Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Forbedret Utarbeidelse og Bevaring av hippocampus Mouse Slices for en meget stabil og reproduserbar Recording of Long-term Potensiering

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Dette notatet presenterer en komplett metodikk for å forberede og bevare

Abstract

Long-term (LTP) er en type av synaptisk plastisitet karakterisert ved en økning av synaptiske styrke og antas å være involvert i minnet koding. LTP lyttes til ved CA1 regionen akutte hippocampus skiver har blitt grundig studert. Men de molekylære mekanismene bak vedlikeholdsfasen av dette fenomenet er fortsatt dårlig forstått. Dette kan delvis skyldes de forskjellige anvendte forsøksbetingelser ved forskjellige laboratorier. Faktisk er vedlikeholdsfasen av LTP sterkt avhengig av eksterne parametere som oksygen, temperatur og luftfuktighet. Det er også avhengig av interne parametere som orientering av flyet og kutting skive levedyktighet etter disseksjon.

Optimaliseringen av alle disse parametrene muliggjør induksjon av en meget reproduserbar, og veldig stabil langtidspotensiering. Denne metodikken gir mulighet for ytterligere å utforske de molekylære mekanismene som er involvert i stabil økningi synaptiske styrken i hippocampus skiver. Det understreker også betydningen av eksperimentelle forhold i in vitro undersøkelse av nevrofysiologiske fenomener.

Introduction

I dag er det begrenset forståelse av hvordan komplekse minner lagres og hentes frem ved neuronal krets nivå. Imidlertid er en samlende hypotese av lagringsenheter tilgjengelig og bredt akseptert: minner er lagret som endringer i styrken av synaptiske forbindelser mellom nevroner i sentralnervesystemet. På sin egen, har forskning på synaptisk plastisitet i stor grad dratt nytte av to banebrytende oppdagelser. (1) I et banebrytende eksperiment, Bliss og Lomo en, ved hjelp av intakt bedøvet kanin, fant at levering av en kort høyfrekvente (1 sek, 100 Hz) stimulering til perforant banen til hippocampus forårsaket en langvarig (flere timer) øke i de relaterte synaptiske forbindelser. Denne fascinerende fenomenet ble kalt "Long-Term Potensiering" eller LTP av Douglas og Goddard i 1975 2. (2) Senere ble det funnet at et lignende fenomen kan utløses i hjernen skiver (0,4 mm) kunstig opprettholdt i live in vitro in vitro ved å levere ett eller flere tetani til en bunt av aksoner (de såkalte Schaffer kollateraler) ved opptak av det resulterende feltet eksitatorisk synaptisk potensial fremkalt i de pyramidale neuroner i den såkalte CA1 regionen. Mekanismene for LTP induksjon har i stor grad blitt avslørt. I utgangspunktet aktiverer en Ca 2 + tilstrømning gjennom NMDA reseptorer enzymer med to konsekvenser: en fosforylering av AMPA reseptorer (som øker deres effektivitet) og en inkorporering av ekstra AMPA reseptorer i den postsynaptiske membranen tre. I motsetning til mekanismene i vedlikeholdsfasen av LTP er stort sett ukjent, særlig fordi det er eksperimentelt mye mer vanskelig å opprettholde en sunn skive i mange timer enn i 30 til 60 min.

Mange studier har vært dedikert til forståelsen av LTP mekanismer og interessante teorier har blitt utarbeidet i løpet av årene 4-11. Men until nå, har de nøyaktige molekylære mekanismene bak stabil økning i synaptiske styrken ikke klarlagt. Dette kan være delvis på grunn av problemer med å reprodusere tidligere resultater i forskjellige laboratorier bruker ulike teknikker for utarbeidelse og vedlikehold av hippocampus skiver. I sin metodikk papir, understreket Sajikumar et al. 12. viktigheten av eksperimentelle betingelser for utarbeidelse av rotte hippocampus skiver og registrering av stabil LTP. I denne videoen presenterer vi alle optimalisering trinn utviklet i vårt laboratorium gjennom årene for å kunne registrere en meget stabil LTP i mus hippocampus skiver.

