Summary
प्राथमिक सेल संस्कृति विशेष रूप से विशिष्ट विकास के चरणों में ट्रांसजेनिक माउस भ्रूण से, कोशिकाओं के विशिष्ट आबादी का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इस के साथ साथ, भ्रूण निलय विच्छेदित और अलग, और एंटीबॉडी संयुग्मित मोतियों को समझते हैं और आगे के विश्लेषण के लिए endothelial कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं.
Abstract
सेल संस्कृति बहुत असंख्य संस्कृति परिस्थितियों में कोशिकाओं के व्यक्तिगत आबादी का आकलन करने के लिए हमारी क्षमता में इजाफा किया है. अमर सेल लाइनों के उपयोग के अपने आसानी के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं, वहीं इन सेल लाइनों सभी संभावित प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं. विशेष रूप से एक ट्रांसजेनिक माउस से ब्याज की एक विशेष क्षेत्र से प्राथमिक कोशिकाओं, अलग से, अधिक सूक्ष्म अध्ययन किया जा सकता है. बुनियादी तकनीक अंग या ब्याज की आंशिक अंग (हृदय या दिल के किसी विशिष्ट क्षेत्र जैसे) विदारक और एकल कक्षों के लिए अंग अलग कर शामिल है. इन कोशिकाओं को फिर ब्याज की सेल प्रकार स्वीकार करता है कि एक एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ incubated हैं. ब्याज की कोशिकाओं को फिर मोती से कोशिकाओं को अलग कर एक छोटी trypsin ऊष्मायन के साथ, एक चुंबक के इस्तेमाल से अलग किया जा सकता है. ये अलग कक्षों तो सुसंस्कृत और वांछित के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है. इस तकनीक को मूल रूप से वयस्क माउस अंग के लिए डिजाइन किया गया थाहै, लेकिन आसानी से इस के साथ साथ प्रदर्शन के रूप में, भ्रूण अंगों के साथ प्रयोग के लिए नीचे पहुंचा जा सकता है. हमारे हित विकासशील कोरोनरी vasculature में है, इसलिए हम विशिष्ट भ्रूण चरणों के दौरान कोशिकाओं की इस आबादी का अध्ययन करना चाहता था. इस प्रकार, मूल प्रोटोकॉल भ्रूण निलय के छोटे आकार और इन विकास के चरणों में endothelial कोशिकाओं का कम संभावित उपज के साथ संगत होना करने के लिए संशोधित किया जा सकता था. इस स्केल नीचे दृष्टिकोण का उपयोग, हम ट्रांसजेनिक भ्रूण निलय endothelial कोशिकाओं में कोरोनरी जाल remodeling के आकलन किया है.
Introduction
अमर सेल लाइनों के आगमन के बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान 1 क्रांति ला दी है. वर्तमान में उपलब्ध सेल लाइनों के अंगों की एक विस्तृत श्रृंखला से ली गई है और सभी प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं धरना कर रहे हैं. हालांकि, स्थापित सेल लाइनों कुछ सीमाएं हैं. स्थायीकरण की प्रक्रिया स्पष्ट रूप से विशेष रूप से जीवन काल और प्रसार के लिए सम्मान के साथ, कोशिकाओं के व्यवहार को बदलता है, लेकिन यह भी इस तरह के 2 cytoskeletal प्रोटीन के रूप में अप्रत्याशित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं. कई अलग अलग सेल लाइनों उपलब्ध हैं, हालांकि इसके अलावा, एक पूरे जीव के भीतर एक भी कोशिका प्रकार के बीच महत्वपूर्ण विविधता है. विशेष शो के विविध कार्यों में Endothelial कोशिकाओं धमनियों या नसों और प्रवाह किस तरह के पोत 3 में मौजूद है वे लाइन पर आधारित. एक विकास के नजरिए से इससे भी अधिक अहम है, तथापि, (देखें, जैसे टी उपलब्ध सेल लाइनों के विशाल बहुमत वयस्क ऊतकों से निकाली गई हैATCC के माध्यम से उपलब्ध है वह संग्रह). ये वयस्क कोशिका लाइनों संभावना उनके भ्रूण व्यापारियों की गतिशील प्रकृति पुनरावृत्ति नहीं है. विकास के दौरान मनाया तेजी से बदलते spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति पैटर्न भी एक दिए गए विकास के चरण में एक अंग से एक endothelial सेल एक अलग विकास के चरण में है कि एक ही अंग से एक endothelial सेल के रूप में एक ही तरह से व्यवहार नहीं कर सकता है.
