Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Улучшенная Подготовка и консервация срезов гиппокампа мышь для очень стабильный и воспроизводимый Запись Долгосрочные Потенцирования

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Эта статья представляет собой полную методологию подготовить и сохранить

Abstract

Долгосрочные потенцирование (LTP) является одним из видов синаптической пластичности характеризуется увеличением в синаптической силы и полагают, вовлечены в памяти кодирование. LTP вызвала в области CA1 острых срезов гиппокампа была тщательно изучена. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе поддерживающей фазы этого явления еще мало изучены. Это может быть частично из-за различных экспериментальных условиях, используемых различными лабораториями. Действительно, поддерживающей фазы LTP сильно зависит от внешних параметров, таких как оксигенации, температуры и влажности. Это также зависит от внутренних параметров, как ориентация секущую плоскость среза и жизнеспособность после вскрытия.

Оптимизация всех этих параметров позволяет индукции очень воспроизводимые и очень стабильного долгосрочного потенцирования. Эта методика дает возможность для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, вовлеченных в стабильный роств синаптической силы в срезах гиппокампа. В нем также подчеркивается важность в условиях эксперимента в пробирке исследование нейрофизиологических явлений.

Introduction

В настоящее время существует ограниченное понимание того, каким сложным воспоминания хранятся и напомнил на нейронном уровне схемы. Тем не менее, объединяющей гипотеза памяти имеется помещение для хранения и общепринятым: воспоминания хранятся в виде изменений в силу синаптических связей между нейронами в центральной нервной системе. Само по себе исследование на синаптическую пластичность в значительной степени выиграли от двух открытий прорыв. (1) В семенных эксперимента Bliss и лома 1, с использованием интактных анестезированных кроликов, обнаружил, что доставка краткого высокочастотных (1 сек, 100 Гц) стимуляции проводящие пути гиппокампа вызванные длительным (несколько часов) увеличение связанных синаптических соединений. Это увлекательное явление было названо «Долгосрочное Потенцирования» или LTP Дугласом и Годдард в 1975 году 2. (2) Позже было установлено, что аналогичное явление может быть вызвано в срезах мозга (0,4 мм) искусственно поддерживается живыми в пробирке в пробирке путем предоставления одной или нескольких спазмов в пучок аксонов (так называемый Schaffer залогов) во время записи результирующего поля возбуждающих синапсов потенциал вызывали в пирамидальных нейронов из так называемого СА1. Механизмы индукции LTP в значительной степени были выявлены. В принципе, Ca 2 + приток через NMDA рецепторы активирует ферменты с двумя последствиями: фосфорилирования АМРА (что повышает их эффективность) и включение дополнительной АМРА рецепторов в постсинаптической мембраны 3. В отличие от этого, механизмы поддерживающей фазы LTP в значительной степени неизвестны, в частности, потому, что это экспериментально гораздо труднее поддерживать здоровую часть в течение многих часов, чем от 30 до 60 мин.

Многие исследования были посвящены пониманию LTP механизмов и интересных теорий были разработаны на протяжении многих лет 4-11. Но ООНсезам теперь, точные молекулярные механизмы, лежащие в основе стабильного увеличения синаптической силы не выяснены. Это может быть частично связано с трудностью воспроизвести предыдущие результаты в разных лабораториях с использованием различных методов для подготовки и поддержания срезов гиппокампа. В своей методологии бумаге, Sajikumar соавт. +12 Подчеркнул важность экспериментальных условий для подготовки срезах гиппокампа крыс и запись стабильной LTP. В этом видео мы представить все шаги оптимизации в нашей лаборатории на протяжении многих лет, чтобы иметь возможность записать очень стабильная LTP в срезах гиппокампа мыши.

