Summary
Система, описанная в данном документе, использует традиционный оптической ловушки, а также независимые голографический оптический захват линия, способная создания и управления несколькими ловушками. Это обеспечивает создание сложных геометрических механизмов светоотражающие частицы в то же время позволяет одновременно высокой скоростью и с высоким разрешением измерения активности биологических ферментов.
Abstract
Высокое разрешение микроскопа системах с оптическими ловушками обеспечивать точное манипулирование различных объектов преломления, таких как диэлектрическая шарики 1 или клеточных органелл 2,3, а также высокое пространственное и временное разрешение считывания их положения относительно центра ловушки. Система, описанная здесь, имеет одно из таких "традиционных" ловушку работающий на длине волны 980 нм. Это дополнительно обеспечивает второй оптической системы захвата, который использует коммерчески доступные голографической пакет одновременного создания и управления сложными узорами захвата в поле зрения микроскопа 4,5 на длине волны 1064 нм. Сочетание этих двух систем позволяет манипуляцию нескольких объектов преломления в то же время, одновременно осуществляя высокой скоростью и высокой измерений разрешение движения и силы на производство и piconewton нанометрового масштаба.
Introduction
Оптический захват является одним из основных методов в области биофизики 6. Важным шагом вперед в оптических захвата была разработка голографических ловушки, которые позволяют создавать трехмерные модели захвата вместо обычных ловушек точке 7. Такие голографические ловушки обладают преимуществом универсальности в позиционировании преломления объектов. Однако обычные ловушки могут быть легко выровнены, чтобы быть более симметричным, чем коммерчески доступные наборы голографический. Они также позволяют для быстрого точного отслеживания захваченных объектов. Здесь мы опишем системы (рис. 1), которая сочетает в себе два подхода захвата в одном приборе и позволяет пользователю использовать преимущества обоих по мере необходимости.
Общих соображений построения оптических ловушек (на основе одного или нескольких лазерных лучей) подробно обсуждаются в другом месте 8-10. Здесь мы наметим конкретные соображения с нашимПуск в эксплуатацию и обеспечивают деталь нашего процедуру выравнивания. Например, в системах с двумя оптических пучков захвата были описаны ранее (например, ссылка 11), обычно с использованием одного лазерного луча для улавливания преломления объекта и использование другого (намеренно низкой мощности пучка) для отделены считывания положения захваченного объект . Здесь, однако, как лазерные лучи должны быть высокой мощности (300 мВт или выше), потому что оба будут использоваться для улавливания. Для измерений биологических систем, лазеров, используемых для улавливания должно оптимально входят в конкретное окно ЧМР длины волны света, чтобы минимизировать деградацию белка 1. Здесь мы решили использовать диод 980 нм и 1064 нм DPSS лазеры из-за их низкой стоимости, высокой доступности и простоте в эксплуатации.
Мы также решили использовать пространственного модулятора света (SLM) для создания и редактирования нескольких ловушек одновременно в реальном времени 4,5. Эти устройства являются коммерчески доступнымиОднако их интеграция в полной установки представляет уникальные задачи. Здесь мы опишем практический подход, который решает эти потенциальные трудности и обеспечивает универсальный инструмент. Мы предоставляем явный пример для конкретной установки, описанной которые могут быть использованы в качестве руководства для измененных конструкций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка длины волны 980 нм Одноместный оптическую ловушку
- Оптический захват на длине волны 980 нм часто оптимальным для экспериментов биофизики и недорогие лазерные диоды легко доступны мощность достигает 300 мВт. Желательно, чтобы лазерный диод для скрученный с поляризацией, сохраняющих одномодового волокна с известной диаметр поля моды. Волокно должно быть достаточно длинным, чтобы выступать в качестве режима фильтра и, как правило, прекращается либо с FC / PC или FC / APC разъема. Из них FC / APC, предпочтительно минимизировать обратное отражение света и потенциал неустойчивости обратной связи.
- Закрепите лазерный диод 980 нм в креплении, которое позволяет за власть и контроль температуры. Лучше исправить на гору, чтобы оптический стол прямо на максимальную пассивную жары и тем самым свести к минимуму опасность диода недостаточность вследствие неисправности регулятора температуры.
- Установить PC / APC разъем волокна к оптике луч коллиматорный. Эторешающее значение для обеспечения, что направленный луч имеют минимальное расхождение так регулируемая портов волокна являются наиболее полезными. Убедитесь, что выбранный порт волокна совпадает с диаметром поля моды волоконного косичку диода. Если луч должен быть развернут использованием акустооптического дефлектора (AOD) или электрооптического дефлектора (ПС), то коллимированный лазерный луч талии также должна быть немного меньше, чем размер дефлектор отверстием.
- Закрепите коллимирующих адаптер к оптическому таблицы на таком расстоянии от микроскопа, чтобы обеспечить луч маршрутизация, расширение, и размещение других необходимых компонентов. Отрегулируйте оптическим портом для обеспечения последовательного перетяжки на расстояниях, сравнимых с общими пути луча микроскопа.
- Установка зеркала показано на рисунке 1. Удалить объективное от микроскопа и использует зеркала, чтобы направить луч через отверстие в объективном монтажа сцены. Если предпочтительным, размещение дихроичных зеркал DM1 и DM3 не может быть опущен, покапозже. СД2 и DM3 оба shortpass и передают видимый свет, отражая ближнем ИК и выше.
- Это полезно временно смонтировать красный лазерный указатель на место цели, выровнены по оптической оси микроскопа. Пользовательских механической адаптера необходимо обеспечить ция лазерной указки. Видимый луч от лазерной указки может быть направлен к центру апертуры оптического порта и может быть использован для установки объективов (см. ниже).
- Установите 980 нм расширитель пучка (L8 и L9) на должном расстоянии от оптического порта, чтобы для будущих вставки компонентов рулевого управления (AOD или ПС) при необходимости 1. Расширил луч должен слегка переполнять задней фокальной апертуры объектива. (Здесь, линзы с фокусным расстоянием 125 мм и 60 мм на кеплеровской расположения, примерно удвоится перетяжки). Используйте видимый луч лазерной указки (см. раздел 1.6), чтобы обеспечить правильное размещение объектива и грубую центровку.
- Устанавливатьл 980 нм рулевого линз (L2 и L3) в телескоп, как указано расположение (здесь и есть 60-мм фокусное расстояние) 1. L3 устанавливается в плоскости, сопряженной к задней фокальной плоскости объектива. Горы L3 на точность позиционирования этап XYZ для обеспечения управления лучом. Это полезно для сцены XYZ иметь цифровые индикаторы для его микрометров, что позволяет повторяемые позиционирования и репозиционирования ловушку. 0.5 "спектр туристических обычно достаточно, однако больше путешествий для позиционирования L3 вдоль оптической оси может быть полезным. Используйте видимый луч лазерной указки (см. раздел 1.6), чтобы обеспечить правильное размещение объектива и грубую центровку.
2. Установка лазерный детектор
- Установите DM3 дихроичных зеркала над конденсатором, как показано на рисунке 1. Пользовательские горе, как правило, требуется. Закрепить четырех фотодиодом (QPD) или позиционно-чувствительный детектор (PSD) 8 в сторону конденсатора сборки и епзЮр, что 980 нм лазерного луча, отраженного от DM3 бьет она примерно по центру. При использовании QPD убедитесь, что она установлена на небольшой сцене XY, чтобы обеспечить точное центрирование датчика на лазерный луч.
- Установите L1 (как правило, 30 мм объективом) между DM3 и датчиком. Позиция L1 так, чтобы сфокусировать луч до одной точки на датчике.
- Установите режекторного фильтра непосредственно перед L1 блокировать 1064 нм луч, а также любые паразитные отражения видимого света от подсветки микроскопа и окружающего освещения.
3. Установка 1064 нм длина волны Голографические ловушки
- Голографическая часть установки построен вокруг коммерчески доступных аппаратных / программных пакета голографических зеркал, используемых в данный пакет рассчитан на максимальную мощность инцидента 5 или 10 Вт / см 2. Одиночный режим TEM00 пучков в этом диапазоне мощности могут быть легко получены из DPSS лазер на 1064 нм.
- Установить 1064 нм лазер на повышенныхплатформу для примерно соответствовать высоте луча для линии 980 (см. раздел 1).
- Если не прямо управляемым, мощность лазера можно отрегулировать вручную путем установки половины пластины волны (ВПТ) и поляризатор (PBS) сразу после лазерной выходной апертуры. Это полезно, чтобы установить поляризатор во вращающейся сцене, чтобы быть в состоянии соответствовать требованиям голографической зеркало для поляризации пучка.
- Установить 1064 нм расширитель пучка (L6 и L7). Талии лазерный луч должен быть расширен в соответствии с размером диагонали голографического зеркала. Для больших степеней расширения (выше 10х) это может быть проблемой, чтобы сохранить размер расширителя мала. Таким образом, может быть желательно использовать линзы с чрезвычайно небольшим фокусным расстоянием (здесь: 16 мм и 175 мм).
- Установите другие зеркала, как показано, чтобы направить луч 1064 нм через объектив.
- Безопасные DM1 дихроичной (45 ° угла падения) в кинематической крепления и расположите сборки на пути луча 980 нм, так что она позволяет undiminisheд передачи, что луч.
- Активируйте лазерной указкой свет. DM1 зеркало должно отражать достаточное количество видимого света, чтобы правильно расположить пространственный модулятор света (SLM) на пути этого пучка. ОДС также должна быть наклонена так, что входящие и исходящие лазерные лучи как можно ближе к нормали. Однако угол наклона должен быть достаточно большим для того, чтобы лазерный луч не обрезаются крепления линз и других оптических компонентов. 5 ° угла должны быть легко достижимо и достаточно мал. Наконец расстояние от DM1 в ОДС должны быть точно измерены, так что введение линзы L4 и L5 (см. ниже 3.6) может сопряженные ОДС плоского зеркала и задней фокальной плоскости объектива.
- Установите зеркало, чтобы направлять свет от 1064 расширителем пучка нм до ОДС. Убедитесь, что свет лазерной указки попадает в отверстие расширитель пучка по центру.
- Установите линзы L4 и L5 (здесь: линзы с 125 и 200 мм соответственно). Этот телескоп пару сопрягает ОДС плоского зеркала в задней фокальной плоскости объектива, а также снижает перетяжке только слегка переполнения задней апертуры объектива. Мы выбрали линзы с длинными фокусными расстояниями в космос ОДС от DM1. Это не только очищает место для второй линии лазером, но также имеет тенденцию к выравниванию сделать проще.
- Удалить лазерной указки. Оставьте монтажный адаптер в качестве грубого выравнивания отверстия.
4. Системы Установка и выравнивание Примечания
- Объектив L3 и ОДС должны быть расположены так, чтобы быть оптически конъюгированных с задней фокальной плоскости объектива. Общую фокальную точку L4 и L5 оптически сопряжено плоскости образца, если оптических пучков захвата вводят в бесконечности пространства микроскопа.
- петь ИК-карта зрителя выровнять 980 нм луч идти вдоль центральной оси отверстия в адаптере лазерная указка.
- Использование ИК-карта TО гарантировать, что 1064 нм луч попадает на том же месте, поскольку луч 980 нм на DM1, L2 и L3, и что 1064 нм луч проходит вдоль центральной оси отверстия в адаптере лазерная указка.
- Замените лазерной указкой монтажный переходник с целью. Высокая числовая апертура масло или вода целью является типичным.
- Совместите ловушка длиной волны 980 нм, как описано в 9 от "хождения" лазерного луча до радиально-симметричных интерференционной картины не наблюдается на камере.
- С голографической от зеркала (то есть выступает в качестве пассивного зеркала) используют ОДС и DM1 "ходить" недифрагированный 1064 нм луч для выравнивания 1064 нм ловушку.
- ОДС приводит к значительному недифрагированный пучка, что приводит к сильным неподвижным ловушку лазера в поле зрения. Это полезно для выравнивания, но может быть нежелательным для экспериментов. Чтобы блокировать эту ловушку можно вставить небольшой непрозрачный объект на пути недифрагированный свет в месте сопряженной плоскости образца (например, гоэлектронной общей фокальной точки L4 и L5). Размер этой центральной блокатор месте должен быть несколько больше, чем диаметр диска Эри для сфокусированного света (блокатор с 100-300 мкм в диаметре для системы, описанной).
- djust 1064 нм поляризации пучка использованием поляризатор, чтобы соответствовать ОДС ориентации. Поверните полуволновой пластинки установить выходную мощность пучка по желанию.
- При желании вставить AOD или EOD элементы управления лучом в лазерной линии 980 нм. Обеспечить надлежащее сопряжения этих элементов задней фокальной плоскости объектива и перестроить ловушку. Это полезно для монтажа элементов на рулевом гониометрического этапе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Собранная установка позволяет оператору ловушку несколько объектов преломления в реальном времени и установить их во всех трех измерениях в поле зрения. Проиллюстрируем голографической возможностей инструмента захватом 11 микросферы (рис. 2). Ловушка ограничивая каждого объекта вручную повторно расположенный при захвате, так что окончательная договоренность изображен логотип Университета штата Юта, где этот эксперимент. Комбинированная функция голографических и обычные ловушки представлена на рисунке 3. Обычные ловушки перемещает центральный шарик постепенно быстрее (ловушка скоростью 1,3, 10 и 82 мкм / сек показаны), а голографически определены ловушки остаются неподвижными. На самой высокой скоростью, все движение шарика происходит во время записи одного кадра видео и, таким образом проявляется как крайняя размытость изображения. Можно переместить обычные ловушки достаточно быстро, что бусы вынуждены от захвата потенциал чydrodynamic сопротивление (не показано).
Обратите внимание, что сборка сложных форм использования множества микросфер может привести к случай, когда количество микросфер в поле зрения недостаточно для полной сборки (как это видно на рисунке 2). В таком случае оператор должен физически переместить поле зрения относительно образца (т.е. переместить предметный столик в микроскоп), чтобы предоставить дополнительные микросфер, сохраняя при этом объекты, которые были в ловушке.
Рисунок 1. Схема системы высокого разрешения микроскопа с двумя захвата пучков. Компонентов с пометкой L1-L9 являются основными линзами. Компонентов с пометкой DM1-DM3 являются дихроичных зеркал. Линзы L2 и L3, которые используются для рулевого управления. Линзы L4 и L5 действуют как BEAм редуктором и прокладкой. Линзы L6/L7 и L8/L9 являются парами расширитель пучка для своих лазерных лучей. Без маркировки компонентов изображается как сплошная черная прямоугольники основных зеркал. Компоненты помечены МС и МО являются конденсатор микроскопом и объекта, соответственно. Другие компоненты Quad фотодиод (QPD), режекторный фильтр (NF), регулятор температуры Пельтье этапе (PTC), горячий фильтр (HF), пространственного модулятора света (SLM), акустооптического дефлектора (АОД), жалюзи (S1 и S2), полуволновой пластинки (ВПТ) и поляризационный расщепитель луча (PBS).
Рисунок 2. Пространственное расположение представляющая Университет штата Юта логотипа производится с использованием 11 оператор, определенный и контролируются голографическими ловушек. Объектов, захваченных являются преломления бисером (см. таблицу материалов для более DetaiLs) приостановлены в деионизированной воде. Красные и зеленые кружки ловушку позиций. Кадры (а) - (е) представляют собой последовательные этапы логотип строительства.
Рисунок 3. Два ряда ловушки с использованием 6 оператору определить и управлять голографический ловушек. Дополнительный обычный ловушка образована между двумя рядами и его положение регулируется с различной скоростью, как указано. Шарик перемещается максимальное пространственное перемещение 4,1 мкм, а затем обратно в исходное местоположение. Видео из бисера регистрируется движение в 47 кадров в секунду. Как ловушку репозиционирование скорость увеличивается, все более значительная размытость наблюдается в видео. Объектов, захваченных являются преломления бисером (см. в таблице материалов для более подробной информации) приостановлены в деионизированной воде. ПтAME таймингов показаны красным цветом. Ловушка репозиционирование скорость отображается для каждой строки. Зеленые полоски шкале соответствуют 5 мкм в каждом направлении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы построили инструмент, который сочетает в себе два оптических ловушек различных типов (рис. 1), чтобы обеспечить захват отдельных помещений объекта для манипуляций и измерения. «Обычной» оптической ловушки построен вокруг диодного лазера 980 нм. Этот луч расширился, управляемые и затем вводят в нашу инвертированный микроскоп ("светло-красный" луч на рисунке 1). Голографической оптической ловушки построен вокруг 1064 нм лазер DPSS. Луч расширяется, чтобы соответствовать размеру пространственный модулятор света (SLM), отраженный от ОДС при низких углах падения уменьшена до слегка переполнения задней фокальной отверстия объектива, в сочетании с "обычными" захвата линии с помощью дихроичного зеркало, и, наконец, вводится в микроскоп наш ("темно-красный" луч на фиг.1). Обратите внимание, что ОДС должны быть размещены в плоскости, оптически сопряженной задней фокальной плоскости объектива.
В протоCol разделе мы опишем дизайн и выравнивание соображения, которые позволяют свести к минимуму пространственной зоны по настройке и все еще относительно легко включить строительства. Мы также описываем блокирование недифрагированный компонентом производства ОДС, которые могут быть необходимы для коммерческого пакет, как и система, используемая здесь, но является несколько сложным и на сегодняшний день плохо документированы.
Конструкция, описанные здесь является легко настраиваемым. Мы включили краткие упоминания нескольких популярных высокого уровня для настройки оптической ловушки и как можно было бы интеграции таких устройств в наш дизайн. Например, одна ловушка может управляться различными способами, в том числе акустооптических дефлекторов (AOD), электро-оптического дефлектора (ПС) 12, подвижных или деформируемых отражателей или просто растеризации рулевого линза (L3 в нашей установке) 1. Кроме того, положение захваченного объекта можно определить, используя множество схем и датчиков. В таких случаях, типичный размещения и выравниванияния соответствующих компонентов кратко описана. Мы ожидаем, что эта работа может служить образцом для более сложных конструкций в будущем.