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमर सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में, प्राथमिक कोशिकाओं के हित के विशिष्ट ऊतकों से अलग किया जा सकता है. इस तकनीक के फायदे के अलावा, इन प्राथमिक कोशिकाओं को भी एक विशिष्ट अंग या किसी विशिष्ट विकास के चरण में एक अंग के हिस्से से अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, इन प्राथमिक कोशिकाओं के जीन पीटा और ऐसे अभिकर्मक दक्षता के रूप में अन्य समस्याओं से बचने जबकि तोड़े में इन विट्रो अध्ययन में, की अनुमति उपलब्ध ट्रांसजेनिक जानवरों की विभिन्न प्रकार से अलग किया जा सकता है. आश्चर्य नहीं कि कईतकनीक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं 4,5 अलग करने के लिए कैसे ब्यौरा प्रकाशित किया गया है. सामान्य में, इन तकनीकों कोशिकाओं, टैगिंग ब्याज की विशेष सेल प्रकार, अलग कर और आगे के विश्लेषण के लिए उन कोशिकाओं को अलग करने, ब्याज के क्षेत्र का संग्रह शामिल है.
कोरोनरी endothelial कोशिकाओं का एक प्रारंभिक भ्रूण जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए, हम एक छोटे अंग के साथ प्रयोग के लिए एक पहले से प्रकाशित तकनीक 4 नीचे पहुंचा. इस स्केल नीचे प्रक्रिया के साथ, हम विशिष्ट भ्रूण चरणों में भ्रूण दिल से कोरोनरी endothelial कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं. इन कोशिकाओं को फिर इस तरह के प्रवास विश्लेषण के रूप में पारंपरिक एन्दोथेलिअल assays है, में इस्तेमाल किया जा सकता है. जल्दी भ्रूण कोशिका लाइनों अधिक प्रचलित हो जाते हैं, जब तक प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम कर रहे एक अमूल्य तकनीक है.
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Protocol
1. एंटीबॉडी संयुग्मित मोती तैयार
- विच्छेदन के लिए पहले एक दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार उचित Dynabeads (चूहे में उठाया गया एक एंटीबॉडी के लिए जैसे चूहा आईजीजी Dynabeads, 4 एक्स 10 8 मोती / एमएल) के साथ चुनाव के एंटीबॉडी गठबंधन. बी.डी. चूहा विरोधी CD31 एंटीबॉडी (0.5 माइक्रोग्राम / μl, endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल) के लिए, 3 μl एंटीबॉडी एक अंतिम 1.5 माइक्रोग्राम विरोधी CD31 एंटीबॉडी की एकाग्रता और 1/10 x 7 मोती के लिए, हर 25 μl मोती के लिए जोड़ा जाता है 25 μl बफर.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर माला और रातोंरात एंटीबॉडी सेते
2. कोलेजन प्लेट तैयारी
- महज एक कोलेजन लेपित थाली करने के लिए विरोध के रूप में एक कोलेजन जेल पर हो गई जब पृथक कोशिकाओं को और अधिक जल्दी से नलिकाओं के रूप में. 6 में वर्णित के रूप में इसलिए, कोलेजन जैल, विच्छेदन रात से पहले किया जाता है. एक टिशू कल्चर हुड में बर्फ पर, निम्न अभिकर्मकों (पर्याप्त 19 कुओं के लिए) गठबंधन: 206.4 μl बाँझ एच <उप> 2 हे, 140.4 μl कोलेजन प्रकार मैं (4.08 मिलीग्राम / एमएल), 38.4 μl 10x M199, और 1.15 μl 5 एम NaOH.
