Summary
Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.
Abstract
Cultura de células tem melhorado muito a nossa capacidade de avaliar populações individuais de células sob condições de cultura inumeráveis. Enquanto as linhas de células imortalizadas oferecem vantagens significativas para a sua facilidade de utilização, estas linhagens de células não estão disponíveis para todos os tipos de células potenciais. Ao isolar as células primárias a partir de uma região específica de interesse, particularmente a partir de um ratinho transgénico, os estudos mais matizadas podem ser executadas. A técnica básica envolve a dissecção do órgão ou órgãos parcial de interesse (por exemplo, do coração ou de uma região específica do coração) e dissociação do órgão para células individuais. Estas células são então incubadas com contas magnéticas conjugadas com um anticorpo que reconhece o tipo celular de interesse. As células de interesse pode então ser isolado, com a utilização de um íman, com uma curta incubação de tripsina dissociar as células dos grânulos. Estas células isoladas podem ser cultivadas e, em seguida, analisado como desejado. Esta técnica foi originalmente concebido para órgão do rato adultos, mas podem ser facilmente reduzidos para uso com os órgãos embrionários, como aqui demonstrado. Porque o nosso interesse é na vasculatura coronária em desenvolvimento, que queria estudar esta população de células em fases embrionárias específicas. Assim, o protocolo original teve de ser modificado para ser compatível com a pequena dimensão dos ventrículos embrionárias e o baixo rendimento potencial das células endoteliais para estas fases de desenvolvimento. Utilizando essa abordagem em escala reduzida, avaliamos coronária remodelação plexo nas células endoteliais ventriculares embrionárias transgênicos.
Introduction
O advento das linhas de células imortalizadas revolucionou a biologia das células de base 1. As linhas de células actualmente disponíveis são derivados de uma vasta gama de órgãos e abrangem todos os principais tipos de células. No entanto, as linhas celulares estabelecidas têm algumas limitações. O processo de imortalizao, obviamente, alterar o comportamento das células, especialmente no que diz respeito ao tempo de vida e a proliferação, mas também pode afectar a expressão de proteínas inesperadas, tais como as proteínas do citoesqueleto 2. Além disso, apesar de muitas linhas celulares diferentes estão disponíveis, existe uma diversidade significativa mesmo entre um único tipo de células dentro de um organismo inteiro. As células endoteliais em particular mostra diversos comportamentos com base em se elas linha de artérias ou veias e que tipo de fluxo está presente no recipiente 3. Ainda mais premente de uma perspectiva do desenvolvimento, no entanto, é que a maioria das linhas celulares disponíveis são derivados de tecidos de adulto (veja, por exemplo, tele coleção disponível via ATCC). Estas linhas de células adultas provavelmente não recapitular a natureza dinâmica dos seus precursores embrionários. As rápidas mudanças espaciotemporais padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento, também observadas sugerem que uma célula endotelial de um órgão num determinado estágio de desenvolvimento pode não se comportam da mesma maneira como uma célula endotelial, a partir desse mesmo órgão, numa fase de desenvolvimento diferente.
Como uma alternativa ao uso comercialmente disponíveis linhas celulares imortalizadas, as células primárias podem ser isoladas a partir do tecido de interesse específica. Entre as vantagens desta técnica, essas células primárias podem ser isolados a partir de um órgão específico ou mesmo parte de um órgão, em qualquer fase de desenvolvimento específico. Além disso, essas células primárias podem ser isolados a partir da grande variedade de animais transgénicos disponíveis, permitindo o estudo in vitro do gene knockout e knock-in, evitando outros problemas, tais como a eficiência da transfecção. Não surpreendentemente, muitostécnicas têm sido publicados detalhando como isolar tipos específicos de células a 4,5. Em geral, estas técnicas envolvem a recolha na região de interesse, a dissociação das células, de etiquetagem do tipo de célula específico de interesse, e isolando as células para análise posterior.
Para estudar uma população embrionária das células endoteliais coronárias, que foi reduzida a 4 técnica previamente publicada para o uso com um órgão menor. Com este procedimento, em escala reduzida, pode-se isolar as células endoteliais coronárias do coração embrionário em estágios embrionários específicos. Estas células podem depois ser utilizados em ensaios endoteliais tradicionais, tais como análises de migração. Até linhagens de células embrionárias precoces tornam-se mais prevalente, trabalhando com as pilhas é uma técnica inestimável.
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Protocol
1. Preparar anticorpos conjugados grânulos
- Um dia antes da dissecação, combinar o anticorpo de escolha com as Dynabeads apropriadas (por exemplo IgG de rato Dynabeads para um anticorpo criado em ratos, 4 x 10 8 contas / ml), segundo as instruções do fabricante. Para o rato anti-CD31 anticorpo BD (0,5 mg / mL, utilizados para isolar as células endoteliais), 3 ul de anticorpo é adicionado a cada 25 ul de pérolas, para uma concentração final de 1,5 ug de anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7 esferas / 25 ul de tampão.
- Incube os grânulos e de anticorpos durante a noite a 4 ° C.
2. Preparando o colágeno Placa
- Células isoladas formam túbulos mais rapidamente quando cultivadas num gel de colagénio, por oposição à mera uma placa revestida de colagénio. Assim, os géis de colagénio são feitas a noite antes do esvaziamento, tal como descrito no ponto 6. No gelo em uma capa de cultura de tecidos, combinar os seguintes reagentes (suficiente para 19 poços): 206,4 mL estéril H <sub> 2 O, 140,4 ul de colagénio tipo I (4,08 mg / mL), 38,4 mL de 10x M199, e 1,15 mL de NaOH 5 M.
- Pipetar 20 ul desta gel de colagénio nas cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 384 poços. Colocar a placa a 37 ° C incubadora de cultura de tecido durante 30 min.
- Adicionar 80 ul de DMEM a cada poço e incubar durante 15 min a 37 ° C. Remover o meio de cultura e repete duas vezes mais.
- Após a lavagem final, adicionar 80 ul de 10% FBS / DMEM a cada poço e incubar durante a noite a 37 ° C. Remover o meio de cultura antes da adição das células isoladas.
3. Impostos e digerir o Coração
- Sacrificá um rato timed-grávida no dia embrionário desejado usando uma técnica de eutanásia aprovado. Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
- Com o mouse em decúbito dorsal, liberalmente pulverizar o lado ventral da fêmea com etanol 70% antesdissecação. Usando fórceps para levantar a pele e músculo abdominal inferior para cima dos órgãos internos, o corte aberto da cavidade abdominal inferior da fêmea para visualização dos órgãos internos.
- Segurar o colo do útero com uma pinça, cuidadosamente cortadas caudal para a pinça e comece a levantar o corno uterino a partir da cavidade abdominal. Ao levantar o corno uterino, cortar qualquer tipo de tecido conjuntivo que segura o chifre no local. Para terminar a excisão do corno uterino, corte a junção do corno uterino com o oviduto para libertar o corno uterino.
- Coloque a trompa uterina de uma placa de Petri contendo a frio 1x salina tamponada com fosfato (PBS) e lavagem conforme necessário. Cortar abrir o corno uterino através da linha média para expor os sacos embrionários em anexo.
- Corte de abrir um saco embrionário na junção da placenta e do embrião para evitar que acidentalmente cortar o embrião e recuperar um embrião. Coloque o embrião de uma segunda placa de Petri com o frio PBS. Retorne a placa de Petri com o corno uterino em gelo.
- Decapitate o embrião para melhorar o acesso à parede torácica. Se a genotipagem é necessário, cortar a cauda para removê-lo e guardar num tubo Eppendorf colocada em gelo.
- Com o embrião em suas costas, cortou a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões. Para evitar o corte do coração, fazer um corte vertical ao longo do lado da caixa torácica, perto de um membro anterior, seguido por um corte horizontal ao longo da parte inferior das costelas e, então, puxe parede do peito para cima e para fora do caminho. Através aproximadamente dia embrionário 13,5, a parede torácica é transparente, auxiliando na visualização.
- Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. Em seguida, corte acima dos grandes vasos para libertar o coração. Se os vasos pulmonares não são cortados, os pulmões podem ser removidos com o coração. Deste modo, remover os tecidos estranhos, como os pulmões, caso seja necessário.
- Separar e descartar os vasos átrios e grandes dos ventrículos. Utilizando uma tesoura, tritura os ventrículos em pedaços pequenos (aproximadamente 1 mm 3 </ Sup>) e colocar em cerca de 500 ul de colagenase (1 mg / ml em PBS estéril). Manter as amostras em gelo até que todos os ventrículos foram picados e colocado em colagenase.
- Repita os passos anteriores até que os ventrículos foram excisadas a partir de todos os embriões, recolhendo cada coração em um tubo Eppendorf em separado. Se todos os embriões têm o mesmo genótipo, corações podem ser agrupados num único tubo de Eppendorf. O número de amostras processadas de uma só vez pode ser limitado com base no íman utilizado para o isolamento, a DynaMag (123-21D) aqui utilizado tem um máximo de 16 tubos de Eppendorf.
- Colocar os ventrículos picados, a 37 ° C com balanço durante 45 min. A cada 15 minutos, retire cuidadosamente as amostras e pipeta cima e para baixo para dissociar mecanicamente as células.
4. Isolar as células endoteliais
- Passar a solução de colagenase-ventrículo através de um filtro de 70 um para remover aglomerados de células restantes.
- Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min. Descartaro sobrenadante, substitua-o por cerca de 200 mL de 10% FBS em DMEM e pipeta cima e para baixo para dissociar as células.
- Repita o passo anterior uma vez. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 minutos após o segundo 10% de FBS / DMEM lavagem. Ressuspender as células em 50 ul de 10% de FBS / DMEM.
- Durante o passo final de centrifugação, preparar os grânulos.
- Colocar o tubo de Eppendorf contendo o anticorpo e os grânulos em um íman durante 1 min.
- Com o tubo no lugar sobre o íman, remover o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e adicionar cerca de 100 mL de 10% FBS / DMEM.
- Coloque o tubo sobre o ímã para 1 min. Remover o sobrenadante e lavar novamente com 10% de FBS / DMEM. Repetir para um total de 3 lavagens.
- Após a lavagem final, voltar a suspender as pérolas de anticorpos conjugados em 10% de FBS / DMEM (5 mL por amostra).
- Para cada amostra de células, adicionam-se 5 ul dos grânulos de anticorpos conjugados. Coloque as suspensões de células do grânulo a 4 ° C com agitação for 30 min.
- Em uma câmara de fluxo laminar, colocar os tubos de Eppendorf contendo células e pérolas de anticorpos conjugados do íman por 1 min. Remover o sobrenadante, remover os tubos do ímã, e lavar com aproximadamente 100 mL de 10% FBS / DMEM. Repita por 5 lavagens.
- Após a última lavagem, colocar os tubos do íman por 1 min, remover o sobrenadante, e remover os tubos do íman. Adicionar cerca de 100 ul de DMEM.
- Colocar os tubos no íman durante 1 min, remover o sobrenadante, e remover os tubos do íman. Adicionar 100-200 ul de pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar as amostras a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 5 min.
- Colocar os tubos no íman durante 2 min. Transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo as células para tubos de Eppendorf fresco. Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g.
- Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 80-100 ul de meio de crescimento e em uma placa de 96 -, ou 384 poços prato de cultura tratados, dependendo do rendimento esperado(Cerca de 450-600 células dos ventrículos de E14.5, E16.5 embriões). Para células endoteliais, utilize meio de cultura de crescimento endotelial (definido abaixo).
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Representative Results
Usando um anticorpo específico para o endotélio, que reconhece CD31, as células endoteliais foram isolados a partir dos ventrículos embrionárias (E), 13,5 (Figura 1A) e 18.5 (Figuras 1B-1D) embriões. Quando cultivado em um prato de cultura não tratada, essas células permanecem arredondado e que formam um padrão de paralelepípedos se perto confluente (Figura 1A). Diluir colagénio também foi utilizado para revestir os poços, e as células endoteliais, enquanto vai aderir ao mesmo (figura 1B), que formam cadeias de menos do que quando semeadas em um gel de colagénio (Figuras 1C e 1D). As células endoteliais cultivadas em um poço contendo um gel de colagénio (Figuras 1C e 1D), as interacções célula-célula e as cadeias formam forma que começam a ramificar quando cultivada em colagénio, e este processo ocorre mais rapidamente quando cultivada em gel de colagénio em comparação com o colagénio revestido prato. Estas cadeias endoteliais rotular positivamente com o marcador endotelial iso-lectina ( As células endoteliais isoladas de E18.5 ventrículos rotular positivamente com PECAM (Figura 2A) e Flk1 (Figura 2B). Além disso, as células endoteliais viver isolado pode ser marcado com o corante fluorescente específico endotelial Syto-16. Figura 2D mostra células endoteliais que foram isoladas a partir dos ventrículos de um embrião E14.5 e marcadas com Syto-16. 