Эта оптимизация была сделана из протоколов, разработанных и успешно используется другими лабораториями, которые изучают механизмы LTP 13 у мышей и крыс 11. Это позволяет опытным исследователям, чтобы вызвать и записывать очень длительный LTP у взрослых мышей с высоким уровнем успеха. Physiological основе наведенного БПЛ тщательно проверены и продемонстрированы 14. В этой методологии работе мы показываем, что любые изменения экспериментальных условий, таких как температура или оксигенации может оказать глубокое влияние на LTP, то во вскрытии процедура может основательно изменить ломтиками возбудимости. Следует также подчеркнуть, что тщательный контроль всех этих параметров требует подготовки нескольких месяцев для начинающих студентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные процедуры проводились в соответствии с Национальными Институтами Здоровья правил по уходу и использованию животных в научных исследованиях и по согласованию с местным комитетом по этике.

1. Подготовка искусственного спинномозговой жидкости

Тех же средствах используется препарировать, вырезать и заливать ломтиками (1 мл / мин) период покоя и электрофизиологических записей. Этот носитель состоит из 124 мм NaCl, KCl 4,4 мм, 26 мм NaHCO 3, 1 мМ Na 2 PO 4, 2,5 мМ CaCl 2, 1,3 мМ MgSO 4 и 10 мМ D-глюкозы.

  1. Оценить различные компоненты для 2 л ACSF кроме MgSO 4, который уже в растворе (1 м). Используя стандартный решение позволяет быть уверенным в точной концентрации Mg 2 +, потому что MgSO 4 в виде порошка обладает высокой гигроскопичностью. Ca 2 +: Mg 2 + отношение существенно влияет LTP индукции и поддержания14 и, следовательно, их пропорции Всегда должно соблюдаться.
  2. Поместите все компоненты, кроме CaCl 2 в стеклянный мерный цилиндр и доводят до 2 л дистиллированной H 2 O.
  3. Энергично перемешивают. Когда все растворится, добавляют карбогена через барботер аквариума и трубки, присоединенные к баку (95% O 2, 5% СО 2). Подождите несколько минут и добавляют хлорид кальция при рН фиксируется на 7,4 действием бикарбоната буфера.
  4. Держите 600 мл в охлажденном прямоугольной стеклянной посуде и охладить до 4 ° C со льдом вокруг блюда. Этот носитель будет использоваться для гиппокампа рассечение.
  5. Фильтр оставшиеся 1400 мл и держать в колбе Эрленмейера.

2. Подготовка электрофизиологические Rig и запись среза мозга палата

Перфузии цепь состоит из 2 перистальтические насосы, одной насосной свежей жидкости из бачка, а другой накачки использован жидкости из тОн записи камеры к мусорному ведру. Свежий текучую среду добавляют самодельные перфузии системы, где он повторно кислородом и нагревают до достижения камерой интерфейс записи под действием силы тяжести (рис. 1А). Интерфейс камеры записи была разработана ФСТ (Fine инструментов науки, Ванкувер, Канада, рис. 1Б). Срезы тканей помещают на тканой сетчатый фильтр прикреплен к съемному также кольцо и может быть непрерывно поддерживается в соответствии интерфейс условий путем регулировки высоты всасывания и иглы. Самодельный пластиковой трубки заблокирован на своем конце, и перфорированный сбоку (0,5 мм) крепится к всасывающей иглы увеличить уровень стабильности в камере. Печатающая головка установлена ​​на водяной бане содержащих камень газа дисперсии, которая помогает поддерживать влажной среде на прохождение влажного воздуха через порты отклонения в печатающей головке (для уменьшения формирования капли воды). Ванна и среднего температуру регулируют путем непрерывного изменения уровня постоянного тока йгрубая Силиконовый встроенных нагревательных элементов в ванну с водой. Термисторы в ванну воды и записи скважин позволяют камере температуре должна быть выставлена ​​и точно контролировать в этих местах.

Система отопления камере завершается глобальной системы отопления регулирования температуры всей установки. Программное обеспечение, разработанное исследователями из Университета Эдинбурга ( www.etcsystem.com ) контролирует и выравнивает температуру воздуха кислородом, среза мозга, электроды, а остальные установки обеспечивая стабильную среду для долговременной записи (рис. 1в) . Температура, используемая для мыши срезов гиппокампа составляет 28 ° C.