- एक 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के कुओं में यह कोलेजन जेल की पिपेट 20 μl. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 80 μl DMEM जोड़ें और 37 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस संस्कृति के माध्यम से निकालें और दो बार दोहराएँ.
- अंतिम कुल्ला के बाद, अच्छी तरह से एफबीएस / DMEM के प्रत्येक के लिए 80 μl 10% जोड़ने के लिए और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस अलग कक्षों जोड़ने से पहले संस्कृति के माध्यम से निकालें.
3. उत्पाद शुल्क और हार्ट डाइजेस्ट
- एक अनुमोदित इच्छामृत्यु तकनीक का उपयोग कर वांछित भ्रूण दिन में एक समय पर गर्भवती माउस euthanize. सभी प्रयोगों के चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
- एक लापरवाह स्थिति में माउस के साथ, उदारतापूर्वक पहले से 70% इथेनॉल के साथ महिला के उदर पक्ष स्प्रेविच्छेदन. आंतरिक अंगों से दूर कम पेट की त्वचा और मांसपेशियों को उठाने के लिए संदंश का प्रयोग, आंतरिक अंगों की कल्पना करने के लिए महिला के पेट के निचले भाग गुहा खुला कटौती.
- संदंश के साथ गर्भाशय ग्रीवा होल्डिंग, ध्यान से संदंश के लिए दुम कटौती और उदर गुहा से गर्भाशय सींग उठाने लगते हैं. गर्भाशय सींग उठाने, वहीं जगह में सींग रखती है कि किसी भी संयोजी ऊतक दूर कटौती. गर्भाशय सींग excising खत्म करने के लिए, गर्भाशय सींग मुक्त करने डिंबवाहिनी साथ गर्भाशय सींग के जंक्शन कटौती.
- ठंड 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और जरूरत के रूप में कुल्ला युक्त एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग रखें. संलग्न भ्रूण थैलियों का पर्दाफाश करने के midline के माध्यम से गर्भाशय सींग खोलने कट.
- भ्रूण काटने गलती से बचने के लिए और एक भ्रूण को पुनः प्राप्त करने के नाल के जंक्शन पर एक भ्रूण थैली और भ्रूण खुले में कटौती. ठंड पीबीएस के साथ एक दूसरे पेट्री डिश में भ्रूण रखें. बर्फ को गर्भाशय सींग के साथ पेट्री डिश लौटें.
- डीछाती दीवार के लिए उपयोग में सुधार करने के लिए भ्रूण ecapitate. जीनोटाइपिंग आवश्यक है, तो इसे हटा दें और बर्फ पर रखा एक Eppendorf ट्यूब में बचाने के लिए पूंछ काट दिया.
- अपनी पीठ पर भ्रूण के साथ, हृदय और फेफड़ों कल्पना करने के लिए छाती दीवार खुले में कटौती. फिर, धीरे जिस तरह की छाती दीवार खींचने के लिए और बाहर, दिल काटने से बचने के लिए, पसलियों के नीचे के पार एक क्षैतिज कटौती के बाद forelimb के पास रिब पिंजरे के पक्ष के साथ एक ऊर्ध्वाधर कटौती, बनाते हैं. ऊपर लगभग भ्रूण दिन 13.5 के माध्यम से, छाती दीवार के दृश्य में सहायता, पारदर्शी है.
- ध्यान से संदंश का उपयोग दिल उठा और नीचे वाहिकाओं में कटौती. फिर, दिल मुक्त करने के लिए महान वाहिकाओं ऊपर कटौती. फेफड़े वाहिकाओं में कटौती नहीं कर रहे हैं, फेफड़ों दिल से हटाया जा सकता है. यदि आवश्यक हो तो इस प्रकार, फेफड़ों की तरह, बाहरी ऊतकों को हटा दें.
- अलग और निलय से अटरिया और महान वाहिकाओं त्यागें. कैंची का प्रयोग, छोटे टुकड़ों (लगभग 1 मिमी 3 <में निलय कीमा/> समर्थन) और लगभग 500 μl collagenase (बाँझ पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल) में जगह. सभी निलय कीमा और collagenase में रखा गया है जब तक बर्फ पर नमूने रखें.
