Summary
在最近几年使用几种不同类型的成体干细胞，生殖细胞的体外培养方法中使用的形成已被证明。本文将直观地呈现新生小鼠干细胞分化的早期卵母细胞样细胞。
Abstract
生殖细胞的形成和分化研究历来非常困难的，因为低的细胞的数量和它们的位置深在胚胎发育。一个“封闭” 在体外系统的可用性可能证明是无价的，我们理解配子。形成的卵母细胞样细胞（OLCS）从成体干细胞，分离新生小鼠的皮肤，已被证明可以可视化在这个视频协议。由此产生的运行限值表达与卵母细胞，如Oct4的，瓦萨，BMP15和SCP3一致的各种标记。然而，他们依然无法接受由于未能完成减数分裂成熟或施肥。此协议将提供一个系统，是用于研究早期形成和分化成更加成熟的配子生殖细胞。在早期分化表达Oct4的（潜在的生殖细胞样细胞）的数量达到〜5％，但是目前的f万传彪，乔秀云，孔惠运行限值和条件仍然相对低效的。该协议是相对简单的，但应特别注意采取措施，确保起始细胞群体是健康和早日通过。
Introduction
在早期胚胎发育，配子发生，通过一系列的阶段，包括原始生殖细胞（PGC）的形成，迁移，并最终定植生殖腺嵴。在这段时间内，原始生殖细胞进行增殖和分化到越来越成熟配子1。从尿囊胚胎肠的基础，并最终最终殖民性腺脊沿背墙，原始生殖细胞迁移的事实使得他们极其困难的研究2。尽管在该领域的进步，试图了解胆囊癌的形成和分化的研究已阻碍了其有限的数量，位置，和迁徙的性质3,4。
在最近几年，胚胎干细胞已被证明有可能形成生殖细胞在体外 5,6。同样地，一些成体干细胞也被证明有可能形成生殖细胞FOLL由于在体外培养7-11。最近分离到新生小鼠皮肤干细胞体外分化成生殖细胞和早期阶段的卵母细胞12。在分化过程中的干细胞表达Oct4的子集增加，形成类似卵丘 - 卵母细胞复合物的结构。卵母细胞样细胞（运行限值）可以捡到的文化和自然的卵母细胞相比。使用这种文化运行限值和测量方法40-45微米获得卵母细胞，如Gdf9b，瓦萨，DAZL表示了类似的标记。至目前为止，运行限值和条件仍然不能成熟或受精12。
虽然运行限值和条件仍无法运作，用于形成这些运行限值和条件的协议仍可能有实用作为检测研究早期生殖细胞的形成和发展，内封闭在体外系统。所以原来的出版物讨论形成的OLC马蒂奇利用干细胞作为干细胞来源8胎猪皮肤。扩大这项研究PGC-早期形成的细胞诱导分化过程中被证明是如OCT4运行限值和条件和快递等PGC标记的前体，VASA，STELLA，C-KIT，DAZL 13。此数据支持的潜在利用此系统来研究生殖细胞的形成和分化的影响 。从新生小鼠皮肤形成的OLC使用的协议将被证明在这个视频文章。该协议提供了一个体外模型来研究生殖细胞的发育，可能提供了一种手段，阐明其增殖和分化的重要因素。
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Protocol
1。媒体准备
- 使用和实验将会发生的细胞培养孵化器松开帽提前准备媒体2-3小时。在本协议中使用的媒体：
- 准备由DMEM/F12辅以1个B27，40 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和20 ng / ml的EGF干细胞培养基。
- 准备生殖细胞分化培养基由M199辅以0.05 IU FSH，LH 0.03 IU，3毫克/毫升BSA，10微升/毫升，0.23 mM的丙酮酸钠，1毫克/毫升胎球蛋白，和1 ng / ml的EGF。一个基本介质，包括所有添加剂，但省略FSH，LH和EGF可以准备并保存在4℃下长达一个星期。
2。干细胞培养制备
- 分离干细胞从新生小鼠幼崽如前所述12。利用干细胞在体外生殖细胞分化2-4代。的效率OLC形成直接相关的起始干细胞的质量。这是最好的，只要人口清洁和健康的出现通常是在2代左右开始分化。进一步培养干细胞产生负面影响过去的第2代的OLC形成效率（结果未显示）。
- 48小时前开始分化干细胞亚文化。除去悬浮的球形细胞聚集和失效的介质从培养皿中，用血清吸管，在15毫升管。重要的是要只收集悬浮细胞球形聚集体，而不是附着在盘子的底部，都自发地分化细胞。
- 颗粒的细胞以500×g，5分钟，弃上清，重悬在500μl的新鲜干细胞介质加热到37℃。轻轻吸取部分游离于细胞聚集。不要积极吸取细胞作为这会降低细胞活力。清洗部分分离的细胞为9.5毫升新鲜预热干细胞培养基上低附着10厘米的细胞培养皿。
- 返回的细胞在37℃，5％CO 2细胞培养箱内培养48小时，在开始分化之前。
3。 OLC分化
- 使用血清吸管从培养皿中并置于15毫升管中取出干细胞，留下任何贴壁细胞。颗粒细胞在500 XG重悬在500微升无菌PBS。蓬勃吸管细胞使用宽孔1000微升尖不大于10-20细胞成团块。定期除去少量的细胞，在离解过程中，一个白色的光显微镜下检查，以确认凝集的细胞是在10-20个别细胞团块。功能分离，会导致细胞活力下降。
- 添加9.5毫升PBS分离的细胞，并添加1此细胞悬浮液5μl的血球细胞计数。沉淀细胞以500×g，5分钟。
- 1.32X10 6细胞/ ml在分化培养基中的浓度为重悬细胞。
- 板的细胞加入500微升，每到一个平底24孔悬挂菜。
- 在5％CO 2的24孔板中，细胞培养孵化成在37℃下放置48小时。取出250微升培养基从各孔中的相应标记的1.5毫升管中。 ，每孔加入250μl新鲜分化培养基。离心使用了介质，在500×g离心5分钟。弃上清。在50μl新鲜的分化培养基中重悬细胞沉淀，并返回到相应的培养和分化板。
- 每48小时改变介质的一半长达12天的分化。
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Representative Results
最初的细胞附着到培养皿的底部，并传播出去。在42-72小时进入分化的微小悬浮OCT4阳性细胞形成和增殖（ 图1A）。多数会消失的可视化后不久，这些细胞和贴壁细胞会形成致密的殖民地文化底部聚集。经过几天的，这些聚集体分离从培养表面。在这些聚集体中，可以观察到一个大的细胞（ 图1b和1c）。在初始的可视化的细胞将〜35微米的直径。随着持续的文化运行限值和条件将增长达到〜45微米直径。这些是运行限值和条件，并可以收集与支持细胞，或胰蛋白酶处理以获得没有附加其他细胞（ 图1d）的运行限值和条件。
为了确认运行限值和条件作为天然卵母细胞表达类似的转录运行限值和条件可以收集和测试表达ZPC SCP3，CMOS，OCT4，BMP15，和瓦萨这种标记。虽然未分化的干细胞中表达Oct4和瓦萨BMP15和ZPC几个标记，如特定的卵母细胞。 BMP15是TGF-β家族的成员，并涉及在卵母细胞和卵泡发育。特定的卵母细胞的透明带的膜结构是由几种蛋白质，包括ZP3。这些卵母细胞特异性标志物的表达可以被用来确认运行限值和条件的存在下，在分化。此外，Scp3基因编码和CMOS如减数分裂特异性标志物的表达可以识别潜在的减数分裂细胞内的培养体系。在该示例中提供了10运行限值和条件，并收集10个卵母细胞，并直接进行cDNA的合成（ 图2）。使用半定量PCR，然后将所得的样品测试。这些标志物的表达比较自然小鼠卵母细胞，我们看到在转录水平的差异（ 图2）。卵母细胞所表达的许多标记，将由运行限值和条件，如果是成功的分化。
图1。皮肤干细胞诱导分化过程中的常见形态。早期分化阳性细胞的OCT4（绿色）a）于可检测培养。核心的计数器，用Hoechst染色（蓝色），b）作为分化的进展与OCT4（绿色）包围由OCT4负细胞的阳性细胞，一些细胞聚集体可以看出。还示出用Hoechst核染色（蓝色）。c）在白色光图像的滤泡样结构后，从培养物表面脱离，D），在比较可以看出erentiation大OCT4阳性卵母细胞样细胞（绿色），内部培养细胞或单独或包围。比例尺为：a = 20微米，B = 100微米，C = 40微米，D = 10微米。
图2。转录水平运行限值相比，卵母细胞，常见的卵母细胞标记代表的实时荧光定量PCR结果显示常见的卵母细胞标记运行限值的转录水平。这种比较是从10个卵母细胞样细胞相比，10个新生小鼠卵母细胞。
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Discussion
迄今为止，功能运行限值和条件没有被开发使用一种完全的在体外测定。最近的一项研究由Hayashi 等。是能够产生后代从PGC细胞样细胞形成的体外和在体内进一步发展14传送。与ES细胞或诱导性多能干细胞，他们能够形成PGC类似细胞，当在体内移植后恢复开始成熟，受精，并用来产生后代14。这表明，从各种来源的干细胞有可能正确的条件下，形成功能性的卵母细胞。
培养系统的某些方面是它的功能的关键。利用分离的干细胞的小鼠的应变是非常重要的。此协议的开发和使用与B6小鼠从杰克逊实验室（股票＃008214）。这些老鼠进行Oct4的绿色荧光蛋白转基因允许对ualization通过EGFP蛋白的表达Oct4的细胞。当协议CD1小鼠尝试使用干细胞的效率要低得多，OLC形成是不可靠的。目前OLC形成的效率仍然很低，即使使用B6小鼠。生殖细胞形成的效率低得多，使用时以后的传代细胞，利用干细胞应在启动生殖细胞分化前通过2-4。各种试剂的来源也已被证明是重要的。
优化培养系统运行限值和条件的各种mRNA转录分析可能被证明是有用的。采用半定量PCR允许运行限值和卵母细胞（ 图2）之间的几个标记物的表达水平的比较。结果表明，运行限值和条件表达ZPC卵母细胞，这也许可以解释的脆弱性和更薄的透明带膜的运行限值的。减数分裂标记的表达
这里描述的协议提供了一种体外控制的方法来研究生殖细胞的形成和分化。目前，PGC-细胞产生无法保持在体外形成功能的运行限值时。当连同新生儿卵巢体细胞，并在体内移植的PGC细胞样细胞能够形成早期次级卵泡。然而，恢复运行限值和条件时，他们仍然不能可靠成熟和受精12。在这个实验中，来自本实用研究来自成体干细胞的生殖细胞减数分裂前。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
pwd是支持由加拿大研究院（CIHR）健康研究奖学金和CIHR资助在西方大学的杰拉尔德·基德。笔者也想承认巨浪李圭尔夫大学的帮助，在这里提出的协议的发展。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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