Denne optimaliseringen har blitt gjort fra protokoller utviklet og brukt av andre laboratorier som studerer LTP mekanismer i mus 13 og rotter 11. Den lar erfarne forskere til å indusere og registrere en svært langvarig LTP i voksen mus med en høy grad av suksess. Den physiological grunnlag av den induserte LTP ble nøye kontrollert og demonstrerte 14. I denne metodikken papir, viser vi at eventuelle modifikasjoner av eksperimentelle forhold, som temperatur eller oksygentilførsel kan ha stor innvirkning på LTP vedlikehold mens disseksjon prosedyren kan dypt endre skiver oppstemthet. Det må også understrekes at presis kontroll over alle disse parameterne krever en opplæring av flere måneder for uerfarne studenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med National Institutes of Health regelverk for omsorg og bruk av dyr i forskning og etter avtale med den lokale etiske komité.

En. Utarbeidelse av kunstig cerebrospinalvæsken

De samme mediene brukes til å dissekere, skjære og perfuse skiver (1 ml / min) i løpet av hvileperiode og elektrofysiologiske opptak. Dette mediet er sammensatt av 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 4 PO, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4 og 10 mM D-glukose.

  1. Veie de forskjellige komponentene til 2 l av ACSF bortsett MgSO 4 som allerede er i oppløsning (1 M). Ved hjelp av en standard løsning gjør det mulig å være sikker på den eksakte konsentrasjonen av Mg 2 + fordi MgSo4 i pulver er svært hygroskopisk. Ca 2 +: Mg 2 + ratio stor innvirkning LTP induksjon og vedlikehold14 og dermed sine proporsjoner må alltid respekteres.
  2. Sett alle komponenter unntatt CaCl 2 i et glass uteksaminert sylinder og bringe til 2 L med destillert H 2 O.
  3. Rør kraftig. Når alt er oppløst, tilsett carbogen gjennom et akvarium bobleren og rør festet til beholderen (95% O-2, 5% CO2). Vent noen minutter og tilsett kalsiumklorid når pH er fastsatt til 7,4 ved handlingen av bikarbonatbuffer.
  4. Hold 600 ml i en nedkjølt rektangulær glassfat og kjøles ned til 4 ° C med is rundt fatet. Dette mediet blir brukt til hippocampus disseksjon.
  5. Filtrere de resterende 1400 ml og holde i en erlenmeyerkolbe.

2. Klargjøring av Elektrofysiologisk Rig and the Brain Slice Recording Chamber

Den perfusjon kretsen er laget av to peristaltiske pumper, en pumpe frisk væske fra en reservetank og den andre pumpende brukt fluid fra than spiller kammer til en bin. Fersk væske er lagt til en hjemmelaget perfusjon system hvor det er re-oksygenrikt og varmes opp før de når grensesnittet innspillingen kammeret ved gravitasjon (figur 1A). Grensesnittet innspillingen kammeret er designet av FST (Fin Science Verktøy, Vancouver, Canada, Figur 1B). Tissue skiver er plassert på vevet net filter festet til en avtagbar ring og godt kan være kontinuerlig holdes under vilkårene for grensesnitt ved å justere høyden av inntaks vel nål. En hjemmelaget plastrør blokkert på sitt enden og perforert lateralt (0,5 mm) er festet til sug nål for å øke nivået stabilitet i kammeret. Opptaket hode er montert over et vannbad inneholdende en gass dispersjon stein som bidrar til å opprettholde et fuktig miljø ved å føre fuktig luft gjennom portene avbøyning i opptaket hode (for å redusere vann-dråpe-dannelse). Bath og middels temperatur styres ved kontinuerlig å variere nivået av likestrøm thgrov en silikongummi-embedded varmeelement i vannbadet. Termistorer i vannbad og opptak brønner tillate kammeret temperaturen kan stilles inn og presist overvåkes på disse stedene.

Varmesystemet av kammeret er gjennomført av en global varmesystem å kontrollere temperaturen i hele riggen. Programvaren er utviklet av forskere ved University of Edinburgh ( www.etcsystem.com ) overvåker og utjevner temperaturen på oksygenrikt vind, hjernen skive, elektrodene og de ​​resterende riggen som gir et stabilt miljø for langsiktig opptak (figur 1C) . Den temperatur som brukes for mus hippokampale skiver er 28 ° C.

  1. Skyll alle perfusjon krets med destillert H 2 O i minst 20 min og starte varmesystemer.
  2. Start carbogen bobling i kretsen. Carbogen ankommer den hjemmelagde perfusing rør gjennom fIlter stearinlys og i vannbad under innspillingen kammeret. Strømningshastigheten i vannbadet er kontrollert av en strømningsmåler. Dersom vannmengden er for treg, kan vevet bli hypoksisk. Omvendt, dersom strømningshastigheten er for høy, kan gassen ikke være tilstrekkelig varme-og fuktig fører til tørking av vevet. Høy gass-strømningshastigheten kan også øke sjansen for vann-sprøyting over det vev fra vannbadet under fører til osmotisk sjokk. Dette kan forhindres ved å tilsette biter av nylon mesh (100 pm) ved utløpet av blokker de havner.
  3. Tøm kretsen og fylle opp med filtrert ACSF.
  4. Sett ring som vil støtte skive i holdekammeret. Et vevet filter med netto mesh åpninger som strekker seg 500 til 750 um er strukket og festet til ringen med to deler harpiks epoksylim. Den vevde netto filter er laget av 87% polyamid og 13% elastan (truse 15 hiet). Lim må brukes forsiktig for å unngå dannelse av relieffer på overflaten av ring.
  5. Ta forsiktig alle luftbobler fra kretsen.
  6. Juster nivået av ACSF i innspillingen kammer med skruen på inntaks nål. Hastigheten av de peristaltiske pumper blir justert til 1 ml / min for innløpet til pumpen, og 5 ml / min for uttaket pumpen.

Den Perfusjonssystem plasseres på en stiv vibrasjonssikker tabell og er omgitt av et Faraday-bur.

3. Fremstilling av disseksjon Område

Kirurgiske instrumenter: en skalpell med en # 11 blad, små standard dissekere saks, våren saks, buede tang, to Heidemann spatulae og en skje.

Supplerende materiale: en giljotin, en underpad, en McIlwain vev helikopteret med et barberblad, filterpapir, et glass Pasteur-pipette med en gummi-smokken, pipetter to plast Pasteur hvorav den ene med en vid åpning, en petriskål, en metallisk sylinder med 7 mm diameter (Figur 2A).

    (Figur 2A).
  1. Legg ut instrumenter for bruk. Legg tre lag av filterpapir på vev helikopteret plate og et nytt barberblad renset med destillert vann og eter (figur 2B). Barberbladet må være vannrett når den berører papiret. Blade kraft justeres til halvparten av maksimal verdi og hastigheten til omkring en tredjedel av maksimalverdi.
  2. Oppmerksomt sjekke om alt er klart (instrumenter, temperatur ...) fordi du ikke vil ha tid etterpå.
  3. Be noen om å spraye disseksjon med en Pasteur pipette fylt med kaldt ACSF.
  4. Anesthetize musen med Nembutal IP (100 mg / kg) før halshogging. Halotananestesi kan også brukes. Vi har sammenlignet begge metoder og obtastudere aggressiv samme resultatene. Decapitation må utføres under anestesi men cervikal dislokasjon kan også brukes. Men halshugging trenger en veldig god praksis for å unngå dyrs lidelser.
  5. Dissekere på underpad så raskt som mulig under kaldt ACSF kontinuerlig dusj.

4. Brain Removal

  1. Mens fortsatt holder hodet med pekefingeren og tommelen på en hånd på snuten, gjør et snitt med de dissekere saks langs midten av toppen av hodet med start ved kanten av giljotinen snitt og kjører rostrally til pannebenet .
  2. Skjær gjennom kutan muskel på hver side av hodet for å fullt avsløre skallen plater og fjerne musklene ved kaudal side av hodet.
  3. Med dissekere saks, klippe den temporalis muskelen på hver side, langs temporalis plate, og deretter klippe frontpartiet platene i midten, tvers. Deretter gjøre et lite kutt på nakkeknøl, mellom de to plselskaper.
  4. For hver side, kuttet ved kaudal bunnen av occipitale plater.
  5. Skjær langs sagittal sutur med våren saks.
  6. Med pinsett, fjerner skallen halvdelene ved å spre dem bort fra hverandre.
  7. Med skalpell, skjære tvers like etter luktelappen og like før lillehjernen deretter stupe ekstraherte hjernen inn i dissekere fatet med kaldt ACSF.

5. Hippocampus Dissection

  1. Når hjernen er immerged i dissekere fatet, kutte de to halvkulene fra hverandre med en skalpell inn i midten.
  2. Disseksjon av hippocampus er utført med spatulae etter visuell kontroll gjennom en kikkert kirurgisk mikroskop (X25, figur 2A). På en halvkule, forsiktig spre strukturer for å se den laterale ventrikkel. Fjern hjernestammen og diencephalon. Dette gjøres ved å påføre spatulae på den frontale cortex på den ene siden og på den diencephalon påandre siden. Vær nøye med å ikke berøre hippocampus med spatulae og å ikke strekke det under vev snitting.
  3. Kutte fornix og skyv hippocampus ut av cortex (rulle), ved å sette inn en slikkepott i ventrikkel.
  4. Når hippocampus ekstraheres, fjerne overflødig cortex vev og gjenværende blodkar.

6. Kutting av Slices

  1. Med en bred munn plast Pasteur pipette, overføre hippocampus i en skje med sine alvear overflaten oppover (konveks side).
  2. Fjern overflødig væske med en standard plast Pasteur pipette.
  3. Reis opp skjeen vertikalt nesten berøre filter av chopper (figur 2B) og slippe av hippocampus fra skjeen, ved raskt å trykke på filter papir og flytte tilbake skjeen.
  4. Orientere hippocampus og skjære den tvers til 400 mikrometer med helikopteret (se Figur 2C for orientering av hippocampuss i forhold til barberbladet). Handle så raskt som mulig.
  5. Fjern filter papir med skiver hippocampus og pakk det rundt metallisk sylinder å spre skiver litt. Deretter, befrir de skiver med spray av ACSF hjelp av en standard plast Pasteur-pipette og samle dem i en petriskål fylt med kald ACSF.

7. Inkubasjon av Slices i Interface

  1. Velg skiver med en standard plast Pasteur pipette og raskt plassere dem i innspillingen kammer. Slices gjenopprette fra disseksjon traumer direkte i innspillingen kammer, i grensesnittet ved 28 ° C.
  2. Stykket vil mest sannsynlig synke. Senk væskenivået å nå skive nivå, og deretter heve den for å gjøre det flyte.
  3. Drei skive i riktig stilling samtidig som man reduserer nivået. Skiver er alltid orientert på samme måte for å lette plassering av elektrodene (2 stimulerende og en innspilling elektroder) i CA1-regionen.
  4. Stopp nårfluidet er i grensesnittet. A "menisk" av mediet rundt skive er indikativ for et tilstrekkelig nivå av mediet. Netto Filteret må være mettet med media, men ikke helt under vann.
  5. Hold kammeret dekket med papirfiltre plassert over den perforerte lokket.
  6. La skive hvile i minst 1,5 timer ved 28 ° C.

8. Opptak av Synaptic Responses

  1. Innspilling elektrode: glass kapillærer er trukket for å få et tips motstand på 2-5 MΩ når de er fylt med ACSF. Et lite stykke filterpapir plasseres rundt tuppen av elektroden og ben voks påføres ved ytterkanten for å redusere kondensering. Stimulerende elektroder: platina-iridium bipolare cluster elektroder med en 12,5 mikrometer diameter er kjøpt fra FHC (USA). Med riktig pleie, kan hver elektrode brukes minst 30 ganger (figur 1B).
  2. Plasser elektrodene i stratum radiatum av CA1 regionen, foret alle elektrodeneopp (figur 3A). Elektroder er senket 75-150 mikrometer under overflaten av stykket med Narishige mikromanipulator. De to stimulerende elektroder er plassert for å stimulere to forskjellige bunter av Schaffer materiell. Når elektrodene er senket ned på den skive, blir papirfiltre omhyggelig plassert rundt for å lukke kammeret.
  3. Bifasestimulering (0,08 ms puls varighet per halv-bølge) er utført ved konstant spenning med en Grass stimulator koblet til SIU-V isolater. Maksimal respons kontrolleres ved å øke stimulus intensitet fra 2 V til maksimalt 12 V. Felt epsps forsterkes 1000 ganger med en WPI ISO-80 forsterker og filtrert ved 10 Hz og 10 kHz. Signalet blir så sendt til en PC via en National Instrument A / D-konverter. Stimulering, datainnsamling og analyse er utført ved hjelp av WinLTP program ( www.winltp.com ). Felt EPSPS er bokført til 40% av maksimal amplitude oppnådd i en inngang-outsette kurve. For hver skive, er fEPSP bakkene normalisert mot den gjennomsnittelige hellingen over 30 min forut for LTP induksjon.
  4. LTP er utløst ved å anvende en enkelt tog av stimulering (100 Hz) ved test styrke på den ene vei mens den andre reaksjonsveien tjener som en kontroll.

9. Rengjøring av Setup

  1. Skyll hele kretsen med en 3% oppløsning av hydrogenperoksyd (H 2 O 2) i minst 10 min, deretter avløp. Kretsen vil bli nøye skylles med destillert vann før du starter et eksperiment. Bruken av H 2 O 2 er ikke absolutt nødvendig så andre laboratorier bruker bare destillert vann for rengjøring, men vi har lagt merke til avsetting av mørke rester i rørsystem ved bruk av bare vann.
  2. Erstatte vann i vannbadet under innspillingen kammeret.
  3. Badekar stimulerende elektroder tips i alkohol for 5 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metodikken har vært anvendt for å analysere egenskaper for langvarig langtidspotensiering indusert i akutte hippokampale skiver fra voksne C57BL/6J mus (JANVIER SAS, Frankrike) 14. Overraskende, har forbedring av de eksperimentelle forholdene førte til en ny måte å se på LTP. Vi viste at langvarig økning i synaptiske styrken ikke krever syntese av nye proteiner.

Her viser vi at LTP induksjon avhenger skiver levedyktighet og oppstemthet. Når disseksjon av hippocampus var for sakte eller for skadelig, skiver oppstemthet økt og polysynaptic responser kunne observeres etter LTP induksjon (Figur 3B). I dette tilfellet var LTP induksjon mye mindre effektiv og potensiering ble opprettholdt.

Vi ønsker å understreke det faktum at selv i skiver tilsynelatende friske, tekniske forhold har stor innflytelse på varigheten av LTP indusert av en enkelttog av stimulering. I tidligere publikasjoner, viste vår gruppe som en kortvarig LTP kan bli forvandlet til en langvarig en ved å endre utvinning forholdene i skive 15. Over år med daglig praksis, observerte vi at suksessive forbedringer i våre teknikk har ført til en progressiv økning i varigheten av LTP indusert av en enkelt tog under standardforhold. Faktisk viste opptak gjort i 2005 en kortvarig LTP går tilbake til baseline innen 3 hr (Figur 3C, fylte sirkler). Modifikasjoner i disseksjon prosedyre reduserer vev strekker har gjort det mulig å oppnå en LTP opprettholdes i 6 t. 16 (figur 3C, fylte kvadrater). Og til slutt, har forbedringer i grensesnittet oksygenering og temperaturkontroll, kombinert med elektrode standardisering førte til en LTP stabilt i mer enn 8 timers (Figur 3C, åpne sirkler). Forskjellen mellom de tre gruppene er signifikant (en-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, p <0,001).

Videre har indusert noen endring av temperatur eller oksygenering en økning eller en reduksjon av det synaptiske respons (figur 4). Kontroll av disse parameterne ble kontrollert ved kun å benytte to stimulerende elektroder. LTP ble indusert på en bunt av Schaffer sikkerheter mens en annen pakke ble brukt som en intern kontroll av synaptiske styrke stabiliteten.

Figur 1
Figur 1. Elektrofysiologisk rigg og hjernen skive innspilling kammer. (A) Perfusjons krets med hjemmelaget tyngdekraft perfusjon system alimented av en slangepumpe, isolerte stimuli enheter (to per elektrode), kirurgisk mikroskop og opptak kammer. (B) Interface opptak kammer med stimulerende ogopptak elektroder. Papirfiltre har blitt fjernet fra lokket for å se ringen støtte stykket. (C) kontrollenhet med to stimulatorer, oscilloskop, A / D-konverter, temperaturkontroll programvare og WinLTP programvare.

Figur 2
Figur 2. Verktøy og materiell som brukes til hippocampus kutting. (A) Disseksjon skål som inneholder nedkjølt ACSF og kirurgisk mikroskop. Skalpell montert med en # 11 blad, små standard dissekere saks, våren saks, buede tang, to Heidemann spatulae, skje, pipetter to plast Pasteur hvorav den ene med en bred munn, petriskål, metallisk sylinder av 7 mm diameter og ring som støtter stykket i innspillingen kammer. (B) McIlwain vev helikopter. (C) Tegning og fotografi of venstre hippocampus i posisjon for å kutte. Orienteringen av barberblad indikeres av den røde stiplede linjen. Omfanget av retikkelen:. 1 mm Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Induksjon av LTP i hippocampus skiver. (A) skisse med de to uavhengige synaptiske inngangene S1 og S2 til den samme nevronal populasjon. I hver skive ble to stimulerende elektroder (S1 og S2) satt på plass. S1 veien ble brukt for å indusere LTP, mens S2 pathway fungerte som en kontroll. (B) Eksempel fEPSP spor fra individuelle eksperimenter i en helt friskt skive (til venstre) og i et stykke presentere en høy grad av eksitabilitet (høyre). De ble registrert bare BEF malm LTP induksjon (røde spor) og en time etter LTP induksjon (blå spor). Når skivene ikke er helt frisk (til høyre), er polysynaptic responser observert og fEPSP skråningen potensering er redusert. (C) Sammenligning av tiden kurs av fEPSP skråningen etter LTP indusert av en enkelt tog med høy frekvens stimulering (100 Hz, en sek) registrert i 2005, 2010 og 2011 i vårt laboratorium. Første forsøkene ble tatt opp i 2005 (fylte sirkler, n = 11). Påfølgende opptak (Villers, et al. 2010) dratt nytte av en forbedret disseksjon prosedyre (fylt torg, n = 6). Dagens resultater oppstå fra optimalisering av grensesnittet oksygenering og temperaturkontroll sammen med elektrode standardisering (åpne sirkler, n = 6). Klikk her for å se større figur .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Figur 4. Variasjon av fEPSP skråning som en funksjon av temperatur og oksygen strømningshastighet. (A) Økende oksygen strømningshastighet på vannbad under innspillingen kammer 0,15 til 0,25 l / min (blå kurve) induserer en reduksjon i fEPSP helling på 20% (kurve rosa) (B). Økning av temperaturen 28-29 ° C (grønn kurve) induserer en mer enn 50% økning i fEPSP skråning (rosa kurve). Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utviklet i vårt laboratorium en protokoll som følge av en kombinasjon av metoder utviklet og brukes av andre laboratorier har en stor kompetanse i LTP opptak 11,17. Denne protokollen er innrettet til voksen mus hippocampus, og kan brukes på dyr av enhver alder og bakgrunns-genotype. Den gjør også analyse av LTP i transgene mus utvikler nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom 18,19.

Utnyttelse av denne protokollen for rotte hippocampus skiver kan nødvendiggjøre noen tilpasninger. For eksempel har de fleste av de studier utført hos rotter bruke en temperatur på 32 ° C i stedet for 28 ° C. Mathis et al. 20. foreslått en annen metode for fremstilling av hippokampale skiver fra aldrende mus eller rotter.

Materiale og metode

C57BL/6J mus kommer fra JANVIER SAS (Frankrike), men samme resultat oppnås med C57BL/6J mus fra Charl es River Frankrike.

Hippocampus er hurtig isolert mens vevet er neddykket i kaldt ACSF å redusere celleskader. Dette tillater en reduksjon i eksitotoksisitet, men er kjent for å indusere proliferasjon synapse 21,22 som kan maskere ytterligere strukturell synaptisk plastisitet.

Deretter bruker vi en vev chopper for å ha klippet i stedet for vibratome. En vev chopper er spesielt godt tilpasset seksjonering av små biter av vev som mus hippocampus. På vev helikopteret, er hippocampus alltid orientert på samme måte i henhold til fremgangsmåten ifølge Alger et al. 23.. De plasserte striations på alvear overflaten, synlig med skrå belysning, parallelt med barberblad. Denne metoden gir hippokampale skiver av den dorsale delen kuttet med en vinkel på 15 ° fra den tverrgående akse (se Figur 2C). Deretter blir skiver manipulert med et minimum av direkte kontakt.

ove_content "> Slices er opprettholdt i grensesnittet ved 28 ° C rett etter disseksjon. Denne metoden har vist seg å redusere polysynaptic aktivitet og epileptogenicity i mus og rotter skiver 24.

Eksterne parametrene blir nøye kontrollert for å oppnå reproduserbare resultater. Bipolar cluster stimulerende elektroder (FTC) brukes i stedet for hjemme-laget elektroder for å øke reproduserbarheten i induksjon, ser at amplitude av LTP induksjon egentlig avhengig av elektroder kvalitet.

ETC system fra University of Edinburgh 11 opprettholder en konstant og jevn temperatur inne hele eksperimentell rigg og carbogen forbruk er stabilisert med en flow meter. Grenseflatenivå kontrolleres visuelt ved hjelp av et binokulært kirurgisk mikroskop, og opprettholdes meget stabil med en peristaltisk pumpe aspirasjon system.

Resultater

Denne protokollen alle¬ ger induksjon av en svært stabil LTP som fortsatt er avhengig av ytre forhold som temperatur og oksygentilførsel. Vi har tidligere vist at LTP indusert i disse forholdene var avhengig av NMDA reseptorer, α-CaMKII autophosphorylation og PI3-kinase aktivering som er de klassiske molekylære stier involvert i LTP 14. Derimot, var vi ikke i stand til å reprodusere avhengigheten av vedlikeholdet fasen av LTP på nytt proteinsyntesen. Muligheten av protein-syntese hemmere, og av Anisomycin særlig for å hindre utvikling av sen fase av L-LTP da de ble brukt rundt induksjon har gjentatte ganger rapportert 4,25. Dette har ført til vanlig holdt hypotesen om at stabilisering av synaptisk plastisitet i mer enn ca 2-3 timers krevde utløser ved LTP-induktiv stimulans av forbigående syntese av nye proteiner 26. Imidlertid har nyere eksperimenter antydet at ting var mer komplisert 27 -32. LTP indusert i våre eksperimentelle betingelser ble opprettholdt selv i nærvær av protein-syntese-inhibitorer som tyder på at andre mekanismer enn nye proteiner syntese kan være involvert i varig fase av LTP.

Likevel in vitro eksperimenter hever alltid spørsmål om den fysiologiske betydningen av den observerte fenomen. Kutting induserer endringer i fosforyleringstilstand av proteiner involvert i aktiviteten-avhengige former av synaptisk plastisitet 33 og forandring i den metabolske tilstand i vevet 34.. Den proteinsyntese-hastigheten er redusert til 10 til 15% av den som ble observert in vivo 35 og balanse mellom mRNA og proteiner er forstyrret 36.. For alle disse grunner, må vi være forsiktige i tolkningen av resultatene.

Per definisjon LTP er en raskt indusert langvarig (dager, uker) forbedring av en eksitatoriske synapse, som troligspiller en viktig rolle i langtidshukommelsen. LTP, in vivo, kan vare i flere uker og lignende endringer i synaptiske styrken oppstå under læring 37,38. Dessuten, det meste av tiden, blir da langvarig LTP forhindres ved mutasjoner, er langtidshukommelse svekket 39..

Mer problematisk er parallell mellom korttidshukommelse og kortvarig langsiktig potensering. Det første problemet er at varigheten av hver enkelt fenomen er ukjent. Korttidshukommelsen har blitt studert en time til en dag etter å lære prosedyren mens kortsiktig LTP er ment å vare mindre enn fem timer. Det andre spørsmålet er om korttidshukommelsen (eller kortvarig LTP) er bare et skritt fremover langsiktige minne (eller langvarig LTP) eller en separat enhet med forskjellige molekylære mekanismer 40. For det tredje, vet vi ikke om kortsiktige LTP er indusert av en svak stimulus som kommer til kort for å forårsake langvarig LTP eller om det er indusert av samme stimulus, men enppears bare når mekanismene bak langvarig LTP mislykkes.

Den langvarige stabilitet i LTP under vårt eksperimentelle forhold kan sees på som en kortsiktig LTP tilsvarer korttidshukommelsen varer mellom 10 timer og 24 timer. I denne form av synaptisk plastisitet, blir proteinsyntesen, som er sterkt redusert i skiver, ikke nødvendig og LTP kan induseres ved en enkelt tog av stimulering. Denne langvarige økning av synaptiske styrke kan skyldes en stabil økning i antallet AMPA-reseptorer i den postsynaptiske membran uten ryggrad ombygging.

Ifølge denne hypotesen, kunne proteinsyntesen være behov for ryggraden utvidelse og strukturelle endringer i synapsene fører til langsiktige minne som varer flere uker. I dette tilfellet kunne den decremental fase av LTP bare observeres 24 timer etter induksjon. Dessverre, til nå, kan akutte skiver bare opprettholdes i live i løpet av ca 16 timer.

et al. 41. har vist at i disse musene, er kortsiktig LTP in vivo og korttidshukommelsen svekkes mens langsiktig synaptisk plastisitet og minne er bevart.

Avvik mellom forskjellige studier utført i forskjellige laboratorier kan skyldes varigheten av kortvarig LTP på grunn av variasjon i den enzymatiske aktivitet i den metabolske tilstand av sektorene eller i frekvensen av proteinnedbrytingen 42.. Proteinsyntese kan bli sett på som en ettergivende etterfylling prosess som involverer omplassere av enzymer som har blitt brukt av læringsprosessen, eller av andre konstituerende celle elementer 43.

Disse resultatene markere betydningen av eksperimentelle forhold på LTP stabilitet. En stabil LTP uavhengig av proteinsyntesen kan bidra til å studere rollen til langvarig post-traducsjonelle modifikasjoner av synaptiske proteiner og mekanismene bak stabil økning av antallet AMPA-reseptorer i den postsynaptiske membran på tross av reseptorer omsetningen.

Denne videoen viser en detaljert protokoll som skal forhåpentligvis bidra til å oppnå reproduserbare resultater i forskjellige laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Bernard Foucart for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av den belgiske Fund for Scientific Research (FRS-FNRS) og ved Queen Elisabeth fond for medisinsk forskning. Agnès Villers er stipendiat ved den belgiske Fund for Scientific Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Nevrovitenskap nevrobiologi anatomi fysiologi Biomedical Engineering kirurgi Memory Disorders læring hukommelse nevrovitenskap nevrofysiologi hippocampus langsiktig potensering mus akutte skiver synaptisk plastisitet, Elektrofysiologi dyremodell
Forbedret Utarbeidelse og Bevaring av hippocampus Mouse Slices for en meget stabil og reproduserbar Recording of Long-term Potensiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter