Summary
En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.
Abstract
El estudio de la formación de células germinales y diferenciación ha sido tradicionalmente muy difícil debido a los números bajos de células y su ubicación en lo profundo de embriones en desarrollo. La disponibilidad de un "cerrado" en el sistema basado en vitro podría resultar muy valiosa para nuestra comprensión de la gametogénesis. La formación de células similares a los ovocitos (OLC) a partir de células madre somáticas, aislados de la piel del ratón recién nacido, se ha demostrado y se puede visualizar en este protocolo video. Los OLC resultantes expresan diversos marcadores consistentes con ovocitos tales como Oct4, Vasa, Bmp15, y SCP3. Sin embargo, siguen siendo no pueden someterse a la maduración o la fertilización debido a un fallo para completar la meiosis. Este protocolo proporcionará un sistema que es útil para el estudio de la formación de fase temprana y la diferenciación de las células germinales en gametos más maduros. Durante la diferenciación temprana el número de células que expresan Oct4 (potenciales células de gérmenes similares) alcanza ~ 5%, sin embargo actualmente la formación de OLC sigue siendo relativamente ineficiente. El protocolo es relativamente sencillo, aunque se debe tener especial cuidado para asegurar la población de células de partida es saludable y en un paso temprano.
Introduction
Durante la embriogénesis temprana, la gametogénesis se produce a través de una serie de etapas, incluyendo células germinales primordiales (PGC) de formación, la migración, y, finalmente, la colonización de las crestas gonadales. Durante este tiempo las CGP se someten a la proliferación y diferenciación en cada vez más gametos maduros 1. El hecho de que las CGP migran desde la base de la alantoides en el intestino posterior del embrión y, finalmente, a lo largo de la pared dorsal eventualmente colonizar las crestas gonadales los hace extremadamente difícil de estudiar 2. A pesar de los avances en el campo, los estudios que intentan comprender la formación de PGC y la diferenciación han sido impedidos por su limitado número, la ubicación y naturaleza migratoria 3,4.
En los últimos años las células madre embrionarias se han demostrado tener el potencial para formar células germinales in vitro 5,6. Del mismo modo, varias células madre somáticas también se han demostrado tener el potencial para formar células germinales Folldebido en cultivo in vitro 7-11. Recientemente las células madre aisladas de la piel de ratones recién nacidos fueron diferenciadas in vitro en células germinales como y ovocitos en fase inicial 12. Durante la diferenciación del subconjunto de las células madre que expresan Oct4 aumentó y se formaron estructuras similares a los complejos cumulus-ovocito. Las células similares a los ovocitos (OLC) se pueden recoger a partir de las culturas y comparación con los ovocitos naturales. El uso de este método de cultivo OLC miden 40-45 micras se obtienen que expresan marcadores similares a los ovocitos como Gdf9b, VASA y DAZL. Hasta la fecha los OLC resultantes siguen siendo incapaces de madurar o ser fecundado 12.
Aunque los OLC siguen siendo incapaz de funcionar el protocolo utilizado para formar estos OLC aún puede tener utilidad como un ensayo para estudiar la formación y el desarrollo de las células germinales en estadio anteriores dentro de un cerrado sistema in vitro. La publicación original discutir la formación de la OLC de locélulas madre matic utilizan piel porcina fetal como fuente de células madre 8. Ampliando este estudio las células PGC-como formados temprano durante la diferenciación inducida mostraron ser los precursores de la expresos tales marcadores PGC OLC y como OCT4, VASA, STELLA, C-KIT y DAZL 13. Este dato apoya el potencial de la utilización de este sistema para estudiar la formación de células germinales y diferenciación in vitro. El protocolo utilizado para formar OLC de piel de ratón recién nacido se demuestra en este artículo de vídeo. Este protocolo ofrece un modelo in vitro para estudiar el desarrollo de células germinales que puede proporcionar un medio para elucidar los factores importantes para su proliferación y diferenciación.
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Protocol
1. Medios Preparación
- Preparar los medios de comunicación 2-3 horas antes de su uso y el lugar con una tapa suelta en el cultivo celular incubadora donde el experimento se llevará a cabo. Los medios utilizados en el presente Protocolo:
- Preparar detener medio celular que consiste en DMEM/F12 suplementado con 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, y 20 ng / ml de EGF.
- Preparar germen de medio de diferenciación celular que consiste en M199 suplementado con 0,05 UI de FSH, 0,03 UI de LH, 3 mg / ml de BSA, 5 l / ml de STI, 0,23 mM de piruvato sódico, 1 mg / ml de fetuina, y 1 ng / ml de EGF. Un medio de base que consiste de todos los aditivos pero omitiendo la FSH, LH y EGF se puede preparar y se almacenó a 4 ° C durante hasta una semana.
