Summary
Noi descriviamo un metodo per creare un modello affidabile di ipertensione venosa cerebrale nel topo adulto. Questo modello è stato ampiamente descritto ed testati nel ratto. Questo nuovo omologo nei topi apre la possibilità di utilizzare animali geneticamente modificate e amplia così le applicazioni del modello.
Abstract
La comprensione della fisiopatologia del cervello malformazioni artero-venose e fistole arterovenose è migliorata grazie a modelli animali. Un modello di ratto creare una fistola artificiale tra l'arteria carotide comune (CCA) e la vena giugulare esterna (EJV) è stato ampiamente descritto ed dimostrato tecnicamente fattibile. Questo costrutto provoca una consistente ipertensione venosa cerebrale (CVH), e quindi ha contribuito a studiare il contributo di ipertensione venosa alla formazione, i sintomi clinici, e la prognosi di MAV cerebrali e FAV durale. Modelli di topi equivalenti sono stati solo poco descritti e hanno mostrato problemi con stenosi della fistola. Un modello murino stabilito permetterebbe lo studio non solo fisiopatologia, ma anche potenziali terapie genetiche per queste malattie cerebrovascolari.
Presentiamo un modello di fistola artero che produce una ipertensione venosa intracranica durevole nel topo. Microsurgical anastomosi of murino CCA e EJV possono essere difficili a causa di anatomia diminutivo e spesso provocare una fistola non-brevetto. In questo protocollo step-by-step affrontiamo tutte le importanti sfide incontrate durante questa procedura. Evitare eccessiva retrazione della vena durante l'esposizione, utilizzando 11-0 suture invece di 10-0, e facendo un attentamente pianificato anastomosi end-to-side sono alcuni dei passaggi critici. Anche se questo metodo richiede abilità microchirurgia avanzata ed una curva di apprendimento più che l'equivalente nel ratto, può essere sviluppato in modo coerente.
Questo modello romanzo è stato progettato per integrare le tecniche di topi transgenici con un sistema sperimentale già ben consolidata che si è dimostrato utile per studiare MAV cerebrali e FAV durale. Aprendo la possibilità di utilizzare topi transgenici, un più ampio spettro di modelli validi può essere raggiunta e trattamenti genetici può essere testato. Il costrutto sperimentale potrebbe anche essere ulteriormente adattata allo studio di otle sue malattie cerebrovascolari legati con ipertensione venosa, come l'emicrania, amnesia globale transitoria, transitoria cecità monoculare, etc.
Introduction
I modelli animali di ipertensione venosa cerebrale hanno dimostrato di essere uno strumento fondamentale per la comprensione della fisiopatologia del cervello malformazioni artero-venose e fistole arterovenose 1-7. Il più diffuso è il modello di ratto creata attraverso una fistola artificiale tra l'arteria carotide comune (CCA) e la vena giugulare esterna (EJV), che provoca una ipertensione venosa cerebrale coerente (CVH) nel ratto 1,8-10. Modelli di topi equivalenti, aprendo la possibilità di utilizzare diversi ceppi di topi transgenici, consentirebbe ulteriori studi sulla fisiopatologia non solo, ma anche potenziali terapie genetiche per queste malattie cerebrovascolari. Inoltre, il costrutto sperimentale potrebbe anche essere ulteriormente adattata allo studio di altre malattie cerebrovascolari sono collegati con ipertensione venosa come emicrania, amnesia globale transitoria, cecità monoculare transitoria, ecc 11 Tuttavia, i tentativi precedenti per costruire tali modelli topi have dimostrato le difficoltà con pervietà della fistola grazie all'anatomia diminutivo 5,12. Qui, descriviamo nostro protocollo passo-passo per una anastomosi successo della murino CCA e EJV che si traduce in una fistola brevetto a lungo termine e una ipertensione venosa durevole nel topo.
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Protocol
1. Preparare il mouse
- Indurre l'anestesia generale nel topo con gas isoflurano. Iniettare 0,15 ml di brupenorphine intraperitoneale per la gestione del dolore. Prima di procedere, verificare che il livello di anestesia è soddisfacente pungendo zampe del topo.
- Ponga il mouse in decubito dorsale con i quattro arti fissati dal nastro adesivo. Rimuovere il pelo del collo e la parte superiore del torace con le forbici. Via iniezione sottocutanea, somministrare 0,2-0,4 ml di soluzione salina allo 0,9% per mantenere il mouse idratato durante la procedura chirurgica.
- Preparare il campo operatorio seguendo un metodo rigoroso sterili. L'area della incisione cutanea deve essere pulito con il 90% di alcol.
2. dissezione della carotide comune e la Vena giugulare esterna
- Fare un linea mediana incisione orizzontale cervicale in tutta l'area del collo inferiore del mouse. Dopo approfondire la ferita, elevare le ghiandole salivari e dei tessuti molli del collo dell'utero utilizzando araction sutura (Figura 1). Esporre la giusta vena giugulare esterna (EJV) lateralmente al muscolo sternocleidomastoideo (SCM). Questa operazione deve essere eseguita al microscopio, poiché trazione eccessiva sopra la vena potrebbe danneggiarlo e indurre il trombosi.
- Sezionare con cura il EJV destra lungo il suo corso dalla clavicola alla base del cranio. Di solito pinze bipolari elettrici, coagulano e si dividono i rami di preparare una lunghezza adeguata per il successivo posizionamento di clip temporanea e anastomosi.
- Laterale alla trachea e mediale alla SCM, esplorare l'arteria carotide comune (CCA). Si deve essere attentamente esposta dalla clavicola a poco oltre la sua biforcazione nelle arterie carotidi interne ed esterne. Durante questa fase, l'attenzione deve essere nuovamente somministrato per evitare un'eccessiva trazione sul EJV che potrebbe successivamente compromettere la pervietà dell'anastomosi.
3. Preparare l'anastomosi
- Legare il CCA con 10-0 Nylon solo prossimale alla sua biforcazione. Successivamente, applicare una clip temporaneo del prossimale CCA più vicino alla clavicola possibile.
- Una volta che il flusso è stato interrotto, transetto l'arteria appena sotto la legatura biforcazione ed irrigare con soluzione fisiologica per lavare il sangue residuo all'interno del lume. Evitare di coagulazione bipolare in questa fase, in quanto danno termico alla parete dell'arteria potrebbe mettere il futuro anastomosi in pericolo.
- Al fine di migliorare la visibilità dei bordi della EJV, la parete mediale è contrassegnato con un pennarello blu lungo il corso del venotomia prevista. Una volta che il EJV è contrassegnata, utilizzare un 10-0 sutura per legare l'estremità distale come caudale possibile e applicare una clip vascolare temporanea sull'estremità prossimale craniale possibile.
- Con un bel 30 ago G e 0,5 ml siringa, effettuare un'apertura iniziale tramite marcata zona della EJV e immediatamente irrigare il lume con soluzione fisiologica per evitare la formazione di trombi. Avanti, estendere il venotomia con i microscissorsfinché la lunghezza è di circa 2-3 volte il diametro del CCA. Evitare violenti stretching e prestare attenzione a mantenere un filo di lama tagliente e pulito.
- Approssimi la fine del CCA al EJV. Effettuare una incisione laterale tagliata alla fine donatore del CCA per regolare il diametro alla lunghezza alle dimensioni venotomia (Figura 2).
4. end-to-side anastomosi
- Utilizzare un nylon sutura monofilamento 11-0 per l'anastomosi CCA-to-EJV end-to-side. Suturando la parete mediale della anastomosi in una direzione craniofacciale caudale è il passo iniziale. Ogni punto deve essere collocato al di fuori-nella parete venosa prima (figura 3) e da dentro-fuori della parete arteriosa (Figura 4) successiva. Ciò manterrà il nodo sulla superficie esterna dei vasi anastomotiche in ogni momento (Figura 5). Interrotta o continui suture possono essere usati, ma tutti suture continue devono essere serrati come fase finale.
- Once parete mediale è stato suturato, ripetere la procedura dal caudale a cranico con la parete laterale. Ora ogni punto deve essere collocato al di fuori-nella parete arteriosa prima e dall'interno verso la parete venosa successivo. Saline irrigazione contribuirà a mantenere il lume della anastomosi visibile in qualsiasi momento durante la procedura.
- Dopo aver terminato tutte le fasi della anastomosi, rimuovere la clip temporanea dalla vena prima e dalla arteria successivo. Il sangue arterioso scende nella EJV con nessuna o poca che trasuda dalla anastomosi (vedi video modello VH e modello VH 2). Il sanguinamento minimo dovrebbe smettere senza utilizzare la compressione cotone sopra l'anastomosi. Questo deve essere evitata per evitare la trombosi della vena delicata.
- Una volta che il flusso pulsatile attraverso l'anastomosi è confermato e nessun sanguinamento apparente si osserva, irrigare il campo chirurgico con soluzione salina e chiudere l'incisione cervicale con una sutura 6-0 nylon. Infine, amministrare 0,15 ml più di intrapbrupenorphine eritoneal per la gestione del dolore postoperatorio e 0,2-0,4 ml di sottocutanea 0,9% soluzione salina per ricostituire la perdita di sangue durante l'intervento chirurgico.
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Representative Results
Un esito positivo del modello è una fistola artero-venosa brevetto che induce l'ipertensione venosa nel cervello murino. Per convalidare il modello che abbiamo inizialmente misurato la pressione venosa intracranica nel seno sagittale dei topi a 2, 3 e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico. 6 diversi topi sono stati assegnati a ogni gruppo il tempo. La pressione del seno era 8.8 ± 1.2 mmHg nel gruppo misurate due settimane dopo l'intervento chirurgico. Nei 6 topi misurati 3 settimane dopo l'intervento chirurgico, la pressione del seno era 4.7 ± 1.4 mmHg. Infine, i 6 topi misurata 4 settimane dopo l'intervento chirurgico aveva una pressione del seno di 3,9 ± 0,6 mmHg (Figura 6). Postoperatoria due settimane pressione del seno era significativamente superiore alla pressione del seno a 3 e 4 settimane (entrambi p <0.001).
Tuttavia, la tecnica complessa, necessaria per misurare la pressione del seno non è necessaria per assicurare la pervietà fistola e ipertensione venosa regolarmente. Invece, il risultato desiderato può essere checked mediante ispezione diretta della fistola e segni clinici di ipertensione venosa nel topo.
La pervietà della fistola può essere controllato direttamente al termine della procedura chirurgica con due metodi. Il primo è composto da ostacolare temporanea del cranica EJV all'area anastomsis con una pinza di un gioielliere. Questo punto è ora l'unico deflusso del sangue proveniente dal CCA. Se l'anastomosi end-to-side è brevetto, il dilatabile EJV immediatamente palloncino come mostrato nel video di prova pervietà 1. Il secondo metodo è eseguita da occlusione distale innesto venoso al anastomosi e lentamente svuotamento o "mungitura" it con un paio di pinze di gioielliere. Come mostrato sul secondo video per la prova pervietà, una volta che l'occlusione viene rilasciato, una anastomosi brevetto dovrebbe riempire rapidamente il segmento svuotato.
Se il modello funziona, allargamento dell'occhio del mouse Va notato 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Questo may essere dovuto al drenaggio venoso composta della testa e del collo. Sebbene entrambi gli occhi ottengono allargata dopo l'intervento chirurgico, il fenomeno è più evidente sul lato operato come si osserva nella figura 7.
Figura 1:. L'incisione cutanea A metà linea di incisione orizzontale cervicale tutta la zona del collo inferiore del mouse e una trazione morbida delle ghiandole salivari espone destra vena giugulare esterna (EJV). Prendere nota della posizione superficiale del EJV che garantisce una incisione cutanea attenta per evitare eventuali lesioni alla vena delicata.
Figura 2:. Preparazione del anastomosi La parete mediale della EJV è stata contrassegnata con una linea blu lungo il corso della venotomia prevista. A inci sciancraturasione alla fine del donatore CCA viene eseguita per regolare il diametro dell'arteria alla lunghezza al venotomia.
Figura 3:. Fuori-in La parete mediale della anastomosi viene suturata in una direzione craniofacciale caudale con il 11-0 punto prima collocato al di fuori-in parete venosa.
Figura 4:. Inside-out L'ago è guidato da qui dentro-fuori della parete arteriosa per completare una sutura nella parete mediale in modo appropriato per mantenere il nodo sulla superficie esterna della anastomosi.
Figura 5: Mantenere il nodo esterno Nota ho.w il nodo della sutura interrotta scelto in questo caso rimane al di fuori del lume dei vasi per evitare la formazione di trombi che occludono la fistola.
Figura 6:. Analisi pressione Sinus Questo grafico bart visualizza graficamente la differenza di pressione del seno intracranica misurata in mmHg a 2, 3 e 4 settimane dopo l'intervento.
Figura 7:. Proptosi Un giorno dopo l'intervento chirurgico, entrambi gli occhi sono allargata ma l'allargamento occhio destro (ipsilaterale alla chirurgia) è più prominente.
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Discussion
Ipertensione venosa cerebrale prolungata è stata strettamente correlata con più gravi manifestazioni cliniche e prognosi sfavorevole nei pazienti con FAV durale e MAV cerebrali 3. Questi effetti di CVH sono stati ampiamente studiati in modelli di ratto 1,2,8. Un modello equivalente nel topo dovrebbe consentire l'uso di animali geneticamente modificati, che finirebbe per consentire l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella patogenesi di ipertensione venosa e la sua relazione con AVF durale e AVM cervello.
Qui riportiamo un metodo per creare l'ipertensione venosa cerebrale nel topo adulto attraverso un carotide-giugulare fistola end-to-side. Questo nuovo modello esalta i modelli carotide-giugulare fistola ben descritte nel ratto traducendo al mouse e consentendo in tal modo la possibilità di cui sopra di indagare percorsi molecolari e le terapie geniche.
Problemi comuni riscontrati e suggerimenti
Un altro pro comuniblema sta danneggiando la vena con trazione eccessiva, la compressione, o dissezione lungo il suo corso. Pertanto, l'esposizione EJV deve essere accuratamente eseguita al microscopio per identificare piano appropriato di dissezione. Tutti i piccoli rami che scaricano nelle dovrebbe essere identificate e coagulato. Ciò eviterà sanguinamento incontrollato che richiede la compressione della vena e fornirà la ridondanza sufficiente per evitare eccessiva tensione.
Non è raro avere scarsa funzionalità della fistola dopo aver rimosso le clip temporanei. In questo caso, il primo passo dovrebbe essere cercare possibili punti di tensione o l'angolazione in CCA. Ulteriore dissezione dell'arteria o resezione parziale del muscolo sternocleidomastoideo risolverà questo problema. Tuttavia, se la funzione poveri continua dopo queste manovre, la trombosi del sito di anastomosi deve essere sospettata. In questo caso, invece di riaprire il sito anastomosi e la rimozione del trombo, si consiglia di eseguire una nuovaanastomosi cranica alla precedente. Nella nostra esperienza, un terzo anastomosi è impossibile. Non c'è abbastanza lunghezza della EJV e il mouse non tollera anestesia per un lungo periodo di tempo.
LIMITI DELLA TECNICA
I limiti principali di questa tecnica sono: (1) l'anatomia diminutivo dei vasi richiede abilità microchirurgia avanzata ed una curva di apprendimento più lungo per il modello equivalente nel ratto; (2) la pervietà dell'anastomosi è spesso compromessa dalla formazione di trombi e la lunghezza della EJV topo permetterà soltanto un tentativo supplementare di risolvere questo problema; e (3) la chirurgia può richiedere fino a tre ore, esponendo il mouse per un lungo periodo di anestesia. Tuttavia, seguendo i suggerimenti tecnici proposti sopra e tenere il mouse caldo e idratato durante la procedura, un brevetto CCA-to-EJV può essere eseguito con successo e un elevato tasso di sopravvivenza degli animali ottenuti nella nostra esperienza.
Un modello ipertensione affidabile e durevole cerebrale venoso nei topi è un importante strumento che può servire un ampio numero di scopi nella ricerca cerebrovascolare 13-16. Con l'aggiunta di tecnologia knockout di topi transgenici, questo nuovo modello dovrebbe facilitare ulteriormente la ricerca correlato al gene vivo per tutte le patologie associate a ipertensione venosa cerebrale.
In precedenza, altri autori hanno descritto il modello di ipertensione venosa nel ratto e hanno utilizzato per studiare la fisiopatologia della durale AVF e AVM cervello 4,5,8,9. Descriviamo ora il metodo di tradurre con successo questo stesso modello per i topi, quindi aprendo le sue potenziali applicazioni a tutti i tipi di test genetici trattamento.
Conclusione
Dimostriamo qui un protocollo per ottenere un brevetto CCA-to-EJV anastomosi nel topo adulto. Questo fornisce fistolauna ipertensione venosa cerebrale durevole che è stato un utile strumento per sviluppare diversi modelli di malattia cerebrovascolare nel ratto. Fornendo questo primo passo per sviluppare quegli stessi modelli nei topi, apriamo la possibilità di testare i trattamenti genetici per tali malattie cerebrovascolari.
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Disclosures
Le procedure sperimentali con animali da laboratorio sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale dell'Università della California, San Francisco (UCSF).
Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse relativi ai farmaci e materiali utilizzati in questa procedura.
Acknowledgments
Questo progetto è in parte sostenuto da NIH T32 GM008440 a Espen Walker, R01 NS27713 a William L.Young, P01 NS44155 a William L.Young e Hua Su, R21 NS070153 a Hua SU e dalla American Heart Association AHA 10GRNT3130004 a Hua Su. Dr Ana Rodríguez-Hernández è sostenuta da una sovvenzione "Obra Social La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
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