Несколько практических соображений и использования ограничений Обращают на себя внимание. Во-первых, оптических ловушек не должны быть расположены слишком близко друг к другу так, чтобы не мешать их привлекательными потенциалов вблизи центра ловушки. Если близкое расположение двух ловушки необходимо, то можно определить линию ловушка соединяющую две точки, так что привлекательный потенциал ловушки проходит вдоль всей линии. Другим практическим вопросом является то, что захваченные объекты не могут быть перемещены так быстро, что они испытывают чрезмерное гидродинамического сопротивления (точный порог зависит от силы ловушки) в противном случае сопротивления может подтолкнуть объектов из ловушки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Университете штата Юта. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дж. Сю (UC Merced) и д-р Редди BJN (UC Irvine) за полезные обсуждения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical table | Newport corporation | ST-UT2-56-8 | Irvine, CA |
| Microscope, Inverted, Eclipse Ti | Nikon USA | MEA53220 | Melville, NY |
| Plan apo 100X oil objective (1.4 NA) | Nikon USA | MRD01901 | Melville, NY |
| Oil condenser Lens 1.4 NA | Nikon USA | MEL41410 | Melville, NY |
| EMCCD camera | Andor technology USA | Ixon DU897 | South Windsor, CT |
| 1/3" CCD IEEE1394 camera | NET USA Inc | Foculus FO124SC | Highland IN |
| Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength | Klastech Laser Technologies | Senza-1064-1000 | Dortmund; Germany |
| laser diode, TEM00, SLM, 980 nm | Axcel Photonics | BF-979-0300-P5A | Marlborough, MA |
| laser diode mount | ILX Lightwave | LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984 | Bozeman, MT |
| adjustable fiber ports | Thorlabs | PAF-X-11-B | Newton, NJ |
| holographic system | Arryx | HOTKIT-ADV-1064 | Chicago, IL |
| holographic mirror | Boulder Non-linear Systems | this is a part of HOTKIT-ADV-1064 | Lafayette, CO |
| Calcite polarizer | Thorlabs | GL10-B | Newton, NJ |
| half-wave plate | Thorlabs | WPH05M-1064 | Newton, NJ |
| Polarizer rotation mount | Thorlabs | PRM1 | Newton, NJ |
| half-wave plate rotation mount | Thorlabs | RSP1 | Newton, NJ |
| Shutter | Thorlabs | SH05 | Newton, NJ |
| dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI | Chroma Technology | t750spxrxt | Bellows Falls, VT |
| dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI | Thorlabs | DMSP1000R | Newton, NJ |
| custom mechanical adapter | Thorlabs | SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore | Newton, NJ |
| notch filter | Semrock | FF01-850/310-25 | Rochester, NY |
| Acousto-Optic deflector (2-axis) | intraAction | DTD-584CA28 | Bellwood, IL |
| goniometric stage | New Focus | 9081 | Santa Clara, CA |
| 60 mm steering lenses | Thorlabs | LA1134-B | Newton, NJ |
| 16 mm aspherical expander lens | Thorlabs | AC080-016-C | Newton, NJ |
| 175 mm expander lens | Thorlabs | LA1229-C | Newton, NJ |
| Spot blocker (cabron-steel sphere) | Bal-Tec | 0.0100" diameter | Los Angeles, CA |
| Microspheres (Carboxyl-polystyrene) | Spherotech | CP-45-10 | Lake Forest, IL |
References
- Svoboda, K., Block, S. M.
- Ashkin, A., Schutze, K., Dziedzic, J. M., Euteneuer, U., Schliwa, M. Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap. Nature. 348, 346-348 (1990).
- Shubeita, G. T., Tran, S. L., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Polin, M., Ladavac, K., Lee, S. H., Roichman, Y., Grier, D.
- Sun, B., Roichman, Y., Grier, D. G.
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C.
- Grier, D. G.
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Sheetz, M. P.
- Spudich, J. A., Rice, S. E., Rock, R. S., Purcell, T. J., Warrick, H. M. Optical traps to study properties of molecular motors. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1305-1318 (2011).
- Visscher, K., Gross, S. P., Block, S. M. Construction of multiple-beam optical traps with nanometer-resolution position sensing. Selected Topics in Quantum Electronics. IEEE Journal of. 2, 1066-1076 (1996).
- Valentine, M. T., Guydosh, N. R., et al. Precision steering of an optical trap by electro-optic deflection. Opt Lett. 33, 599-601 (2008).
