il profilo di eluizione Mgm101 oligomeri su una colonna Superose 6 prep grade calibrato. Cromatografia viene effettuata ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min. Il Mgm101 eluito viene osservato come un picco di ~ 400 kDa. V0: volume vuoto. Clicca qui per visualizzare la figura LARER .
Figura 8. Elettroforetico mobility shift assay mostrando che il purificato Mgm101 ha una robusta attività di legame al ssDNA. Il 1,25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% glicerolo, 1 mM DTT, 50 ug / ml di BSA, e 1 mM PMSF. Dopo incubazione a RT per 30 minuti, i campioni vengono caricati su un gel di acrilammide nativo 6% ed eseguiti in tampone TBE 0.5X a 4 ° C.
Figura 9. Microscopio elettronico mostrano che l'organizzazione strutturale del fresco (pannello di sinistra) e di età (pannello di destra) Mgm101. Trasmissione colorazione negativa microscopia elettronica viene eseguita utilizzando un JEM-2100 microscopio elettronico a trasmissione (JEOL) operante a 200 kV. Per negativo macchia di età Mgm101, la proteina viene conservato a 4 ° C in tampone GF (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF) per 4 settimane prima di essere analizzato. (Per gentile concessione del Dr. Stephan Wilkens).
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Discussion
E 'stata una sfida per la produzione di una stalla, nativo Mgm101 proteina ricombinante da E. coli forse a causa della sua insolubilità in cellule batteriche. In questo rapporto, si dimostra che la strategia di MBP-fusione permette la proteina da esprimere ad un livello ragionevolmente elevato. Mediante microscopia elettronica a colorazione negativa e cromatografia ad esclusione dimensionale, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina di fusione MBP-forma oligomeri uniformi in vitro 18. E 'possibile che la piegatura e di oligomerizzazione Mgm101 possono essere più lenti nelle cellule batteriche rispetto alla matrice mitocondriale. Il unoligomerized Mgm101 può formare rapidamente aggregati che sono tossici in vivo. MBP-tagging può tenere Mgm101 in una conformazione solubile che permette oligomerizzazione produttivo e diminuisce la sua tossicità.
Un criterio importante per la buona qualità della preparazione Mgm101 è quello di avere la contaminazione minima di DNA. L'A 280 / A
Abbiamo precedentemente dimostrato che lo stoccaggio di Mgm101 a 4 ° C per alcune settimane induce la formazione di lunghi filamenti elicoidali 17. Il meccanismo di formazione di filamenti non è ben compreso. Over-filamentazione influenza la solubilità della proteina. Pertanto, si raccomanda vivamente che aliquote di appena preparato Mgm101 proteine sono rapidamente congelati in azoto liquido seguita da stoccaggio a -80 ° C. Il DNA attività di legame della proteina rimane invariata dopo 6-12 mesi di stoccaggio under queste condizioni.
Questo protocollo può anche essere utilizzato per preparare proteine mutanti di Mgm101. Lo stato di oligomerizzazione e la stabilità del Mgm101 sono frequentemente interessati dalle mutazioni. Mutazioni lievi possono causare una precipitazione parziale delle proteine purificate sulla scissione da MBP. In questi casi, aumentando il volume di coltura a 6 litri può consentire resa sufficiente delle proteine purificate stabile proveniente cromatografia ad esclusione dimensionale. Mutazioni gravi colpiscono oligomerizzazione possono consentire la produzione delle proteine in una forma MBP-fusa, ma la proteina possono non essere stabili dopo la rimozione di MBP.
In sintesi, l'attuale protocollo è affidabile, che permette l'espressione ad alto livello delle grandi Mgm101 anelli oligomeriche in E. coli. Questo protocollo può essere adattato alla produzione di Mgm101 ortologhi 20, 21 e altre proteine oligomeriche, soprattutto quando la solubilità di tali proteine è bassa nelle cellule batteriche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Stephan Wilkens aiuto in microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01AG023731.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
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