  1. Промыть все перфузии схема дистиллированной H 2 O в течение как минимум 20 мин и начинают отопительных систем.
  2. Запустите карбогена восходящей в цепи. Карбоген прибывает в самодельной перфузии труб, через FILTER свечи и в ванну с водой ниже записи камеры. Скорость потока в ванну с водой контролируется расходомером. Если скорость потока слишком медленно, ткань может стать гипоксического. И наоборот, если скорость потока слишком высока, газ не может быть достаточно нагретой и увлажненной приводит к высыханию ткани. Высокий расход газа также может увеличить вероятность распыления воды на ткани из водяной бани ниже, ведущей к осмотического шока. Это может быть предотвращено путем добавления битов нейлоновая сетка (100 мкм) на выходе из прогиб портов.
  3. Слейте хладагент и залейте ACSF фильтруется.
  4. Положите кольцо, которое будет поддерживать срез в удерживающую камеру. Тканые сетчатый фильтр с сеткой отверстий от 500 до 750 мкм растягивается и присоединенный к кольцу с двух частей клей эпоксидной смолы. Тканые сетчатый фильтр изготовлен из 87% полиамида и 13% эластана (трусов 15 ден). Клей должен быть нанесен тщательно, чтобы избежать образования рельефа на поверхности ринг.
  5. Тщательно удалить все пузырьки воздуха из контура.
  6. Отрегулируйте уровень ACSF в записи камеры с винтом всасывающей иглы. Скорость перистальтических насосов доводили до 1 мл / мин на входе в насос и до 5 мл / мин на выходе насоса.

Перфузии система размещена на жесткой виброустойчивого таблица, в окружении клетки Фарадея.

3. Подготовка рассечение Площадь

Хирургические инструменты: скальпель с лезвием № 11, небольшой стандартный рассечение ножницами, весна ножницы, изогнутые щипцы, два Heidemann шпатели и ложки.

Дополнительный материал: гильотина, подложки, в один чоппер McIlwain ткани с лезвием бритвы, фильтровальная бумага, стекло пипетки Пастера с резиновой соской, 2 пластиковых пипетки Пастера одна из которых с широким горлом, чашки Петри, металлический цилиндр диаметром 7 мм (рис. 2А).

    (рис. 2А).
  1. Выложите инструментов в порядке использования. Добавить тремя слоями фильтровальной бумаги на пластине ткани прерыватель и новое лезвие очищены с дистиллированной водой и эфиром (фиг. 2В). Лезвие должно быть горизонтальным, когда он касается бумаги. Лезвие силы доводят до половины максимального значения и скоростью приблизительно до одной трети максимального значения.
  2. Внимательно проверьте, все ли готово (инструментов, температура ...), потому что у вас не будет времени впоследствии.
  3. Попросите кого-нибудь, чтобы распылить вскрытия с помощью пипетки Пастера, заполненного холодной ACSF.
  4. Обезболить мышь Нембуталом IP (100 мг / кг) до декапитации. Галотан анестезии также могут быть использованы. Мы провели сравнение обоих методов и obtaIned же результаты. Обезглавливание должны быть выполнены под наркозом, но цервикальной дислокации также могут быть использованы. Однако смещения шейных позвонков нуждается в очень хорошей практикой, чтобы избежать страданий животных.
  5. Проанализируйте на подложки, как можно быстрее под холодной ACSF непрерывного душ.