- निलय एक अलग Eppendorf ट्यूब में हर दिल इकट्ठा करने, सभी भ्रूण से हटा दिया गया है जब तक पिछले चरण दोहराएँ. सभी भ्रूण ही जीनोटाइप है, तो दिल एक ही Eppendorf ट्यूब में जमा किया जा सकता है. एक ही समय में संसाधित नमूनों की संख्या अलगाव के लिए इस्तेमाल किया चुंबक के आधार पर सीमित किया जा सकता है, DynaMag (123-21D) 16 Eppendorf ट्यूबों की अधिकतम धारण यहां इस्तेमाल किया.
- 45 मिनट के लिए कमाल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कीमा निलय रखें. हर 15 मिनट, धीरे नमूने निकालने और यंत्रवत् कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और.
4. Endothelial कोशिकाओं को अलग
- कोशिकाओं के शेष झुरमुटों दूर फिल्टर एक 70 माइक्रोन के माध्यम से निलय-collagenase समाधान गुजरती हैं.
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. छोड़नातैरनेवाला, DMEM में लगभग 200 μl 10% FBS के साथ की जगह है, और कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और.
- एक बार पिछले चरण दोहराएँ. दूसरा 10% FBS / DMEM धोने के बाद 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. 50 μl 10% FBS / DMEM में कोशिकाओं Resuspend.
- अंतिम centrifugation कदम दौरान मोती तैयार करते हैं.
- 1 मिनट के लिए एक चुंबक पर एंटीबॉडी और मोती युक्त Eppendorf ट्यूब रखें.
- चुंबक पर जगह में ट्यूब के साथ, सतह पर तैरनेवाला हटायें. चुंबक से ट्यूब निकालें और लगभग 100 μl 10% FBS / DMEM जोड़ें.
- 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब रखें. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 10% FBS / DMEM के साथ फिर से धो लो. 3 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
- अंतिम धोने के बाद, 10% FBS / DMEM में एंटीबॉडी संयुग्मित मोती (नमूना प्रति 5 μl) resuspend.
- प्रत्येक सेल नमूना करने के लिए, एंटीबॉडी संयुग्मित मोती के 5 μl जोड़ें. कमाल के लिए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर मनका कक्ष निलंबन रखेंआर 30 मिनट.
- एक लामिना का प्रवाह हुड में, 1 मिनट के लिए चुंबक पर कोशिकाओं और एंटीबॉडी संयुग्मित मोती युक्त Eppendorf ट्यूबों जगह है. सतह पर तैरनेवाला निकालें, चुंबक से ट्यूब को हटाने, और लगभग 100 μl 10% FBS / DMEM के साथ धोना. 5 washes के लिए दोहराएँ.
- पिछले धोने के बाद, 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों की जगह तैरनेवाला हटाने, और चुंबक से ट्यूबों को हटा दें. लगभग 100 μl DMEM जोड़ें.
- 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब, जगह तैरनेवाला हटाने, और चुंबक से ट्यूबों को हटा दें. 100-200 जोड़ें μl 0.25% trypsin-EDTA के prewarmed. 37 नमूनों में सेते डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2.
- 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों रखें. ताजा Eppendorf ट्यूबों को सेल युक्त सतह पर तैरनेवाला ध्यान से हस्तांतरण. 400 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें. उम्मीद की उपज पर निर्भर करता है, या 384 अच्छी तरह से इलाज संस्कृति पकवान - 80-100 μl मध्यम विकास और थाली एक 96 में में कोशिकाओं Resuspend(E14.5-E16.5 भ्रूण की निलय से लगभग 450-600 कोशिकाओं). Endothelial कोशिकाओं के लिए, (नीचे वर्णित) endothelial वृद्धि संस्कृति के माध्यम का उपयोग करें.
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Representative Results
CD31 स्वीकार करता है कि एक endothelial विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना, endothelial कोशिकाओं भ्रूण (ई) 13.5 (चित्रा 1 ए) और 18.5 (आंकड़े 1 बी -1 डी) भ्रूण के निलय से अलग थे. एक अनुपचारित संस्कृति पकवान पर हो, जब इन कोशिकाओं गोल रहते हैं और निकट मिला हुआ (चित्रा 1 ए) यदि एक cobblestone पैटर्न के रूप में होगा. पतला कोलेजन भी कुओं कोट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और endothelial कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) का पालन करना होगा, जबकि वे कम से कम जंजीरों फार्म जब एक कोलेजन जेल पर चढ़ाया (आंकड़े 1 सी और 1 डी). Endothelial कोशिकाओं कोलेजन में लिपटे के साथ तुलना में कोलेजन जेल पर हो जब अच्छी तरह से एक कोलेजन जेल (आंकड़े 1 सी और 1 डी) फार्म सेल सेल बातचीत और कोलेजन पर हो जब शाखा करने के लिए शुरू कि फार्म चेन, और इस प्रक्रिया युक्त तेजी से होता है एक में उगाई थाली. ये एन्दोथेलिअल चेन endothelial मार्कर आईएसओ लेक्टिन साथ सकारात्मक लेबल ( E18.5 निलय से अलग Endothelial कोशिकाओं PECAM (2A चित्रा) और Flk1 (चित्रा 2 बी) के साथ सकारात्मक लेबल. इसके अलावा, पृथक endothelial कोशिकाओं endothelial विशेष फ्लोरोसेंट डाई Syto-16 का उपयोग लेबल किया जा सकता है रहते हैं. चित्रा 2 डी एक E14.5 भ्रूण की निलय से अलग और Syto-16 के साथ लेबल रहे थे कि endothelial कोशिकाओं से पता चलता है. 
चित्रा 1. एक कोलेजन जेल पर हो जब भ्रूण माउस निलय से अलग Endothelial कोशिकाओं चेन के रूप में. एक E13.5 दिल जी से जीना अलग निलय endothelial कोशिकाओं की (ए) Brightfield 10x छविएक अनुपचारित संस्कृति पकवान पर rown, यहां तक कि 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं गोल रहते हैं (बी) एक E18.5 दिल से निश्चित पृथक निलय endothelial कोशिकाओं की Brightfield 10x छवि एक कोलेजन लेपित पकवान पर हो;. 24 घंटे के बाद, कुछ कोशिकाओं को शुरू कर दिया है (तीर) elongating, लेकिन उनमें से ज्यादातर. (नोक) गोल रहते हैं (सी, डी) brightfield (सी) में दिखाया गया है एक कोलेजन जेल पर हो एक E18.5 दिल से निश्चित पृथक निलय endothelial कोशिकाओं के confocal छवियों और आईएसओ के साथ लेबल -लेक्टिन (लाल). तीर लेक्टिन पॉजिटिव कोशिकाओं के कुछ संकेत मिलता है. सीडी = 50 माइक्रोन में स्केल सलाखों. 
चित्रा 2. भ्रूण माउस निलय से अलग Endothelial कोशिकाओं endothelial मार्करों के लिए सकारात्मक लेबल. पर हो एक E18.5 दिल से निश्चित पृथक निलय endothelial कोशिकाओं की (एसी) Confocal छवियों (40x)एक कोलेजन लेपित पकवान. इन कोशिकाओं को PECAM (ए) और FLK -1 (बी) के लिए सकारात्मक लेबल, नकारात्मक नियंत्रण (सी) कोई प्रतिदीप्ति पता चलता है. एसी में, नाभिक DAPI (नीला) के साथ लेबल रहे हैं. (डी) एक E14.5 दिल से जीने पृथक निलय endothelial कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट ओवरले (10x) एक कोलेजन जेल पर हो. कोशिकाओं रहते endothelial मार्कर Syto -16 (हरा) के साथ incubated रहे थे, और प्रवास के समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया गया.