Figura 1. As células endoteliais isoladas de ventrículos embrionárias de camundongos formar cadeias, quando cultivada em um gel de colágeno. (A) imagem 10x Brightfield de células endoteliais ventriculares isoladas ao vivo de um E13.5 coração grown em um prato de cultura não tratada, mesmo depois de 48 horas, as células permanecem arredondados (B) Brightfield imagem 10x de células endoteliais ventriculares isoladas fixos de um E18.5 coração crescido em um prato de colágeno revestido;. após 24 horas, algumas células começaram alongando (seta), mas a maioria deles permanecem arredondada (ponta de seta). (C, D) de imagens confocais de células endoteliais ventriculares isolados a partir de uma fixa E18.5 coração cultivadas num gel de colagénio, mostrado em campo claro (C), e marcadas com iso -lectina (vermelho). As setas indicam que algumas das células de lectina-positivos. Barras de escala em CD = 50 mm. 
Figura 2. As células endoteliais isoladas de ventrículos embrionárias de camundongos rotular de forma positiva para os marcadores endoteliais. (AC) imagens confocal (40x) das células endoteliais ventriculares isoladas fixos de um E18.5 coração crescido emum prato revestido com colagénio. Estas células rotular positivamente para PECAM (A), e Flk-1 (B), o controlo negativo (C) não apresenta qualquer fluorescência. Em CA, os núcleos são rotulados com DAPI (azul) (D). Fluorescente sobreposição (10x) de células endoteliais ventriculares isolados vivo de um E14.5 coração cultivadas num gel de colagénio. As células foram incubadas com o marcador endotelial vivo Syto-16 (verde), e a migração foi observada usando microscopia de lapso de tempo.
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Discussion
Trabalhando com células embrionárias primárias permite novas experiências para abordar em passos críticos do desenvolvimento in vitro. No entanto, o procedimento de isolamento não é trivial. Passos críticos para o isolamento de qualquer tipo de células, nomeadamente, assegurar que as células são bem separados por digestão com colagenase e depois que eles são bem suspensa durante os passos de lavagem. Dissecção mecânica por pipetagem contribui grandemente separar as células durante a etapa de colagenase, e a etapa de filtragem remove aglomerados de células. Estes passos de melhorar a pureza e rendimento da população.
A densidade de plaqueamento é também uma preocupação significativa quando se isola a partir de células de um pequeno órgão. Porque a formação de tubo endotelial é dependente da densidade de células 7, que se baseou em placas de cultura de tecidos de 384 poços para aumentar a densidade de revestimento. Mesmo com esta consideração, tivemos que modificar algumas análises para acomodar uma densidade de células inferior (Dyer e Patterson, em proGress). Assim, se o número de células é uma preocupação, uma cultura de tamanho menor também pode diminuir o problema.
Outra limitação do isolamento de células primárias é a especificidade do anticorpo. Mesmo uma proteína específica de endotelial reconhecido como CD31 é algumas vezes expressa pelos fibroblastos 8. Se o número de células colhidas permite a classificação em vez FAC, em seguida, as células endoteliais e fibroblastos poderiam ser separadas por a intensidade de fluorescência. No entanto, uma análise recente de células endoteliais embrionárias triagem FAC necessária quatro embriões E10.5 inteiras para produzir células endoteliais suficiente para extracção de ARNm, sugerindo que esta técnica, embora poderoso, pode não ser adequado para os órgãos menores 9.
Assim, se FAC triagem não é viável, outras técnicas podem ser empregues para melhorar a pureza da população. Um processo de selecção em duas etapas, no qual as células são seleccionadas positivamente por um anticorpo e, em seguida, negativamente selected por falha ao ligar a um segundo anticorpo, é uma abordagem alternativa. O marcador específico de fibroblastos FSP-1 seria um particular candidato 10. Em alternativa, o meio de cultura pode ser encomendado sem L-valina, D-valina e pode ser adicionado, em vez; fibroblastos são incapazes de utilizar D-valina, e, portanto, não sobrevivem 11,12.
Apesar destas limitações e preocupações, estudando populações de células embrionárias primárias permite uma análise in vitro detalhada dos processos de desenvolvimento. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer órgão ou região do embrião e permite que um tipo de célula a ser comparadas entre os diferentes estágios embrionários. Com o dimensionamento apropriado, mesmo muito pequenas populações de células primárias podem ser obtidas e analisadas. Estas análises irá fornecer uma visão significativa em como subconjuntos específicos de células se comportam e mudar ao longo do tempo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andrea Portbury para a leitura crítica do manuscrito, o Laboratório de Serviço Microscópio de UNC para a assistência com a imagem time-lapse, eo NIH (Grant # R01HL061656) para apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
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