4. Мозг Удаление

  1. Удерживая голову еще с указательным пальцем и большим пальцем одной руки на морде, сделать надрез с рассечение ножницами вдоль середины верхней части головы, начиная с края гильотины разреза и работает рострально к лобной кости .
  2. Избавьтесь от кожных мышц на каждой стороне головы для полного доступа к черепу пластины и снимите мышцы в хвостовой стороне головы.
  3. С рассечение ножницами, вырезать височной мышцы на каждой стороне, вдоль пластины височная, а затем вырезать фронтальной пластины в середине, поперечно. Затем сделать небольшой разрез на затылочной кости, между двумя PLАтеш.
  4. Для каждой стороны, нарезать на хвостовом основание затылочной пластин.
  5. Сокращение вдоль стреловидного шва с пружинными ножницами.
  6. Пинцетом, удалите половинки черепа, распространяя их подальше друг от друга.
  7. С лезвия отрежьте поперечно сразу после обонятельной луковицы и как раз перед мозжечком затем окунуться извлеченный мозг в рассекает блюдо с холодной ACSF.

5. Вскрытие гиппокампа

  1. Как только мозг погружен в рассекает блюдо, разорвать два полушария друг от друга с помощью скальпеля вставлен в середину.
  2. Рассечение гиппокампа осуществляется с шпатели под визуальным контролем через бинокулярный операционный микроскоп (X25, рис. 2А). На одном полушарии, осторожно раскрывайте структур, чтобы увидеть бокового желудочка. Удалить ствола мозга и промежуточного мозга. Это делается путем применения шпатели на лобную кору с одной стороны и на промежуточном мозге нас другой стороны. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к гиппокамп с шпатели и не растянуть его во срезов ткани.
  3. Sever свода затем слегка прижмите гиппокампа из коры (откатиться), вставив шпателем в желудочке.
  4. Когда гиппокампе извлекается, удалить излишки ткани коры и оставшиеся кровеносные сосуды.

6. Резка Ломтики

  1. С широким горлом пластиковой пипетки Пастера перенести гиппокампа в ложку с его Альвеар поверхностью вверх (выпуклой стороной).
  2. Удалите остатки жидкости стандартные пластиковые пипетки Пастера.
  3. Ручка для установки ложку вертикально почти касаются фильтровальной бумаги измельчителя (рис. 2В) и уходят гиппокампа от ложки, быстрым прикосновением к фильтровальной бумаге затем вернуться ложкой.
  4. Ориентируйтесь гиппокампе и нарезать его поперек 400 мкм с вертолета (см. рис 2С для ориентации hippocamгной по отношению к лезвию бритвы). Закон как можно быстрее.
  5. Снимите фильтр бумаги с нарезанным гиппокампе и оберните его вокруг металлического цилиндра распространяться ломтики немного. Затем свободный ломтики с брызгами ACSF с использованием стандартной пластиковой пипеткой Пастера и собирать их в чашку Петри с холодным ACSF.

7. Инкубации срезов в интерфейс

  1. Выберите ломтики со стандартной пластиковой пипетки Пастера и быстро разместить их в записи камеры. Ломтики оправиться от травмы вскрытия непосредственно в записи камеры, в интерфейсе при 28 ° C.
  2. Кусочек, скорее всего, раковиной. Нижний уровень жидкости, чтобы достичь уровня срезов, а затем поднять его, чтобы сделать его плавать.
  3. Включите ломтик в правильное положение при снижении уровня. Ломтики всегда ориентирована таким же образом, чтобы облегчить размещение электродов (2 стимулирующее и один электродов записи) в области СА1.
  4. Остановитесь, когдажидкость находится в интерфейсе. "Мениск" носителя вокруг среза свидетельствует о достаточном уровне средств массовой информации. Сетчатый фильтр должен быть насыщен СМИ, но не полностью погружены.
  5. Держите камеру покрыта фильтровальной бумаги, помещенной над перфорированной крышкой.
  6. Пусть кусочек в течение по крайней мере 1,5 часа при 28 ° C.