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Discussion
प्राथमिक भ्रूण कोशिकाओं के साथ कार्य करना उपन्यास प्रयोगों के विकास के लिए इन विट्रो महत्वपूर्ण कदम में पता करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, अलगाव प्रक्रिया तुच्छ नहीं है. कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के अलग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं को अच्छी तरह से वे अच्छी तरह से धोने के चरणों के दौरान निलंबित कर दिया है कि तब collagenase पाचन पर अलग हो रहे हैं और यह सुनिश्चित करना कि शामिल हैं. Pipetting द्वारा यांत्रिक विच्छेदन बहुत collagenase चरण के दौरान कोशिकाओं को अलग करने में मदद करता है, और फ़िल्टरिंग कदम कोशिकाओं के clumps को हटा. ये कदम आबादी शुद्धता में सुधार और उपज.
चढ़ाना घनत्व भी एक छोटा सा अंग से कोशिकाओं को अलग जब एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय है. ट्यूब गठन endothelial सेल घनत्व 7 पर निर्भर है, क्योंकि हम अपने चढ़ाना घनत्व बढ़ाने के लिए 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर भरोसा किया. यहां तक कि इस विचार के साथ, हम एक कम सेल घनत्व (डायर और पैटरसन, समर्थक में समायोजित करने के लिए कुछ विश्लेषण संशोधित करना पड़ा है) कांग्रेस. सेल संख्या एक चिंता का विषय है इस प्रकार, यदि एक छोटे आकार की संस्कृति को अच्छी तरह से समस्या कम हो सकती है.
प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने की एक और सीमा एंटीबॉडी की विशिष्टता है. ऐसे CD31 के रूप में भी एक मान्यता प्राप्त एन्दोथेलिअल विशेष प्रोटीन कभी कभी fibroblasts 8 द्वारा व्यक्त की है. काटा सेल नंबर के बजाय छँटाई एफ ए सी के लिए अनुमति देता है, तो endothelial कोशिकाओं और fibroblasts प्रतिदीप्ति तीव्रता से अलग किया जा सकता है. हालांकि, भ्रूण endothelial कोशिकाओं के हाल के एक एफ ए सी छँटाई विश्लेषण इस तकनीक, शक्तिशाली, हालांकि छोटे अंगों 9 के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, सुझाव है कि चार पूरे E10.5 भ्रूण mRNA के निकासी के लिए पर्याप्त endothelial कोशिकाओं का उत्पादन करने की आवश्यकता है.
एफ ए सी छँटाई संभव नहीं है, इस प्रकार, यदि अन्य तकनीकों आबादी शुद्धता में सुधार लाने के लिए नियोजित किया जा सकता है. कोशिकाओं सकारात्मक नकारात्मक एसईएल तो एक एंटीबॉडी द्वारा चुना जाता है और जो कर रहे हैं में एक दो कदम चयन प्रक्रिया,एक दूसरे के एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने के लिए विफलता से ected, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है. तंतुप्रसू विशिष्ट मार्कर FSP-1 एक विशेष उम्मीदवार 10 होगा. वैकल्पिक रूप से, संस्कृति मध्यम एल valine बिना आदेश दिया जा सकता है, और डी वेलिन बजाय जोड़ा जा सकता है, fibroblasts के डी वेलिन का उपयोग करने में असमर्थ हैं और इस प्रकार 11,12 जीवित नहीं है.
इन सीमाओं और चिंताओं के बावजूद, प्राथमिक भ्रूण सेल आबादी का अध्ययन कर विकास की प्रक्रिया की इन विट्रो विश्लेषण में एक विस्तृत के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक से भ्रूण के किसी अंग या क्षेत्र के लिए आवेदन किया है और एक सेल प्रकार विभिन्न भ्रूण चरणों की तुलना करने की अनुमति देता हो सकता है. उचित स्केलिंग के साथ, प्राथमिक कोशिकाओं के भी बहुत छोटी आबादी प्राप्त की और विश्लेषण किया जा सकता है. ये विश्लेषण कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट व्यवहार करते हैं और समय के साथ बदल कैसे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम महत्वपूर्ण पांडुलिपि के पढ़ने, समय चूक इमेजिंग के साथ सहायता के लिए यूएनसी के माइक्रोस्कोप सेवा प्रयोगशाला, और वित्तीय सहायता के लिए एनआईएच (अनुदान # R01HL061656) के लिए एंड्रिया Portbury धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
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