Summary
Primär cellkultur är en användbar teknik för att analysera specifika populationer av celler, särskilt från transgena musembryon vid specifika utvecklingsstadier. Häri är embryonala ventriklar dissekeras och dissocierade, och antikroppar konjugerade pärlor igen och skilja ut de endotelceller för vidare analys.
Abstract
Cellkultur har förbättrats avsevärt vår förmåga att bedöma enskilda populationer av celler under otaliga odlingsbetingelser. Medan odödliga cellinjer erbjuder betydande fördelar för sin användarvänlighet, dessa cellinjer är tillgängliga för alla potentiella celltyper. Genom att isolera primära celler från en viss region av intresse, särskilt från en transgen mus, kan mer nyanserade studier göras. Den grundläggande tekniken innebär att dissekera organ eller partiell organ av intresse (t.ex. hjärta eller en specifik region av hjärtat) och dissociation orgeln till enstaka celler. Dessa celler inkuberas sedan med magnetiska kulor konjugerade till en antikropp som känner igen celltypen av intresse. Cellerna av intresse kan sedan isoleras med användning av en magnet, med en kort trypsin inkubation dissociera cellerna från pärlorna. Dessa isolerade cellerna kan sedan odlas och analyseras som önskas. Denna teknik var ursprungligen avsedd för en vuxen mus orgels men kan enkelt skalas ner för användning med embryonala organ, såsom visas häri. Eftersom vårt intresse ligger i att utveckla kranskärlen, ville vi studera denna population av celler under specifika embryonala stadier. Således hade det ursprungliga protokollet ändras för att vara förenlig med den lilla storleken av de embryonala ventriklar och den låga potentiella avkastningen av endotelceller vid dessa utvecklingsstadier. Utnyttja denna förminskad synsätt, har vi bedömt koronar plexus ombyggnad i transgena embryonala ventricular endotelceller.
Introduction
Tillkomsten av odödliga cellinjer har revolutionerat grundläggande cellbiologi 1. De för närvarande tillgängliga cellinjer är härledda från en rad olika organ och omfattar alla de stora celltyper. Men etablerade cellinjer har vissa begränsningar. Processen för immortalisering förändras givetvis beteendet hos de celler, specifikt med avseende på livslängd och proliferation, men kan också påverka uttrycket av oväntade proteiner, såsom cytoskelettproteiner 2. Dessutom, även om många olika cellinjer finns tillgängliga, det finns en betydande mångfald bland ens en enda celltyp inom en hel organism. Endotelceller i särskilt visa olika beteenden baserat på om de rada artärer eller vener och vilken typ av flöde finns i kärlet 3. Ännu mer pressning ur ett utvecklingsperspektiv är emellertid att de allra flesta av de tillgängliga cellinjer är härledda från vuxen vävnad (se t.ex. tHan samlingen tillgänglig via ATCC). Dessa vuxna cellinjer sannolikt inte rekapitulera inte den dynamiska karaktären hos deras embryonala prekursorer. De snabbt växlande Spatiotemporal genuttryck mönster som framträtt under utvecklingen tyder också på att en endotelcell från ett organ vid en given utvecklingsstadium kanske inte beter sig på samma sätt som en endotelcell från samma organ på en annan utvecklingsstadiet.
Som ett alternativ till användning av kommersiellt tillgängliga odödliggjorda cellinjer, kan primära celler isoleras från den specifika vävnaden av intresse. Bland fördelarna med denna teknik, kan dessa primära celler isoleras från ett specifikt organ eller en del av ett organ vid vilken specifik utvecklingsstadiet. Vidare kan dessa primära celler isoleras från det stora utbudet av tillgängliga transgena djur, vilket gör att in vitro-studie av genknockout och knock-in samtidigt som man undviker andra problem såsom transfektionseffektivitet. Inte överraskande, mångatekniker har publicerats beskriver hur man isolera specifika celltyper 4,5. I allmänhet innebär dessa tekniker samla regionen av intresse, dissociera cellerna, tagga den specifika celltyp av intresse, och isolera dessa celler för vidare analys.
För att studera en tidig embryonal population av koronära endotelceller, skalas vi ner en tidigare publicerad teknik 4 för användning tillsammans med ett mindre organ. Med denna förminskad förfarande, kan vi isolera de koronara endotelceller från embryonala hjärtat vid specifika embryonala stadier. Dessa celler kan sedan användas i traditionella endothelial analyser, såsom migration analyser. Tills tidiga embryonala cellinjer blivit vanligare, som arbetar med de primära celler är en ovärderlig teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Förbered Antikropp-konjugerade Pärlor
- En dag före dissektion, kombinera antikroppen val med lämpliga Dynabeads (t.ex. rått-IgG Dynabeads för en antikropp hos råtta, 4 x 10 8 pärlor / ml) per tillverkarens anvisningar. För BD rått-anti-CD31-antikropp (0,5 | ig / | il, användes för att isolera endotelceller), är 3 | il antikropp tillsattes för varje 25 | il pärlor, för en slutlig koncentration av 1,5 | ig anti-CD31-antikropp och en x 10 7 pärlor / 25 | il buffert.
- Inkubera pärlor och antikroppar över natten vid 4 ° C.
2. Förbereda Kollagen Plate
- Isolerade celler bildar tubuli snabbare när den odlas på en kollagengel i motsats till bara en kollagen-belagd platta. Därför kollagengeler gjorde natten innan dissekering, som beskrivs i 6. På isen i en vävnadsodling huva, kombinera följande reagenser (tillräckligt för 19 brunnar): 206,4 l steril H <sub> 2 O, 140,4 pl kollagen typ (4,08 mg / ml) I, 38,4 l 10x M199, och 1,15 ^ il 5 M NaOH.
- Pipettera 20 pl av denna kollagengel i brunnar i en 384-brunnars vävnadsodlingsplatta. Placera plattan i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 30 min.
- Tillsätt 80 | il DMEM till varje brunn och inkubera under 15 min vid 37 ° C. Avlägsna odlingsmediet och upprepa ytterligare två gånger.
- Efter den slutliga sköljningen, tillsätt 80 | il 10% FBS / DMEM till varje brunn och inkubera över natten vid 37 ° C. Avlägsna odlingsmediet före tillsats de isolerade cellerna.
Tre. Punktskatter och smälta hjärtan
- Euthanize en tidsanpassad gravid musen på önskad embryonala dag med godkänd dödshjälp teknik. Alla experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of North Carolina at Chapel Hill.
- Med musen i ryggläge, frikostigt spraya den ventrala sidan av den kvinnliga med 70% etanol föredissekering. Använd pincett för att lyfta den nedre buken hud och muskler från de inre organen, skära upp kvinnans nedre bukhålan för att visualisera inre organ.
- Håll livmoderhalsen med pincett, försiktigt skära caudal till tången och börja lyfta livmoderhornet från bukhålan. Samtidigt lyfter livmoderhornet, skära bort all bindväv som håller hornet på plats. För att avsluta excising livmoderhornet, skär korsningen av livmoderhornet med äggledaren att frigöra livmoderhornet.
- Placera livmoderhornet i en petriskål med kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skölj efter behov. Skär öppna livmoderhornet via mittlinjen för att exponera de bifogade embryonala säckar.
- Skär upp ett embryo sac vid korsningen av moderkakan och embryot att undvika misstag skära embryot och hämta ett embryo. Placera embryot i en andra petriskål med kall PBS. Returnera petriskål med livmoderhornet till is.
- Decapitate embryot att förbättra tillgången till bröstkorgen. Om genotypning är nödvändigt, klippa svansen för att ta bort den och spara i ett Eppendorf-rör placeras på is.
- Med embryot på rygg, klipp upp bröstkorgen att visualisera hjärtat och lungorna. För att undvika att skära i hjärtat, gör ett vertikalt snitt längs sidan av bröstkorgen, nära en forelimb, följt av en horisontell snitt över botten av revbenen, sedan försiktigt dra bröstkorgen upp och ur vägen. Upp till cirka embryonala dag 13,5, är bröstkorgen transparent, medhjälp i visualisering.
- Lyft försiktigt hjärtat med pincett och skär fartygen nedan. Sedan skär över de stora fartygen att befria hjärtat. Om lungkärlen inte skärs, kan lungorna avlägsnas med hjärtat. Således, ta bort främmande vävnader, som lungorna, om det behövs.
- Separera och kasta förmaken och stora fartyg från kamrarna. Med sax, finhacka ventriklarna i små bitar (ca 1 mm 3 </ Sup>) och plats i ca 500 pl kollagenas (1 mg / ml i sterilt PBS). Håll proverna på is tills alla kamrarna har malts och placeras i kollagenas.
- Upprepa föregående steg tills kamrarna har skurits ut från alla embryon, samlar varje hjärta i en separat Eppendorf-rör. Om alla embryon har samma genotyp, får hjärtan slås samman i en enda Eppendorf-rör. Antalet prover som behandlas vid ett enskilt tillfälle kan begränsas baserat på magneten som används för isolering, den DynaMag (123-21D) som används här innehar högst 16 Eppendorf-rör.
- Placera finhackade ventriklarna vid 37 ° C med gungande under 45 min. Varje 15 minuter, ta försiktigt bort proverna och pipettera upp och ned för att mekaniskt separera cellerna.
4. Isolera de endotelceller
- Passera ventrikelefterliknande kollagenaslösning genom en 70 um filter för att ta bort kvarvarande klumpar av celler.
- Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min. Kasserasupernatanten, ersätt med cirka 200 ^ il 10% FBS i DMEM, och pipettera upp och ner för att dissociera cellerna.
- Upprepa det föregående steget gång. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min efter den andra 10% FBS / DMEM tvätt. Resuspendera cellerna i 50 | il 10% FBS / DMEM.
- Under den sista centrifugeringen steget, förbereda pärlorna.
- Placera Eppendorf-rör innehållande antikroppen och pärlorna på en magnet i 1 min.
- Med röret på plats på magneten, avlägsna supernatanten. Ta bort röret från magneten och tillsätt ca 100 l 10% FBS / DMEM.
- Placera röret på magneten i 1 min. Avlägsna supernatanten och tvätta igen med 10% FBS / DMEM. Upprepa för totalt tre tvättar.
- Efter den slutliga tvätten, återsuspendera antikropp-konjugerade pärlor i 10% FBS / DMEM (5 | il per prov).
- Till varje cell prov, tillsätt 5 mikroliter av antikroppar konjugerade pärlor. Placera pärla-cellsuspensionema vid 4 ° C med gungande for 30 min.
- I en huv med laminärt flöde, placera Eppendorf-rör innehållande celler och antikropp-konjugerade pärlor på magneten i 1 min. Avlägsna supernatanten, ta bort rören från magneten, och tvätta med ca 100 l 10% FBS / DMEM. Upprepa för 5 tvättar.
- Efter den sista tvättningen, placera rören på magneten under 1 min, avlägsna supernatanten, och ta ut rören från magneten. Tillsätt cirka 100 pl DMEM.
- Placera rören på magneten för 1 minut, avlägsna supernatanten och ta bort rören från magneten. Lägg 100-200 pl förvärmd 0,25% trypsin-EDTA. Inkubera proverna vid 37 ° C och 5% CO2 under 5 min.
- Placera rören på magneten i 2 min. Försiktigt överföra cell-innehållande supernatanten till rent Eppendorf-rör. Centrifugera i 5 minuter vid 400 x g..
- Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellerna i 80-100 l odlingsmedium och plattan i en 96 - eller 384-väl behandlad kultur maträtt, beroende på den förväntade avkastningen(Cirka 450-600 celler från kamrarna E14.5-E16.5 embryon). För endotelceller, använd endotelial mediet tillväxtkultur (definieras nedan).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda en endotel-specifik antikropp som känner igen CD31, var endotelceller isolerade från ventriklar embryonala (E) 13.5 (figur 1A) och 18,5 (figur 1B-1D) embryon. När odlas på en obehandlad kultur maträtt, förblir dessa celler rundade och skulle bilda en kullersten mönster om nära sammanflytande (Figur 1A). Späd kollagen också har använts för att belägga brunnarna, och medan endotelcellema kommer att följa det (Figur 1B), bildar de färre kedjor än när ströks ut på en kollagengel (figurerna 1C och 1D). Endotelceller odlas i en brunn innehållande en kollagengel (figurerna 1C och 1D) bildar cell-cell-interaktioner och kedjor bildar som börjar att förgrena när den odlas på kollagen, och denna process sker snabbare när den odlas på kollagengelen jämfört med kollagen-belagda platta. Dessa endotelceller kedjor märka positivt med den endothelial markören iso-lektin ( Endotelceller som isolerats från E18.5 ventriklarna märka positivt med PECAM (figur 2A) och Flk1 (Figur 2B). Vidare lever isolerade endotelceller kan märkas med användning av endotel-specifik fluorescerande färg Syto-16. Figur 2D visar endotelceller som isolerades från ventriklarna i en E14.5 embryo och märktes med Syto-16. 
Figur 1. Endotelceller isolerade från embryonala mus ventriklar bildar kedjor när den odlas på en kollagen gel. (A) Brightfield 10x bild av levande isolerade ventrikulära endotelceller från en E13.5 hjärta grown på en obehandlad kultur skålen, även efter 48 timmar, celler förblir rundad (B) Brightfield 10x bild av fasta isolerade ventrikulära endotelceller från en E18.5 hjärta odlas på en kollagen-belagd skålen,. efter 24 timmar, har vissa celler börjat förlängning (pil), men de flesta av dem fortfarande rundade (pilspets). (C, D) Confocal bilder av fasta isolerade ventrikulära endotelceller från en E18.5 hjärta odlas på en kollagen gel, som visas i ljusfält (C) och märkt med iso -lektin (röd). Pilar anger några av de lektin-positiva celler. Skala barer i CD = 50 pm. 
Figur 2. Endotelceller isolerade från embryonala mus ventriklar märka positivt för endothelial markörer. (AC) Confocal bilder (40x) av fasta isolerade ventrikulära endotelceller från en E18.5 hjärta odlas påen kollagen-belagd skålen. Dessa celler märka positivt för PECAM (A) och Flk-1 (B), den negativa kontrollen (C) visar ingen fluorescens. I AC, är kärnorna märks med DAPI (blå). (D) Fluorescerande overlay (10x) av levande isolerade ventrikulära endotelceller från en E14.5 hjärta odlas på en kollagengel. Cellerna inkuberades med levande endothelial markören Syto-16 (grön), och migration observerades med time-lapse mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbeta med primära embryonala celler gör nya försök att lösa in vitro kritiska steg i utvecklingen. Dock är isoleringsförfarandet inte trivialt. Kritiska steg för att isolera någon typ av celler inkluderar att säkerställa att cellerna är väl separerade vid kollagenasdigerering och sedan att de är väl suspenderade under tvätten steg. Mekanisk dissektion genom pipettering hjälper mycket separera cellerna under kollagenas steget, och filtreringssteget avlägsnar klumpar av celler. Dessa steg förbättra befolkningens renhet och utbyte.
Pläteringen densitet är också en betydande oro när isolera celler från en liten orgel. Eftersom endotelial rör-bildning är beroende av celldensiteten 7 förlitade vi oss på 384-brunnars vävnadsodlingsplattor att öka vår plätering densitet. Även med beaktande av detta har vi tvungna att ändra vissa analyser för att rymma en mindre cell densitet (Dyer och Patterson, i progress). Således, om cellantal är ett problem, en mindre storlek odlingsbrunn kan minska problemet.
En annan begränsning av isolering primära celler är specificiteten hos antikroppen. Även en erkänd endotel-specifikt protein, såsom CD31 uttrycks ibland av fibroblaster 8. Om den skördade cellantalet möjliggör FAC sortering i stället, då de endotelceller och fibroblaster kunde separeras med fluorescensintensiteten. Dock krävs en ny FAC sortering analys av embryonala endotelceller fyra hela E10.5 embryon för att producera tillräckligt med endotelceller för mRNA extraktion, vilket tyder på att denna teknik, men kraftfull, inte kan vara lämpliga för mindre organ 9.
Således, om FAC sorteringen inte är möjligt, kan andra tekniker användas för att förbättra befolkning renhet. Ett tvåstegsförfarande urvalsprocess, i vilket cellerna är positivt utvalda av en antikropp och sedan negativt SELected av underlåtenhet att binda till en andra antikropp, är ett alternativt tillvägagångssätt. Den fibroblastliknande specifik markör FSP-1 skulle vara en viss kandidat 10. Alternativt kan odlingsmediet beställas utan L-valin, och D-valin kan tillsättas istället; fibroblaster är oförmögna att utnyttja D-valin och således inte överlever 11,12.
Trots dessa begränsningar och problem, studera primära embryonala cellpopulationer möjliggör en detaljerad in vitro analys av utvecklingsprocesser. Denna teknik kan tillämpas på alla organ eller region av embryot och tillåter en celltyp, som skall jämföras över olika embryonala stadier. Med lämplig skalning, kan även mycket små populationer av primära celler erhållas och analyseras. Dessa analyser kommer att ge betydande insikt i hur specifika undergrupper av celler beter sig och förändras över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Andrea Portbury för kritisk läsning av manuskriptet, mikroskopet service Laboratoriet för UNC för hjälp med time-lapse avbildning, och NIH (bidrag # R01HL061656) för finansieringsstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