2. Stem Cell Culture Preparación
- Aislar las células madre de crías de ratón recién nacido a lo descrito previamente 12. Utilizar las células madre en el paso 2-4 para la diferenciación in vitro de células germinales. La eficiencia de losFormación OLC está directamente relacionada con la calidad de las células madre de partida. Es mejor para iniciar la diferenciación tan pronto como la población parece limpio y saludable que es generalmente a alrededor de pasaje 2. Además el cultivo de la células madre pasado paso 2 afecta negativamente a la eficiencia de formación de OLC (resultados no publicados).
- 48 horas antes de iniciar la diferenciación de sub-cultivo de las células madre. Retire todos los agregados de células esféricas suspendidas y medios gastados de la placa de cultivo, utilizando una pipeta serológica, y colóquelos en un tubo de 15 ml. Es importante sólo para recoger los agregados esféricos suspendidos de las células y las células no unidas a la parte inferior del plato que se están diferenciando de forma espontánea.
- Sedimentar las células a 500 xg durante 5 min., Descartar el sobrenadante y resuspender en 500 l de medio de células madre recién calentado a 37 ° C. Pipetear suavemente los agregados de disociar en parte las células. No pipetear enérgicamente la células ya que esto reducirá la viabilidad celular. Lavar las células parcialmente disociadas en 9,5 ml de medio de células madre fresca precalentada en un archivo adjunto de 10 cm placa de cultivo celular bajo.
- Volver a las células a un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo celular durante 48 horas antes de la iniciación de la diferenciación.
3. Diferenciación OLC
- Con una pipeta serológica eliminar las células madre de la placa de cultivo y colocar en un tubo de 15 ml, dejar atrás las células unidas. Sedimentar las células a 500 xg y resuspender en 500 l de PBS estéril. Pipeta vigoroso de las células utilizando una amplia llevaban 1.000 l punta en grupos no mayores de 10 a 20 células. Periódicamente extraer una pequeña cantidad de células, durante la disociación, y comprobar bajo un microscopio de luz blanca para confirmar células agregadas son en grupos de 10-20 células individuales. En la disociación se reduce la viabilidad celular.
- Añadir 9,5 ml de PBS a las células disociadas y agregue 15 l de esta suspensión celular a un hemocitómetro para el recuento celular. Sedimentar las células a 500 xg durante 5 min.
- Vuelva a suspender las células a una concentración de 1.32X10 6 células / ml en medio de diferenciación.
- Placa de las células mediante la adición de 500 l por pocillo en un fondo plano de 24 pocillos plato suspensión.
- Coloque el plato bien 24 en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 48 horas. Retire 250 l de medio de cada pocillo y colocar en un tubo de 1,5 ml debidamente etiquetado. Añadir 250 l diferenciación medio fresco a cada pocillo. Centrifugar el medio gastado a 500 xg durante 5 min. y desechar el sobrenadante. Resuspender las células sedimentadas en medio de 50 l diferenciación fresca y volver a la cultura pocillo correspondiente en la placa de diferenciación.
- Cada 48 horas cambia la mitad de la media hasta el día 12 de diferenciación.
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Representative Results
Inicialmente, las células se adhieren a la placa de fondo la cultura y se extienden. En 42-72 h en la diferenciación de células positivas Oct4 pequeñas suspendidas forman y proliferan (Figura 1A). Poco después de la visualización de estas células la mayoría desaparecerá y las células unidas se formará agregados de colonias densas en la parte inferior cultura. Después de unos pocos días estos agregados se separe de la superficie de cultivo. En algunos de estos agregados se puede observar una célula grande (Figura 1b y 1c). Tras la visualización inicial de las células serán ~ 35 m de diámetro. Con el cultivo continuo de los OLC crecerán para llegar ~ 45 micras de diámetro. Estos son los OLC y se pueden recoger con células de apoyo o con tripsina para obtener OLC sin otras células unidas (Figura 1d).
Con el fin de confirmar que los OLC expresan transcripciones similares a los ovocitos naturales OLC se pueden recoger y probados para laexpresión de marcadores como la ZPC, SCP3, CMOS, Oct4, Bmp15 y Vasa. Mientras que Oct4 y Vasa se expresan en las células madre no diferenciadas varios marcadores tales como Bmp15 y ZPC son ovocito específica. BMP15 es un miembro de la familia de TGF-β y está implicado en los ovocitos y el desarrollo folicular. La estructura de la membrana de ovocitos específica zona pelúcida se compone de varias proteínas incluyendo ZP3. La expresión de estos marcadores específicos de ovocitos se puede utilizar para confirmar la presencia de OLC en las diferenciaciones. Por otra parte, la expresión de marcadores específicos como meióticas SCP3 y CMOS puede identificar células potencialmente meióticas en el sistema de cultivo. En el ejemplo proporcionado 10 OLC y se recogieron 10 ovocitos y la síntesis de cDNA directas realizadas (Figura 2). Las muestras resultantes se ensayaron a continuación mediante PCR semi-cuantitativa. La comparación de la expresión de estos marcadores a los ovocitos de ratón naturales que vemoslas diferencias en los niveles de transcripciones (Figura 2). Muchos marcadores expresados por los ovocitos serán expresadas por OLC si la diferenciación se ha realizado correctamente.
Figura 1. Morfologías comunes durante la diferenciación inducida de células madre derivadas de la piel. a) Durante las primeras etapas de diferenciación de las células positivas para Oct4 (verde) se puede detectar en la cultura. Núcleos contador se tiñeron con Hoechst (azul). B) Como diferenciación avanza algunos agregados de células se verán con Oct4 (verde) células positivas rodeadas por Oct4 células negativas. Tinción nuclear con Hoechst también se muestra (azul). C) Una imagen de la luz blanca de una estructura del folículo como seguir desprendimiento de la superficie de cultivo. D) Durante differentiation grandes células ovocito-como Oct4 positivos (verde) se pueden ver ya sea rodeado por las células o por separado dentro de la cultura. Las barras de escala: a = 20 m, b = 100 m, c = 40 m, d = 10 m.
Figura 2. Nivel de transcripción en el OLC, en comparación con los ovocitos, ovocitos de marcadores comunes. Representante resultados de la PCR en tiempo reales que muestran el nivel de transcripción de marcadores ovocitos comunes en OLC. Esta comparación es resultante de 10 células ovocito como se comparan a 10 ovocitos de ratón recién nacido.
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Discussion
Hasta la fecha OLC funcionales no se han desarrollado completamente utilizando un ensayo in vitro. Recientemente, un estudio realizado por Hayashi et al. Fue capaz de producir descendencia de PGC-como las células formadas in vitro e in vivo transferido para el desarrollo adicional 14. A partir de células madre embrionarias o de células pluripotentes inducidas que fueron capaces de formar PGC como las células que, cuando se recuperaron después de trasplante in vivo pudieron ser madurado, fertilizado, y se utiliza para generar descendencia 14. Esto demuestra que las células madre procedentes de diversas fuentes tienen el potencial, en las condiciones correctas, para formar ovocitos funcionales.
Ciertos aspectos del sistema de cultivo son fundamentales para que funcione. La cepa de ratones utilizados para aislar las células madre es muy importante. Este protocolo fue desarrollado y utilizado con ratones B6 del Laboratorio Jackson (Stock # 008214). Estos ratones llevan un transgén Oct4-EGFP permitiendo visualization de células que expresan Oct4 a través de la proteína EGFP. Cuando el protocolo se intentó utilizando células madre de ratones CD1 de la eficiencia es mucho menor y la formación OLC era menos fiable. Actualmente, la eficacia de la formación OLC sigue siendo baja incluso cuando se utilizan ratones B6. Las células madre utilizadas deben ser en el paso 2-4 antes de iniciar la diferenciación de células germinales como la eficiencia de la formación de células germinales es mucho menor cuando se utilizan células de pasaje posterior. La fuente de diversos reactivos también ha demostrado ser importante.
El análisis de los diversos transcritos de ARNm en las OLC puede resultar útil en la optimización del sistema de cultivo. Usando PCR semi-cuantitativa permite la comparación de varios niveles de expresión de marcadores entre OLC y de los ovocitos (Figura 2). Los resultados muestran que los OLC expresan menos ZPC de ovocitos, lo que puede explicar la naturaleza frágil y delgada membrana zona pelúcida del OLC. La expresión del marcador de la meiosis
El protocolo descrito aquí proporciona un método controlado in vitro para estudiar la formación de células germinales y diferenciación. Actualmente las células PGC-como generados son incapaces de formar OLC funcionales cuando se mantiene in vitro. Cuando agregarse con células somáticas de ovario recién nacidos y se trasplanta in vivo las células PGC-como son capaces de formar folículos secundarios en etapa temprana. Sin embargo, cuando se recuperan los OLC que aún no pueden ser madurados y fecundados 12 fiable. La utilidad de este ensayo proviene del estudio de las células germinales de pre-meióticas derivadas de células madre somáticas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
PWD es apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de becas (CIHR) y una subvención CIHR a Gerald M. Kidder en la Universidad de Western. El autor también desea agradecer Julang Li de la Universidad de Guelph en busca de ayuda con el desarrollo del protocolo que aquí se presenta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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