8. Запись синаптических ответов

  1. Записи электрода: стеклянные капилляры тянутся получить чаевые сопротивление 2-5 МОм при заполнении ACSF. Небольшой кусочек фильтровальной бумаги помещают вокруг кончика электрода и костный воск наносится на конце уменьшить конденсации. Стимулирование электродов: платина-иридий биполярного кластер электроды с 12,5 мкм в диаметре приобретены у КЛОХ (США). При надлежащем уходе, каждый электрод может быть использован по крайней мере в 30 раз (рис. 1В).
  2. Поместите электроды в radiatum слоя СА1, все электроды выстроилисьвверх (рис. 3А). Электроды снижена 75 до 150 мкм под поверхностью среза с микроманипуляторов Narishige. Два стимулирующие электроды расположены по стимулированию две различные пучки Шаффер залогов. Когда электроды опускаются на ломтик, фильтровальной бумаги и осторожно положил все вокруг, чтобы замкнуть прострел.
  3. Двухфазной стимуляции (0,08 мс Длительность импульса за полупериод) осуществляется при постоянном напряжении с травой стимулятор подключен к ССО-V изоляторы. Максимальный ответ проверяется путем увеличения интенсивности стимула от 2 В до максимального 12 EPSPs V. ОБЛАСТЬ усиливаются 1000 раз WPI ISO-80 усилитель и фильтруют при 10 Гц и 10 кГц. Далее сигнал передается к компьютеру через National Instrument / D конвертер. Стимуляция, сбор и анализ данных выполняются с помощью программы WinLTP ( www.winltp.com ). Поле ВПСП записываются на уровне 40% от максимальной амплитуды, полученные в котором вход-выходположить кривой. Для каждого среза, fEPSP склонах нормированы по отношению к средним уклоном более 30 мин предшествующих LTP индукции.
  4. LTP вызвано применением одного поезда стимуляции (100 Гц) при испытании на прочность один путь, а второй путь служит в качестве контроля.

9. Очистка установки

  1. Промыть все цепи с 3%-ным раствором перекиси водорода (H 2 O 2), по крайней мере, 10 мин, а затем высушить. Схема будет тщательно промывают дистиллированной водой перед началом любого эксперимента. Использование H 2 O 2 не является абсолютно необходимым, как другие лаборатории использовать только дистиллированную воду для очистки, но мы заметили, отложение темного остатков в системе трубопроводов при использовании только воду.
  2. Замена воды в водяной бане под записи камеры.
  3. Ванна стимулирующие электроды советы в спирте в течение 5 мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта методология была использована для анализа свойств длительный долгосрочный потенцирование индуцированных в острой срезов гиппокампа от взрослых мышей C57Bl/6J (JANVIER SAS, Франция) 14. Удивительно, улучшение условий эксперимента привело к новому взгляду на LTP. Мы показали, что длительное увеличение синаптической силы не требует синтеза новых белков.

Здесь мы показываем, что LTP индукции зависит от жизнеспособности ломтиками и возбудимость. При вскрытии гиппокампа был слишком медленно или слишком вредно, ломтики возбудимости увеличилось и полисинаптических ответов можно было наблюдать после индукции LTP (рис. 3В). В этом случае индукции LTP была гораздо менее эффективны и потенцирование не поддерживается.

Мы хотели бы подчеркнуть тот факт, что даже в ломтики практически здоровых, технические условия оказывают большое влияние на продолжительность LTP, индуцированной однократнымПоезд стимуляции. В предыдущих публикациях, наша группа показали, что кратковременное LTP может быть преобразована в длительную его, изменив условия восстановления среза 15. За годы повседневной практике мы обнаружили, что последовательные улучшения в нашей техники привели к прогрессивному увеличению продолжительности LTP, индуцированной однократным поезда в стандартных условиях. Действительно, записи, сделанные в 2005 году показал, кратковременные LTP возвращается к исходному уровню в течение 3 часов (рис. 3C, темные кружки). Изменения в рассечение тканей процедура снижения растяжения сделали возможным получение LTP поддерживается в течение 6 часов 16 (фиг.3С, закрашенные квадраты). И, наконец, улучшение оксигенации интерфейс и контроля температуры, в сочетании с электродом стандартизации привели к стабильным LTP более 8 ч (фиг.3С, белые кружки). Разница между этими тремя группами значительна (одно-Wай ANOVA, F (2,20) = 49,5, р <0,001).

Кроме того, любое изменение температуры или кислородом вызвало увеличение или уменьшение синаптического ответа (рис. 4). Контроль этих параметров была проверена с использованием только два стимулирующих электродов. LTP был индуцирован на один пучок Schaffer залогов, а другой комплект был использован в качестве внутреннего контроля синаптических стабильность прочность.

Рисунок 1
Рисунок 1. Электрофизиологические и установка среза мозга записи камеры. (A) перфузии схеме с самодельной системой тяжести перфузии получающий алименты по суду помощью перистальтического насоса, обособленные подразделения стимуляции (два на каждый электрод), операционный микроскоп и записи камеры. (B) Интерфейс записи камеры со стимулированием ирегистрирующих электродов. Фильтровальная бумага были удалены из крышки, чтобы увидеть кольцо поддержки среза. (С) управления с 2 стимуляторы, осциллограф, А / Ц преобразователя, программное обеспечение контроля температуры и WinLTP программного обеспечения.

Рисунок 2
Рисунок 2. Инструменты и материалы, используемые для нарезки гиппокампе. (A) Вскрытие блюда, содержащие охлажденный ACSF и операционного микроскопа. Скальпель с установленным на нем # 11 лезвий, небольших стандартных рассечение ножницами, весна ножницы, изогнутые щипцы, два Heidemann шпатели, ложка, 2 пластиковых пипетки Пастера одна из которых с широким горлом, чашку Петри, металлический цилиндр из 7 мм в диаметре и кольцо, которое поддерживает фрагмент в записи камеры. (B) McIlwain ткани вертолета. (C) Рисование и фотография OF левого гиппокампа в положении для резки. Ориентацию лезвие обозначен красной пунктирной линией. Масштаб сетки: 1 мм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. Индукции LTP в срезах гиппокампа. (A) эскизе двух независимых синаптических входов S1 и S2 с тем же популяции нейронов. В каждый кусочек, два стимулирующих электродов (S1 и S2) были введены в действие. S1 путь был использован для индукции LTP, а S2 путь действовал в качестве контроля. (B) Пример fEPSP следы от отдельных экспериментов в совершенно здоровыми ломтик (слева) и в срезе представляет высокий уровень возбудимости (справа). Они были записаны только БЭФ руды индукции LTP (красный след) и один час после индукции LTP (синие следы). Когда ломтики не совершенно здоровыми (справа) полисинаптической ответов наблюдаются и fEPSP потенцирование наклона уменьшается. (C) сравнение времени курсы наклона fEPSP после LTP, индуцированной однократным поезд высокочастотной стимуляции (100 Гц, 1 сек), записанные в 2005, 2010 и 2011 в нашей лаборатории. Первые эксперименты были записаны в 2005 году (темные кружки, N = 11). Последующие записи (Вилер, и др.. 2010) воспользовались усовершенствованная процедура вскрытия (темные квадраты, N = 6). Текущие результаты возникают от оптимизации интерфейса оксигенации и контроля температуры вместе с электродом стандартизации (кружки, N = 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Изменение fEPSP наклона в зависимости от температуры и скорости потока кислорода. (A) Увеличение расхода кислорода на водяной бане под записи камеры от 0,15 до 0,25 л / мин (синяя кривая) индуцирует снижение fEPSP наклона 20% (розовый кривая). (B) Повышение температуры от 28 до 29 ° C (зеленая кривая) индуцирует более чем 50%-ное увеличение fEPSP склона (розовая кривая). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали в нашей лаборатории протокола в результате комбинации методов, разработанных и используемых другими лабораториях, имеющих большой опыт в записи LTP 11,17. Этот протокол адаптирован к гиппокампе взрослых мышей и могут быть использованы на животных любого возраста и фона генотипа. Он также позволяет проводить анализ LTP у трансгенных мышей развивающихся нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера 18,19.

Использование этого протокола для срезах гиппокампа крысы могут повлечь за некоторыми изменениями. Например, большинство исследований, проведенных на крысах использовать температуре 32 ° С вместо 28 ° С. Mathis соавт. 20 был предложен другой способ получения срезов гиппокампа от старых мышей или крыс.

Материал и методы

Мышам C57BL/6J исходить от JANVIER SAS (Франция), но те же результаты получены с мышами линии C57BL/6J от Чарл ES реки Франции.

Гиппокамп быстро изолированы то время как ткань погружать в холодную ACSF уменьшить повреждение клеток. Это обеспечивает снижение токсичности, но, как известно, индуцируют пролиферацию 21,22 синапсов, которые могут маскировать дальнейших структурных синаптической пластичности.

Затем мы используем ткани измельчитель для нарезки вместо Vibratome. Измельчитель тканей особенно хорошо адаптированы к срезов из маленьких кусочков ткани, как мыши гиппокампа. На ткани измельчитель, гиппокамп всегда сориентирована таким же образом, в соответствии с процедурой Алджера соавт. 23. Они поместили борозды на поверхности Альвеар, видимый с косой освещение, параллельно лезвием бритвы. Этот метод обеспечивает срезах гиппокампа дорсального вырезанной части с углом 15 ° от поперечной оси (см. фиг.2С). Затем ломтики манипулируют с минимумом прямого контакта.

ove_content "> Ломтики ведутся в интерфейсе при 28 ° С непосредственно после вскрытия. Этот метод приводит к снижению активности и полисинаптических epileptogenicity у мышей и крыс 24 ломтиков.

Внешние параметры тщательно контролировать, чтобы получить воспроизводимые результаты. Биполярное кластера стимулирующих электродов (FTC) используются вместо самодельных электродов с целью повышения воспроизводимости в индукционных, видя, что амплитуда индукции LTP действительно зависит от качества электродов.

Системы и т.д. из Университета Эдинбурга 11 поддерживает постоянную и равномерную температуру внутри всей экспериментальной установки и карбогена потребление стабилизируется с расходомера. Интерфейс уровня контролируется визуально с помощью бинокулярного операционного микроскопа и поддерживается очень стабильная с использованием перистальтического насоса аспирационная система.

Результаты

Этот протокол всепотоков индукции LTP очень стабильным который по-прежнему зависит от внешних условий, таких как температура и оксигенации. Ранее нами было показано, что LTP индуцированные в этих условиях зависела от NMDA-рецепторов, α-CaMKII автофосфорилирования и PI3-киназы, которые являются классической молекулярной путей, участвующих в LTP 14. С другой стороны, мы были не в состоянии воспроизвести зависимость поддерживающей фазы LTP на новый синтез белка. Способность белка ингибиторов синтеза и анизомицина в частности, для предотвращения развития поздней фазы L-LTP, когда они были применены вокруг индукционной неоднократно сообщалось 4,25. Это привело к широко распространенному предположению, что стабилизация синаптической пластичности более чем на 2-3 часа требуется запуск по LTP-индуктивный стимул переходный синтез новых белков 26. Тем не менее, недавние эксперименты показали, что вещи были более сложные 27 -32. LTP индуцированных в условиях эксперимента поддерживали даже в присутствии ингибиторов синтеза белка предполагая, что другие механизмы, чем новый синтез белков могут быть вовлечены в длительный этап LTP.

Тем не менее, в пробирке эксперименты всегда ставит вопрос о физиологическое значение наблюдаемого явления. Нарезка вызывает изменений в фосфорилирования белков, участвующих в зависимым от активности форм синаптической пластичности 33 и изменение метаболического состояния ткани 34. Скорость синтеза белка уменьшается от 10 до 15%, что наблюдается в естественных условиях 35 и баланс между мРНК и белка нарушается 36. По всем этим причинам, мы должны быть осторожными в интерпретации результатов.

По определению LTP является быстро индуцированных длительным (дни, недели) повышение возбуждающих синапсов, которые, вероятно,играет важную роль в долговременной памяти. LTP, в естественных условиях, может длиться в течение нескольких недель, и подобные изменения в синаптической силы происходят во время обучения 37,38. Кроме того, большую часть времени, когда долгосрочные LTP предотвращается мутации, долговременной памяти ухудшается 39.

Более проблематичным является параллель между кратковременной памятью и кратковременные долгосрочного потенцирования. Первая проблема заключается в том, что продолжительность каждого явления неизвестна. Кратковременная память изучалась 1 часа до 1 дня после процедуры обучения в то время как краткосрочные LTP предположительно продлится менее 5 часов. Второй вопрос заключается в том кратковременной памяти (или кратковременное LTP) является всего лишь шаг вперед долговременной памяти (или длительный LTP) или отдельного лица с различными молекулярными механизмами 40. В-третьих, мы не знаем, если краткосрочные LTP индуцируется слабым стимулом, который отстает от вызывающих длительные LTP или если оно порождается и тот же стимул, ноppears только тогда, когда механизмы, лежащие в основе длительных LTP неудачу.

Долгосрочной стабильности ДП в условиях нашего эксперимента можно рассматривать как краткосрочные LTP эквивалентно кратковременной памяти длительностью от 10 ч и 24 ч.. В этой форме синаптической пластичности, синтез белка, который высоко уменьшена ломтиками, не требуется и LTP может быть вызвано одной поезд стимуляции. Это длительное увеличение синаптической силы может быть связано с стабильное увеличение числа рецепторов АМРА в пост-синаптических мембран без позвоночника ремоделирования.

Согласно этой гипотезе, синтез белка может быть необходимо для расширения позвоночника и структурные модификации синапсов приводит к долговременной памяти продолжительностью в несколько недель. В этом случае декрементные фазы LTP может наблюдаться только через 24 часа после индукции. К сожалению, до сих пор, острые кусочки не может быть достигнут только живыми в течение примерно 16 часов.

и др.. 41 показали, что у этих мышей, краткосрочные LTP в естественных условиях и кратковременной памяти обесценились в то время как долгосрочные синаптической пластичности и памяти сохраняются.

Расхождение между различными исследований, проведенных в различных лабораторий может быть связано с продолжительностью кратковременное LTP вследствие изменения ферментативной активности, в метаболическое состояние ломтиками или в скорости деградации белка 42. Синтез белка можно рассматривать как разрешительный процесс пополнения участием репозиция ферменты, которые были использованы в процессе обучения или других составных элементов элемента 43.

Эти результаты указывают на важность экспериментальных условий на устойчивость LTP. Стабильное независимое LTP синтеза белка может помочь изучение роли длительный пост-traducной модификации синаптических белков и механизмы, лежащие стабильное увеличение количества АМРА рецепторов в постсинаптической мембраны, несмотря на оборот рецепторов.

Это видео показывает один подробный протокол, который должен надеяться, поможет получить воспроизводимые результаты в разных лабораториях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Бернард Foucart за техническую помощь. Эта работа выполнена при поддержке бельгийского фонда научных исследований (FRS-FNRS) и Фондом королевы Елизаветы для медицинских исследований. Аньес Вилле является научным сотрудником Бельгийского фонда по научным исследованиям.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Neuroscience выпуск 76 нейробиологии анатомии физиологии биомедицинской инженерии хирургии расстройства памяти обучения памяти нейронаук нейрофизиологии гиппокамп долгосрочное потенцирование мыши острые кусочки синаптической пластичности, Электрофизиологии животной модели
Улучшенная Подготовка и консервация срезов гиппокампа мышь для очень стабильный и воспроизводимый Запись Долгосрочные Потенцирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter